Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאימות ויוו של טיפול מבוסס הידרוג תא, שממחישים את הדוגמה של השתלת איון. h-עם פגיעה איון מטריקס ממלאת השרשה (ביות) מאפשר השתלה של תערובת תא-הידרוג בין השכבות עם פגיעה, ליד כלי הדם, כדי למקסם את engraftment בסביבה מטבולי תקין.
Abstract
רפואה רגנרטיבית המבוסס על טיפול בתאי מייצג תקווה חדשה לריפוי המחלה. מכשולים הנוכחי כוללים נאות ויוו אימות של היעילות של הטיפול. העברה אל הגוף הנמען, תאים בדרך כלל צריכים להיות משולב עם biomaterials, במיוחד hydrogels. עם זאת, אימות יעילות של שתל כזה דורש הסביבה המתאימה את הידרוג נכון, האתר נכון הנמען. Omentum עשוי להיות אתר כזה. בהתבסס על הדוגמה של השתלת איון, פיתחנו את הטכניקה (מילוי איון מטריקס עם פגיעה-h) ביות, אשר מורכב של ההזרקה של השתל בתוך הרקמה, בין השכבות עם פגיעה, כדי לשפר את ההשתלה איון והישרדות. כדי להשיג זאת, איונים צריך להיות מוטבעת של הידרוג עם צמיגות המאפשרת שלה הזרקת באמצעות מחט של atraumatic. מזרקים נטענים עם שילוב של הידרוג איונים. מספר ההזרקה מתבצעת בתוך הרקמה עם פגיעה בנקודות כניסה שונים, בתצהיר של התערובת איון/הידרוג נעשית לאורך קו. . בדקנו את הכדאיות של גישה זו חדשניים באמצעות חרוזים לתוספי- החרוזים היו להתפשט ברחבי הרקמה עם פגיעה, בסמיכות לכלי הדם. כדי לבדוק את היעילות של השתל, אנו הושתלו איונים עכברים סוכרתיים, לבצע מעקב מטבולית מעל חודשיים. המושתלים איונים הציג שיעור גבוה של vascularization מחדש סביב ובתוך איונים, וביטל סוכרת. הטכניקה ביות יכול להיות ישימים עבור סוגים אחרים של טיפול הידרוג או תא, עבור תאים עם פעילות מטבולית גבוהה.
Introduction
טיפול בתאי הוא נושא חם, כפי שהוא שואף לרפא מחלות בהתבסס על רפואה רגנרטיבית. תא בסיוע חומר ביולוגי טיפולים יותר ויותר נחקרו בשנים האחרונות, בעיקר משום תא השרשה לעיתים קרובות דורשת נשאית עבור העברת תאים מן המנה תרבות אל הנמען. פיגומים biomaterial מעבירות תא ערך פוטנציאלי זה למלא את תפקידי מספר1. נשאית המוסמכת צריך להגן על תאים מפני מכני מדגישה ומספקים תנאים צמיחה חיובית, כגון גורמי גדילה החיוניים, והוצאת פסולת מטבולית, חילופי חומרים תזונתיים, חמצן2.
בין הסוגים השונים של biomaterials להשתמש בטיפול תא, hydrogels יש יתרונות רבים. הם מסתיימים, מתכלה, קל לטפל ולהקל דיפוזיה חמצן3. יתר על כן, הטכנולוגיה הנוכחית מאפשרת את השימוש hydrogels כדי לעזור תאים לשרוד ו- engraft עם, למשל, תוספי עם גורמי גדילה או מטריצה במיוחד הסלולר חלבונים4.
יכול להיות מוזרק נושאות הידרוג המכיל תאי גזע כמו טיפולים, , למשל, עצם התחדשות5 ומערכת העצבים המחלה6. ההשתלה של תאים סמויה פעיל נדרש. בזמן אימות במבחנה של הגישה אפשרית, כלים וטכניקות עבור אימות ויוו להישאר להיות מעודן.
השתלת תאים, הידרוג יכול בקלות להתבצע על ידי זריקה תת עורית כאשר הביו הבדיקות נערכות. עם זאת, כאשר תאי המושתל נועדו להסדיר גורמים מערכתית על-ידי פעולת חילוף החומרים שלהם, לוקליזציה תת עורית זו אינה אופטימלית, בעיקרו של דבר מבחינת ניקוז ורידי7. לכן, אין כלים הנוכחי כדי במהירות, בבטחה וביעילות להעריך את ההשפעות המיטיבות של הידרוג. מבוסס על הדוגמה של השתלת איון, הדורש כי ההורמונים להשתחרר למחזור הדם של השתל בתגובה רמות הגלוקוז בדם, פיתחנו שיטה חדשה להשתלה תא/הידרוג ויוו.
הצעד הראשון היה לזהות אתר השתלת מקבל, אשר יכול לקבל של הידרוג עם תאים. Omentum מציע שטח גדול עבור ההשתלה, הוא מאוד פלסטיק, שלה vascularization צפופה בשילוב עם הגדרת בקרום הבטן היא מעניין ללמוד שיש פעילות מטבולית גבוהה8תאים. אנחנו הבא צריך לבסס טכניקה כירורגית המאפשר ההעברה של התאים, את הידרוג לתוך omentum. בהשראת lipofilling המשמשים לניתוח פלסטי9, פיתחנו את איון מטריקס עם פגיעה h מילוי הגישה (ביות). איונים נעוץ הידרוג מוזרקים בתוך הרקמה עם פגיעה. הטכניקה נועד גם כדי לספק engraftment המרבי על ידי ניצול התצהירים מרובים של תערובת התא ואת הידרוג לתוך הרקמה עם פגיעה, שבו מספר רב של כלי דם גם משפר שתל חמצון.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים טכניקה פשוטה וחדשני עבור איון השרשה בין הסדינים עם פגיעה, בתוך רקמת השומן הקרוב ביותר בכלי הדם. זה מורכב של ניתוח מיקרו פולשנית, אשר יכול להסתיים תחת לפרוסקופיה, עם ההזרקה של איים הכלול של הידרוג לתוך רקמת השומן. טכניקה זו ישימה בקלות על כל השילובים הידרוג ותא צריכה להיבחן סביבה תפקודית סמויה.
Protocol
כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות מכוני הבריאות הלאומיים, עם מספר אישור: AL/60/67/02/13.
1. הכנה נמען
-
מבחינה כימית לגרום לסוכרת אצל חולדות הנמען.
- להזריק 75 מ"ג/ק"ג של streptozotocin (STZ, במאגר סטרילי 0.1 M ציטראט, pH 4) intraperitoneally עד חולדות10.
הערה: ללימודים השתלת, שימשו 6 בת שבוע לואיס זן עכברים, במשקל 150-190 גרם. - לבדוק את מצב הסוכרת על ידי יומי מדידות גלוקוז בדם במהלך ארבעת הימים הראשונים. להזריק אינסולין ארוך 6 U/יום subcutaneously כאשר חולדות התערוכה גליקמיה מעל 2 g/L כדי למנוע סיבוכים של סוכרת, הרזיה, עד אינסולין צניפה השרשה.
- כוללים חולדות במדגם כאשר שני מכשירים למדידת רמת הסוכר בדם וריד הזנב > 4-5 g/L עבור 2 ימים רצופים, ורמת C-פפטיד הוא < 200 pM. למדוד גליקמיה באמצעות סוכר C-peptidemia על ידי מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה).
- שתל כדורי אינסולין מתחת לעור (ראה 1.2).
הערה: אינסולין כרוני הטיפול מאפשר ויסות גליקמיה טוב יותר ומונע סיבוכים סוכרתית (אשר להחריף סטרס חמצוני באתר השתלת)11. יתר על כן, הטיפול חוסך את מצב הסוכרת יחד עם עקומת גדילה נורמלי (ללא ירידה במשקל הרגיל שנצפתה בעל חיים חולה סוכרת). התוצאה יכולה להיות גדולה יותר עם פגיעה השמן כרית, אשר הינו אידיאלי עבור ביצוע השתלת.
- להזריק 75 מ"ג/ק"ג של streptozotocin (STZ, במאגר סטרילי 0.1 M ציטראט, pH 4) intraperitoneally עד חולדות10.
-
השרשה של כדורי אינסולין
- עזים ומתנגד העכברוש באמצעות גז הרדמה (3% איזופלוריין 500 mL/min O2) ומניחים את החולדה במצב שכיבה.
- ודא הרדמה מצב על-ידי בדיקת היעדר רפלקס (התכווצות כף הרגל). לנקות את הצוואר באמצעות povidone יוד, לגלח את האזור בעזרת סכין גילוח. להחיל povidone יוד שוב ולתת לו לעמוד במשך 3 דקות.
- כדורי אינסולין המקום 1.5 (3 יחידות (U) / חולדה 200 גרם) ב- 1:5 מדולל povidone יוד פתרון לחטא את כדורי. מנקבים את עור הצוואר באמצעות נקז 16 גרם והכנס בגדר שימוש במדריך מרוהטת ו- stylet. אחזר את מדריך ואת stylet ותתפרי נקודה אחת. השתמש povidone יוד כדי לנקות התפר.
הערה: ללא ניהול כאב לאחר ניתוח היה הכרחי כמו ההתערבות היה להשוות זריקה תת עורית אחת (SC). - תן את החולדה להתאושש מן ההרדמה ולוודא חולדות יש גישה למזון כדי למנוע היפוגליקמיה.
- למדוד את היעילות של גלולה על ידי מדידת ירידה glycaemia לאחר ההשתלה.
- בדוק את יעילות גלולה על ידי ניטור רמת גליקמיה כל שבוע במשך חודש.
- לכלול חולדות במדגם כאשר מדד רמת דם C פפטיד וריד הזנב נשמר תחת 200 pM 1 חודש לאחר ההשתלה צניפה אינסולין.
הערה: בדיקת רמות פפטיד סי הוא חובה להעריך בעלי חיים על בסיס לפני השתלת וכדי לאשר את מצב הסוכרת שלהם. התחדשות C-פפטיד נמוך תמיד מתרחשת במהלך מעקב. C-peptidemia הנמוך ביותר הוא מרמז על התחדשות הנמוך.
2. יונת: עם פגיעה אינטרה איון ממלא מטריקס
-
הכנת התערובת איון-מטריקס.
- הכינו את המוביל איון צמיגה תא למינארי. לפזר אבקת alginate ב- PBS סטרילי-ריכוז של 1.5%. לעקר את ההכנה על ידי מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. להכין את µL 400 לכל נמען.
הערה: ניתן להשתמש בכל סוג של הידרוג עם צמיגות מתאים הזרקה דרך מחט 21 G. - לבודד איון של לואיס בריא חולדות (200-250 g) כמו שתואר לעיל12.
- איון לספור ב איון מקבילות (IEQ) (אחד IEQ נחשב מקביל הלבלב איון בקוטר של 150 מיקרומטר)13.
- ב תא למינארי, להכין את aliquots של המקבילה 7660-איון (IEQ) צינור 1.5 מ.
- לשטוף aliquots איים קטנים עם 500 µL בינוני CMRL (Connaught מעבדות מחקר רפואי) ללא סרום שור בעובר.
- גלולה איים על ידי צנטריפוגה (2 דקות ב-500 x g ו- 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
- להוסיף 150 µL של קילוף פלסטיצידיות הידרוג המוביל מעל ע, לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה ולמקם את התמהיל על קרח.
- להכין של המחט 21 G atraumatic מזרק 1 מ"ל ללא נפח מת על-ידי טעינת µL 150 של קילוף פלסטיצידיות ריקה לתוך המזרק.
- למלא את המזרק עם התערובת של איים קטנים, קילוף פלסטיצידיות (150 µL, µL הנפח הכולל 300). שמור את המזרק על קרח.
- הכינו את המוביל איון צמיגה תא למינארי. לפזר אבקת alginate ב- PBS סטרילי-ריכוז של 1.5%. לעקר את ההכנה על ידי מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. להכין את µL 400 לכל נמען.
-
הליך כירורגי
- לחטא כלי ניתוח באמצעות עיקור קר (2% Steranios עבור 20 דקות).
- עזים ומתנגד העכברוש באמצעות הרדמה איזופלוריין ומניחים את החולדה במצב שכיבה.
- לגלח את אזור הצוואר בעזרת סכין גילוח, לחטא את האזור עם povidone יוד. תן יוד לעמוד במשך 3 דקות.
- בחתך באמצעות אזמל ולהסיר את כדורי אינסולין 1.5 באמצעות מלקחיים. סגור את העור בעזרת נקודות תפר אחד אחד או שניים. אל תסיר את החולדה מן ההרדמה.
הערה: לאחר חודש, בגדר יכול להיות לעזאזל כמו טישו שהותירה מאירות כמו כדורי; להשתמש במספריים לנתח אותו כראוי. - מקם את החולדה במצב פרקדן. לגלח ולחטא (עם povidone יוד) לאזור הצפק. תן יוד לעמוד במשך 3 דקות.
- צור פתיחה של 1.5 ס מ הבטן מתחת לעצם החזה באמצעות אזמל. במקום גזה סטרילי רטוב סביב האזור חרות.
- לזהות את omentum כי הוא משטח שמן מקומי ליד הקיבה. להשתמש מלקחיים כדי לתפוס את omentum, משוך אותו בעדינות מתוך חלל הצפק, ובזהירות תמרח את זה על הגזה.
הערה: הרקמה עם פגיעה משתרע מן הטחול התריסריון ומצרף בנקודה באמצע אל הקיבה. Omentum הרגיל של עכברים סוכרתיים שקיבלו טיפול אינסולין הוא כ 2 cm ² במריחה על הגזה. - מימה הרקמה עם פגיעה היטב באמצעות 2 מ ל תמיסת סטרילית מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס. להשתמש מלקחיים קטנים מעוקלים כדי לתפעל את הרקמה ולחדור הקצה עם פגיעה עם מחט בין השכבות עם פגיעה. הכנס את המחט לחלוטין.
- להתחיל ההזרקה של הכנת איון לאט לאט, בזהירות להזיז את המחט לאחור כדי להזריק את איונים במספר מקומות (כמו קווים). לפני פורש את המחט, ודא הידרוג הפסיק היציאה את המחט כדי למנוע את אובדן איים התפזרו.
- חזור על מניפולציה זו לפי הצורך כדי להזריק את כל התוכן של המזרק באמצעות נקודות כניסה שונים כדי להפיץ את איונים לאורך כל הרקמה עם פגיעה.
הערה: בחולדות, ארבע עד חמש זריקות דרושים בדרך כלל. - בדוק כי איים קטנים אינם מקובצים במזרק בסוף הזריקות.
הערה: אם כמה איים קטנים שיהיו עדיין גלויות, שניתן להוציא את המחט המזרק, למלא את המזרק ישירות עם 100 µL של הידרוג ריק, וחבר מחדש את המחט. בסיבוב השני של הזרקת יכול להיעשות לחשוף את איונים הנותרים. - השתמש מלח סטרילית שוב מימה הרקמה עם פגיעה, הקיר של פתיחת בטן. להשתמש מלקחיים להחלפת בקפידה omentum בחלל הבטן.
- הכנס 2 מ ל תמיסת סטרילית ומחוממת מראש לתוך חלל הבטן כדי להחזיר נוזלים החולדה.
- קרוב לקיר השריר באמצעות חוט רציף בתפר. ואז לתפור את השכבה עורית עם נקודת תפר אחד (נקודה אחרי נקודה).
- מזריקים meloxicam (1.5 mg/kg) subcutaneously בתור מקבל 5 ימים פעם ביום.
- מקם את החולדה בכלוב על כרית החימום עד ההתאוששות מן ההרדמה. חזור על הפעולות לכל כל העכברושים הנמען.
- למדוד את רמת הסוכר בדם לאחר ההשתלה כל יום. אם גליקמיה היא > 2 g/L, תזריק 6 U של אינסולין ארוך subcutaneously פעם ביום.
- להעריך תפקוד שתל על-ידי גליקמיה ובפיקוח c-peptidemia מעל חודשים 1 או 2.
הערה: במקרים של השתלת מוצלחת, גליקמיה אמור לייצב תוך 2-5 ימים לאחר ההשתלה, חולדות ניתן לקחת את האינסולין.
3. עם פגיעה שתל Explantation
הערה: הליך זה יאפשר האישור של תפקוד שתל טוב. לאחר אחזור של השתלה פונקציונלי, חולדות צריך להחזיר למצב סוכרתית. שלב זה מבוצע לאחר 1-2 חודשים של מעקב מטבולית.
- עזים ומתנגד העכברוש עם גז הרדמה ולמקם אותו במצב פרקדן.
- גילוח לאזור הצפק ולחטא אותו באמצעות povidone יוד למשך 3 דקות.
- צור פתיחה של 1.5 ס מ הבטן רק תחת עצם החזה באמצעות אזמל. במקום גזה סטרילי רטוב בכל רחבי האזור חרות.
- לזהות את omentum, אשר נמצא ליד הקיבה. להשתמש מלקחיים למרוח אותה בזהירות הגזה.
- להשתמש במספריים לסלק את omentum. נתחיל מהחלק המצייתת אל זנב הלבלב (ליד הטחול). אם הדימום מתרחש, השתמש יבשה גאזה סטרילי כדי לעצור את זה.
- המשך כריתה לאורך החלק המוצמד לבטן ולאחזר את omentum.
הערה: במיקום זה, gastroepiploic העורקים (איור 1) יכול לגרום כמות גדולה של דימום, אם הם בטעות קיצוץ. עורק חתכים בלתי נמנעים להחזיר את השתל, אבל הדימום יכול להיות מנוהל באמצעות מלקחיים, גזה. במקרה לחתוך מקרי, לדחוס בחוזקה עם גזה יבשה ולתחזק את הדחיסה לפחות 1 דקות. להפסיק הדימום. אם לא, שימוש קליפים או שימוש bistoury חשמלי כדי לצרוב את כלי הדם.
איור 1: התפלגות עם פגיעה בעורק. עבור omentum שתל explantation, אזור קריטי המורכב gastroepiploic העורקים מיוצג בצבע כחול. במהלך כריתה של חלק זה של הרקמה עם פגיעה, תשומת לב חייבים להיות שישולם במקטע עורק gastroepiploic נכון. דחיסה, קשירה או החריצה יכול לשמש כדי להגביל את הדימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- בדוק אם יש דימום נמשכת. אם לא, הכנס 2 מ ל תמיסת ומחוממת מראש, סגור את החולדה ולעבד כפי שתואר לעיל.
חיות explanted להחזיר למצב סוכרתית. הזרקת אינסולין (6 U/SC/יום) ואז הוא חובה להבטיח את שלומם של בעלי החיים. - המתת חסד העכברוש 10 עד 12 ימים לאחר explantation באמצעות מנת יתר של פנטוברביטל (182.2 מ"ג/ק"ג).
4. היסטולוגית ניתוח: Hematoxylin ו אאוזין מכתים
- לתקן את omenta שאוחזרו באמצעות 4% paraformaldehyde (PFA), להטביע פרפין.
- חותכים למקטעים 4 מיקרומטר עובי ולהחיל hematoxylin ו eosin כתם להערכה מורפולוגי של ההשתלה.
5. ניתוח סטטיסטי
- לקבוע מובהקות סטטיסטית באמצעות אמצעים חוזרות השונות (ANOVA) ותוכנה ניתוח סטטיסטי כנה משמעות ההבדל במבחן של Tukey כמבחן לאחר הוק. מייצגים ערכי p : * 0.05 <p ; p < 0.01; p < 0.001.
Representative Results
בשיטת הביות מאפשר ההתרחקות השרשה קרישה תוך-כלית וכליאתם של איים קטנים בתוך איבר. הזמן המרבי של 8-10 דקות נדרש תהליך ההשתלה איון כולו, כולל הרדמה, אשר ציר זמן להשוות קלאסית השתלת כבד.
ללמוד את הדרך איים מפוזרים בתוך הרקמה עם פגיעה, חרוזים לתוספי הושתלו באמצעות שיטת הביות (איור 2). יום אחד לאחר ההשתלה, חולדות הוקרבו, עם פגיעה ברקמות אוחזרו לבדיקה היסטולוגית. Hematoxylin ואאוזין מכתים חשף התפלגות אחידה של החרוזים לאורך הרקמות (איור 2הימנית התחתונה). לעיתים קרובות, חרוזים היו בקרבת כלי דם והיו מושתל היטב ברקמות השומן. מיד לאחר ההשתלה, לתגובה דלקתית מתרחשת סביב החרוזים, וכתוצאה מכך רקמת שחלוף כדי לקנן את איונים ברקמה.
איור 2: תיאור של ביות טכניקה, חרוז הפצה דרך הרקמות עם פגיעה יום לאחר ההשתלה. (א) איור של הטכניקה ביות. לאחר החשיפה איברים (A, משמאל), המיקס איון-הידרוג (מוחלף כאן על ידי חרוזי בצבע כחול לתוספי כאחראית) הוזרק בזהירות בתוך הרקמה באמצעות מחט של atraumatic (A, באמצע). חרוזים מוטמן בתוך הרקמה הם גלויים (א, נכון). (B) Hematoxylin ואאוזין כתמים omentum explanted 1 יום לאחר ההזרקה חרוז. חרוזים ניתן למצוא את הרקמה עם התפלגות אחידה. סרגל קנה מידה = 100 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כדי לאמת את הטכניקה הזו, ביצענו מחקרים isogenic באמצעות חולדות לואיס (n = 8). עכברים סוכרתיים קבלת השתלות איון (המקביל 7660 איון, IEQ) לכל ק"ג משקל גוף עכברים באמצעות יונת נוטרו גליקמיה ו C-peptidemia במשך חודשיים. גליקמיה היה בשליטת השרשה של אינסולין גלולה (כמו המעיד על הירידה הראשונה גליקמיה שנצפתה על דמות 3A). תפקוד שתל בא לידי ביטוי על ידי גליקמיה של 2 g/L ו- C-peptidemia > 500 pM. לפני ההשתלה, חולדות היו סוכרתית (glycaemia > 5 g/L ו- C-peptidemia < 200 pM). לאחר השתלת ואחזור צניפה אינסולין, תחזוקה גליקמיה ונורמליזציה נצפתה רק 3 ימים שלאחר ביות השתלת, ונשתמרה עד שתל אחזור (p < 0.05 בהשוואה להשתלות מראש רמות). לאחר explantation עם פגיעה, גליקמיה קם לתחייה לשלב שלפני ההשתלה, המעיד על הפונקציונליות של איים קטנים זה היו מושתלים על ידי ביות (איור 3 א). התבנית C-peptidemia היה בדיוק ההפך, נמוך רמות לא לגילוי לפני השתל, ואחריו עלייה ותחזוקה ברמה מוגברת זו לאורך כל הקורס של המחקר (p < 0.05), לאחר explantation עם פגיעה, ירידה טרום השתלה רמות (איור 3B). ניתוח של omentum explanted על ידי היסטולוגיה גילה איים קטנים מאוד מחדש vascularized, ככל הנראה בשל סמיכותם לכלי הדם (איור 3C).
איור 3: חודשיים מעקב מטבולית של חולדות קבלת הערכת יונת, שתל. (א) גליקמיה מדידה והערכה (B) C-פפטיד לאחר יונת באמצעות קילוף פלסטיצידיות כמו נושאת איון (Tx: השתלת ואחזור צניפה אינסולין; Explantation: Explantation של omentum). השתלים הם פונקציונליים, כפי שמוצג על ידי שמירה על normoglycemia לאחר אחזור צניפה אינסולין ולהגדיל ב- C-peptidemia לאחר ההשתלה איון. אפור אזורים מוצללים מייצגים הערכים מוקלטות מינימלי, מקסימלי בכל נקודה בזמן. (ג) Hematoxylin, אאוזין מכתים של מקטע עם פגיעה לאחר השתלת איון באמצעות שיטת הביות. איים קטנים הם משולבת היטב לתוך הרקמה חודשיים לאחר ההשתלה ללא כל רקמות שהותירה שמסביב. כלי גדלו סביב ובתוך איונים, כפי שמראים החיצים, ובכך לחלוטין לשקם את תפקוד איון. המורפולוגיה של איים קטנים גם נראה שהשתמרה היטב. גודל ברים = 50 מיקרומטר. (n = 8) (*p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001 נקבע באמצעות אמצעים חוזרות השונות (ANOVA) כנה משמעות ההבדל במבחן של Tukey כמבחן לאחר הוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
יכול להיות מודגשות כמה צעדים קריטיים פרוטוקול זה. ראשית, על האדם ביצוע הניתוח וטיפול ברקמות להיות עדינים עם רקמת השומן, כפי שהוא שביר. ריסוק או פגיעה omentum את צריכה להימנע. Omentum, כמו טישו הגנתית, מועשר מקרופאגים, לויקוציטים אחרים. אלה תאים חיסוניים יכול להיות מופעל על ידי מניפולציה מופרז, יכול להשפיע לרעה על השתל. שנית, שתל (איון-הידרוג תערובת) טוען גם הוא קריטי. האדם ביצוע ההליך חייב להימנע מתה אמצעי אחסון, עליך לטעון את כל התערובת הידרוג-איון לתוך המכשיר הזרקת. מיד לאחר שלב זה, נקודה קריטית נוספת היא הזריקה עצמה. הזרקת חייב להתבצע לאט, בזהירות, בעדינות. המזרק חייב יבוצע ריקון מאת הידרוג ריק טעון בתחילה כדי לאחזר כל איונים הנותרים. שלישית, תפירת חייב להיעשות בזהירות, בשני שלבים. התוכנית שרירים צריך להיות sutured קודם, מקפיד לא תפר את omentum לשריר, העור צריך להיות sutured בנפרד. לגבי ההליך explantation עבור השתל עם פגיעה, תשומת לב מיוחדת יש לנקוט באותו הרגע כאשר העורקים קרוב לבטן (gastroepiploic העורקים) הם חרות. חשוב להקדיש תשומת לב כל שטפי דם זה להתרחש ולעצור אותם לפני תפירת החיה, כמו רמזים דימום מתמשך למוות בעלי חיים בתוך ימים אחדים.
פתרון בעיות עשוי להיות נחוץ לגבי המדיום להובלת איונים; הבחירה של הידרוג היא עד הנסיין, כל עוד הידרוג להזרקה. השימוש של חומרים שונים יכולים לגרום משתנה להשתיל פונקציה (עם או בלי תוספת, לדוגמה). השיטה המתוארת כאן הוכיחה את יעילותה אינרטי חומר השתלה במשותף עם יחס איון 7660 IEQ/ק ג.
השיטה הנוכחית עלולים להגביל את גודל עם פגיעה והמאפיינים הידרוג. כדי להשתמש מודל מכרסמים סוכרתית, טיפול אינסולין הוא חובה לפני ההשתלה איון לספק מספיק אזור הרכבה. מכרסמים סוכרת לאבד הרבה משקל ומסה שומן עקב סוכרת STZ-induced. בהתחשב המשקל קטן של החיות שהשתתפו במחקר זה, הרכבה בשטח קטן אפילו אינה אפשרית.
שימור ניהול תקין גליקמיה (לפני ההשתלה באמצעות כדורי ושימוש לאחר מכן אינסולין ארוך) הוא חובה. כאן בחרנו לשמר בגדר אינסולין עד היום של השתלת מכמה סיבות. ראשית, שמירה על פקד גליקמי תקין במידה ניכרת מפחית סטרס חמצוני המושרה על ידי סוכרת באיברים הנמען, אשר עלולות להזיק השתלת איון11 ומאפשרת המשך טיפול אינטנסיבי אינסולין, חתן הכנה שנצפתה מרפאת12. שנית, רצינו להגביל את המספר המרבי של הרדמה הליכי העכברושים. בנוגע המימוש של אינסולין טיפול במהלך ההמשך מטבולית באמצעות אינסולין ארוך, נמנע ערכת שימוש מסיבי סיבוכים בשל glucotoxicity (אשר יכול להרוס את שתלי), כדי לשמר את ערך גליקמיה "אמיתי".
כדי לפקח על יעילות שתל, גליקמיה אינה פרמטר רלוונטי בימים הראשונים אם חולדות מקבלים טיפול אינסולין באמצעות כדורי. לכן בדיקת רמת C-פפטיד מוקדמת מספר פעמים השתלה היא חובה. בזמנים אלה כוללים את תחילת המחקר, לבחירת חיות לאחר ההזרקה STZ, אז רק שלפני ההשתלה, כדי להבטיח כי חולדות יישארו סוכרתית התחדשות הוא מינימלי.
הידרוג מאפיינים חשובים אף הם. הידרוג נוזל ידלוף החוצה עם פגיעה ברקמות, הידרוג בעלי צמיגות גבוהה לא יהיה להזרקה. צמיגות הידרוג ו- injectability יש להיבדק לפני השימוש, אך נראה חיוני כדי לבדוק גם את החומר ישירות על ידי הערכה של איון או אחר הישרדות התאים במבחנה. כאן, כמו איים קטנים רגישים מאד והתקפת השימוש נשאית בעלי צמיגות גבוהה יכול להשפיע דיפוזיה חמצן.
מבחינת החשיבות של השיטה המתוארת כאן לגבי שיטות קיימות, טכניקה זו השתלת רקמה אינטרה יתרונות לטווח של הפארמצבטית. זה גם atraumatic על הרקמה, בגלל מיקומו במיוחד כלי הדם, מונע סיכונים מערכת הקרישה שלו. גם, כאשר שוקלים השתלת איון, תגובה דלקתית בתיווך דם מיידית הוא התחמק14. יתר על כן, יונת מאפשר משתילים איונים לתוך איבר שאינם חיוניים, בניגוד השתלת לתוך הכבד, אשר מהווה סיכון מבחינת תפקוד הכבד15.
כדי להפיק ביצועים מיטביים, הידרוג חייב להיות מותאם התאים שזה ישא. השימוש של גורמי גדילה או חלבונים ספציפיים יכולה להיות השפעה חיובית על התאים המושתלים16,17.
לסיכום, טכניקה זו ניתן להשתמש לצורך אימות ויוו הידרוג על סוגי תאים שונים, בעיקר כאשר נדרשת סביבה חילוף החומרים הפעילים, באשר איונים. בנוסף, טכניקה כירורגית זו ישימה על יישומים מרובים, יכול להיות, בעתיד, במהירות ניתן להעברה לבני אדם, כמו זה ניתן בקלות לבצע באמצעות לפרוסקופיה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי Région אלזס, Biovalley אלזס BioArtMAtrix-Pôle-CQDM; 53/14/C1. המחברים מודים לצוות של pr. Bruant-Rodier מן Hôpitaux Universitaires דה שטרסבורג עוזר לפתח טכניקה חדשנית זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
| Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
| CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
| C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
| Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
| Ethilon 4/0 | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
| Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
| Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
| Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
| Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
| NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
| Needle 26 G | TERUMO | 050101B | |
| Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
| Sodium pentobarbital | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
| Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
| Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
| Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
| Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |
References
- Bakhshandeh, B., et al. Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials. Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
- Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A.
- Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced healthcare materials. 2, 57-71 (2013).
- Bai, X., et al. Bioactive hydrogels for bone regeneration. Bioactive Materials. 3, 401-417 (2018).
- Allbright, K. O., et al. Delivery of adipose-derived stem cells in poloxamer hydrogel improves peripheral nerve regeneration. Muscle Nerve. , (2018).
- Van Der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N. M., Cooper, D. K. C. The Choice of Anatomical Site for Islet Transplantation. Cell transplantation. 17, 1005-1014 (2008).
- Zweifach, B. W., Lipowsky, H. H. Quantitative studies of microcirculatory structure and function. III. Microvascular hemodynamics of cat mesentery and rabbit omentum. Circ Res. 41, 380-390 (1977).
- Bruant-Rodier, C., Dissaux, C., Baratte, A., Francois Fiquet, C., Bodin, F.
- Schaschkow, A., et al. Extra-Hepatic Islet Transplantation: Validation of the h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) Technique on a Rodent Model Using an Alginate Carrier. Cell transplantation. 27, 1289-1293 (2018).
- Schaschkow, A., et al. Impact of the Type of Continuous Insulin Administration on Metabolism in a Diabetic Rat Model. Journal of diabetes research. 2016, 8310516 (2016).
- Schaschkow, A., et al. Impact of an autologous oxygenating matrix culture system on rat islet transplantation outcome. Biomaterials. 52, 180-188 (2015).
- Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an Islet Cell Resources study. Clinical transplantation. 24, 236-242 (2010).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver microenvironment. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 30, 227-238 (2017).
- Leitao, C. B., et al. Liver fat accumulation after islet transplantation and graft survival. Cell transplantation. 23, 1221-1227 (2014).
- Narang, A. S., Mahato, R. I. Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation. Pharmacological reviews. 58, 194-243 (2006).
- Alvarado-Velez, M., Pai, S. B., Bellamkonda, R. V. Hydrogels as carriers for stem cell transplantation. IEEE Trans Biomed Eng. 61, 1474-1481 (2014).
