Summary
Burada, bir protokol adacık nakli örnek tarafından resimli hidrojel tabanlı hücre tedavisinin içinde vivo doğrulama için mevcut. (hOMING) implantasyon doldurma h Omental matris adacık hücre hidrojel karışımı kan damarları engraftment uygun metabolik ortamında en üst düzeye çıkarmak için yakın omental katmanlar arasında implantasyonu sağlar.
Abstract
Hücre tedavisi üzerinde dayalı rejeneratif tıp hastalığı tedavi için yeni bir umut temsil eder. Geçerli engelleri tedavinin etkinliğini uygun vivo içinde doğrulanmasını içerir. Alıcı vücuda transferi için hücreleri genellikle Biyomalzeme, özellikle hydrogels ile kombine edilebilir gerekir. Ancak, doğru ortamı, doğru hidrojel ve şu alıcı site böyle bir greft etkinliğinin doğrulanmasını gerektirir. Omentumun böyle bir site olabilir. Adacık nakli örnek üzerinde bağlı olarak, biz greft adacık implantasyon ve yaşam geliştirmek için omental katmanları arasında doku içinde enjeksiyon oluşur izleme (h-Omental matris adacık doldurma) tekniği, gelişmiş değil. Bunu başarmak için adacıkları bir hidrojel Atravmatik iğne kullanarak onun enjeksiyon sağlar bir viskozite ile gömülü olması gerek. Şırınga hidrojel ve adacıkları kombinasyonu ile yüklenir. Birkaç iğne farklı giriş noktalarında omental doku içinde gerçekleştirilir ve devrilmesinden sonra adacık/hidrojel karışımı bir hat boyunca yapılır. Bu yenilikçi yaklaşımın dextran boncuk kullanarak fizibilite test ettik. Boncuk de yakın kan damarlarına omental doku boyunca yayıldı. Greft etkinliğini test etmek için biz diyabetik sıçan adacıkları nakli ve metabolik bir takip iki ay içinde gerçekleştirin. Transplante adacıkları yeniden vaskülarizasyon çevresinde ve adacıklar içinde yüksek oranda sergilenen ve diyabet ters. Yön belirleme tekniği hidrojel veya hücre terapisi, yüksek metabolik aktivite içeren hücreler için diğer türleri için geçerli olabilir.
Introduction
Bu hastalığın dayalı rejeneratif tıp tedavisi için amaç gibi bir konu, hücre tedavisi vardır. Özellikle hücre implantasyonu kez kültür çanak hücrelerden alıcıya transfer için bir taşıyıcı gerektirdiği için biyolojik malzeme destekli hücre tedavileri son yıllarda giderek eğitim görmüştür. Biomaterial iskele çeşitli roller1yerine getirmek potansiyel olarak değerli hücre taşıyıcılar vardır. Yetkili bir taşıyıcı mekanik gerilmeler hücreleri korumak ve gerekli büyüme faktörleri, metabolik atık atılımı, besin maddeleri ve oksijen2alışverişi gibi olumlu büyüme koşulları sağlamak.
Biyomalzeme hücre tedavisinde kullanılan farklı türleri arasında hydrogels pek çok avantajı var. Biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilir, kolay işlemek ve oksijen Difüzyon3kolaylaştırmak için var. Ayrıca, mevcut teknoloji hayatta kalma ve büyüme faktörleri veya ekstra hücresel matris proteinler4ile örneğin, takviyesi ile engraft hücreleri yardımcı olmak için hydrogels kullanımını sağlar.
Kök hücre içeren hidrojel taşıyıcıları tedaviler enjekte Örneğin, kemik rejenerasyon5 ve sinir sistemi hastalığı6. Metabolik olarak aktif hücre implantasyonu gereklidir. Yaklaşım, tüp bebek doğrulanması mümkün olmakla birlikte, araçları ve teknikleri içinde vivo doğrulama için rafine olmak kalır.
Ne zaman Biyouyumluluk testleri, hücre ve hidrojel nakli kolayca subkutan enjeksiyon tarafından yürütülen olabilir. Aşılı hücreleri tarafından metabolik kendi eylem sistemik faktörler düzenleyen içindir, ancak, bu subkutan yerelleştirme açısından aslında7Venöz drenaj en uygun değildir. Bu nedenle, hızlı, güvenli ve verimli bir hidrojel yararlı etkileri değerlendirmek için hiçbir geçerli araç vardır. Hormonlar greft kan şekeri yanıt olarak gelen kan dolaşımına serbest bırakılmasını gerektirir, adacık nakli örneği tabanlı cep/hidrojel implantasyon içinde vivo için yeni bir yöntem geliştirdi.
Bir hidrojel hücrelerle kabul edebilir bir alıcısı ekimi sitesini tanımlamak için ilk adım oldu. Omentumun için geniş bir alan sunuyor implantasyonu, son derece plastik, ve onun yoğun vaskülarizasyon mayi ayarıyla birlikte yüksek metabolik aktivite8sahip hücreleri eğitimi için ilginç. Biz sonraki Omentumun hücreleri ve hidrojel transferini sağlayan bir cerrahi teknik kurmak gerekiyordu. Plastik cerrahi9' kullanılan lipofilling esinlenerek, (hOMING) yaklaşım doldurma h Omental matris adacık geliştirdik. Hidrojel içinde gömülü adacıkları omental doku enjekte edilir. Teknik aynı zamanda hücre ve hidrojel karışımı birden çok ifadeleri nerede kan damarları çok sayıda Ayrıca greft oksijenasyonu artırır omental doku içine kullanarak maksimum engraftment sağlamak hedeflenmiştir.
Bu da çalışmanın, adacık implantasyon için kan damarlarının en yakın yağ dokusu içinde omental levha arasında bir basit ve yenilikçi tekniği tarif. Bu bir hidrojel yağ dokusu bulunan adacıklar enjeksiyonlu laparoskopi altında tamamlanamadan, mikro-invaziv cerrahi oluşur. Bu teknik test edilebilir gerek tüm hidrojel ve hücre birleşimler için kolayca uygulanabilir bir metabolik olarak fonksiyonel bir ortamda.
Protocol
Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelere yetki numarası ile tüm hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir: AL/60/67/02/13.
1. alıcı hazırlık
-
Kimyasal olarak diyabet alıcı Sıçanlarda ikna etmek.
- 75 mg/kg streptozotocin (STZ, steril 0.1 M sitrat arabelleği, pH 4) intraperitoneally ile fareler10enjekte.
Not: Nakli çalışmaları için 150-190 g ağırlığında 6 haftalık Lewis zorlanma fareler kullanıldı. - Diyabet durumu günlük kan şekeri ölçümleri tarafından ilk dört gün boyunca kontrol edin. Uzun etkili insülin 6 enjekte U/gün subkutan insülin Pelet implantasyon kadar kilo kaybı ve diyabet komplikasyonları önlemek için 2 g/L üzerinde glycemia fareler sergilemek.
- Kuyruk damar kan şekeri iki önlem olduğunda fareler içinde kohort içerir > 4-5 g/l 2 gün üst üste ve C-Peptid Düzeyi için < 200 pM. Bir şeker ölçüm ve C-peptidemia bir enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kullanarak glycemia ölçmek.
- İnsülin granül derinin altında implant (1.2 bakın).
Not: Kronik insülin tedavisi daha iyi glycemia düzenleme sağlar ve (oksidatif stres nakli alanında azdırmak) Diyabetik komplikasyonlar önler11. Ayrıca, terapi (olmadan her zamanki kilo kaybı Diyabetik bir hayvan gözlenen) bir normal büyüme eğrisi birlikte diyabetik devlet korur. Bu nakli taşımak için ideal olan bir büyük omental yağ yastığı, neden olabilir.
- 75 mg/kg streptozotocin (STZ, steril 0.1 M sitrat arabelleği, pH 4) intraperitoneally ile fareler10enjekte.
-
İmplantasyon insülin briketler
- Anestezi gaz anestezi (% 3 isoflurane 500 mL/dk O2) kullanarak fare ve sıçan yüzükoyun sígara yerleştirin.
- Anestezi durumunu (pençe pinching) refleks yokluğu denetleyerek doğrulayın. Povidone iyot kullanarak boyun temiz ve alan bir jilet kullanarak tıraş. Povidone iyot tekrar uygulamak ve 3 dakikadır stand izin verin.
- Yer 1.5 insülin granül (3 adet (U) / 200 gr sıçan) granül sterilize etmek için bir çözümde 1:5 seyreltilmiş povidone iyot. 16 G trokar kullanarak boyun deri işlemek ve bir şekilde döşenmiş Kılavuzu ve stylet kullanarak Pelet ekle. Kılavuzu ve stylet almak ve tek bir noktadan dikiş. Povidone iyot dikiş temizlemek için kullanın.
Not: Hiçbir ameliyat sonrası ağrı yönetimi müdahale için tek bir cilt altı (SC) enjeksiyon karşılaştırılabilir olduğu gibi gerekli. - Fare fareler gıda hipoglisemi önlemek için erişiminiz olduğundan emin olmak ve anesteziden kurtarmak izin.
- Sonra implantasyon kolestorol azalma ölçerek Pelet verimliliğini ölçmek.
- Pelet verimliliği her hafta 1 ay için glycemia düzey izleyerek kontrol edin.
- Kuyruk damar kan C Peptid Düzeyi, ölçütü altında 200 korunur kohort fareler dahil am insülin Pelet implantasyonu sonrası 1 ay.
Not: Plazma C-peptid düzeyi denetimi, diyabetik durumlarına belirlemek ve hayvanların temel nakli önce değerlendirmek için zorunludur. Düşük C-peptid rejenerasyon her zaman takip sırasında oluşur. En düşük C-peptidemia en düşük yenilenme göstergesidir.
2. posta: içi omental matris adacık doldurma
-
Adacık vuruşlu karışım hazırlama.
- Laminar akış KukuIeta viskoz adacık taşıyıcıya hazırlayın. % 1.5 bir konsantrasyon, steril PBS aljinat toz geçiyoruz. Hazırlık 0,22 µm filtreden geçit tarafından sterilize. Alıcı başına 400 µL hazırlayın.
Not: Her türlü hidrojel sızdırma yoluyla 21 G iğne için uygun bir viskozite ile kullanılabilir. - Adacık sağlıklı Lewis fareler (200-250 g) üzerinden yukarıda açıklanan12olarak izole et.
- Saymak adacık eşdeğerleri (IEQ) (bir IEQ pankreas adacık 150 µm çapında eşdeğer kabul edilir) sayısında adacık13.
- Bir laminar akış başlık, aliquots 7660 adacık eşdeğer (IEQ) bir 1,5 mL tüp hazırlayın.
- Adacıkları aliquots CMRL (Connaught tıbbi araştırma laboratuvarları) orta fetal sığır serum ücretsiz 500 µL ile yıkayın.
- Santrifüjü (500 x g ve 4 ° C'de 2 dk) tarafından adacıkları cips. Süpernatant atmak.
- Dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix ve karışımı buz üstünde yer aljinat hidrojel taşıyıcı 150 µL adacıkları üzerinde ekleyin.
- Bir Atravmatik 21 G iğne ve 1 mL şırınga olmadan ölü cilt şırınga boş aljinat 150 µL yükleyerek hazırlayın.
- Şırınga adacıkları ve aljinat (150 µL, Toplam hacim 300 µL) karışımı ile doldurun. Şırınga buz üzerinde tutun.
- Laminar akış KukuIeta viskoz adacık taşıyıcıya hazırlayın. % 1.5 bir konsantrasyon, steril PBS aljinat toz geçiyoruz. Hazırlık 0,22 µm filtreden geçit tarafından sterilize. Alıcı başına 400 µL hazırlayın.
-
Cerrahi müdahale
- Soğuk sterilizasyon kullanarak cerrahi aletler sterilize (%2 20 dk için Steranios).
- Anestezi İsoflurane anestezi kullanarak fare ve sıçan yüzükoyun sígara yerleştirin.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak boyun bölgesi tıraş ve povidone iyot ile bölgeyi sterilize. 3 dakikadır stand iyot izin.
- Bir neşter kullanarak bir kesi yapın ve forseps kullanarak 1,5 insülin granül kaldırın. Bir ya da iki tek dikiş noktalarını kullanarak cilt kapatın. Fareyi anesteziden kaldırmaz.
Not: Bazı fibrotik doku parçaları kaydırılabilir olarak 1 ay sonra Pelet kırılgan olabilir; makas düzgün incelemek için kullanın. - Fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Tıraş ve (povidone iyot ile) Periton bölgeyi sterilize. 3 dakikadır stand iyot izin.
- Sadece bir neşter kullanarak göğüs kemiğinin altında 1,5 cm laparatomi oluşturun. Islak steril gazlı bez kazıma etrafına yerleştirin.
- Mide yanındaki lokalize yağ yastığı olduğunu Omentumun tanımlayın. Forseps dikkatle Omentumun yakalamak, yavaşça Periton boşluğuna dışarı çekin ve gazlı bez üzerinde yaymak için kullanın.
Not: Omental doku dalak için oniki parmak bağırsağı genişletir ve mide için orta noktasında ekler. İnsülin tedavi alan diyabetik sıçan normal Omentumun ne zaman gazlı bez üzerinde yayılmış yaklaşık 2 cm² dir. - Önceden ısıtılmış 37 ° C steril serum 2 mL kullanarak omental doku hidrat. Küçük eğri forseps omental kenar omental katmanlar arasında iğne ile nüfuz ve doku işlemek için kullanın. İğneyi tamamen yerleştirin.
- Adacık hazırlık enjeksiyon yavaş yavaş başlamak ve dikkatle iğne (satırları) olarak çeşitli yerlerde adacıkları enjekte etmek için geriye doğru hareket ettirin. İğneyi önce çekilmesi, hidrojel dağınık adacıkları kayıplarını önlemek için iğne çıkmadan durdurdu emin olun.
- Bu manipülasyon adacıkları omental doku boyunca dağıtmak için farklı girdi noktalarını kullanarak şırınga tüm içeriğini enjekte etmek için gerektiği kadar yineleyin.
Not: Rat, genellikle 4-5 enjeksiyonları ihtiyaç vardır. - Adacıkları şırınga iğneleri sonundaki içinde kümelenmiş değil kontrol edin.
Not: Bazı adacıkları hala görünür durumdaysa, iğne şırıngadan çekilme, boş hidrojel 100 µL ile doğrudan şırıngaya doldur ve iğne yeniden mümkündür. Enjeksiyon ikinci turunda kalan adacıkları floş için yapılabilir. - Steril serum fizyolojik tekrar omental doku ve laparotomi duvarına hidrat için kullanın. Forseps dikkatle Omentumun karın boşluğunda değiştirmek için kullanın.
- Önceden ısıtılmış steril serum 2 mL sıçan suyla temasa karın boşluğuna enjekte.
- Sürekli iplik dikiş kullanarak kas duvar kapatın. O zaman tek dikiş noktası (--noktasına) Kutanöz katmanla dikiş.
- Meloksikam (1.5 mg/kg) subkutan 5 gün için günde bir kez bir analjezik enjekte et.
- Fareyi bir Isıtma yastığı anestezi kurtarma kadar bir kafeste bir yer. Alıcı sıçanlara yordamı yineleyin.
- Kan glikoz naklinden sonra her gün ölçmek. Glycemia ise > 2 g/M, 6 U uzun etkili insülin enjekte subkutan günde bir kez.
- Greft işlevi glycemia ve c-peptidemia üzeri 1 veya 2 ay izleme değerlendirmek.
Not: Başarılı transplantasyon durumlarda glycemia nakli sonra 2-5 gün içinde stabilize ve fareler insülin alınabilir.
3. omental greft Explantation
Not: Bu yordamı iyi greft işlevi onay verecektir. Fonksiyonel greft alımı sonra fareler bir diyabetik durumuna dönmesi gerekir. Bu adımı metabolik takip 1 veya 2 ay sonra gerçekleştirilir.
- Gaz anestezi fareyle anestezi ve sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- Periton alan tıraş ve 3 dakikadır povidone iyot kullanarak sterilize.
- Sadece bir neşter kullanarak göğüs kemiğinin altında 1,5 cm laparatomi oluşturun. Islak steril gazlı bez tüm kazıma etrafına yerleştirin.
- Yanındaki mide Omentumun tanımlayın. Forseps dikkatle gazlı bez üzerinde yaymak için kullanın.
- Omentumun tüketim için makas kullanın. Pankreas kuyruk (yanında dalak) üzerine yapışır bölümünden başlayın. Kanama meydana gelirse, bunu durdurmak için Kuru steril gazlı bez kullanın.
- Eksizyon mideye bağlı bölüm boyunca devam edin ve Omentumun almak.
Not: Bu konumda Gastroepiploik arterleri (şekil 1) onlar kazara kesilir Eğer kanama, büyük miktarda neden olabilir. Arter insizyon greft almak için kaçınılmaz, ama kanama forseps ve gazlı bez kullanılarak yönetilebilir. Eğer yanlışlıkla bir kesim olursa, sıkıca kuru gazlı bez ile sıkıştırmak ve en az 1 dk. için sıkıştırma korumak. Kanamayı durdurmalıyız. Değilse, klipleri kullanabilir veya bir elektrik bistoury damarları dağlamak için kullanın.
Şekil 1: Omental arter dağılımı. Omentumun greft explantation için Gastroepiploik arterleri oluşan kritik alan mavi renkle gösterilir. Bu bölümü omental doku rezeksiyon sırasında dikkat sağ Gastroepiploik arter bölümüne ödenmesi için olması gerekir. Sıkıştırma, bağ veya Koterizasyon kanama sınırlandırmak için kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Herhangi bir kanama devam edip etmediğini denetleyin. Eğer değilse, Önceden ısıtılmış salin 2 mL enjekte, fareyi kapatın ve daha önce açıklandığı gibi işlemek.
Explanted hayvanlar diyabetik bir durumuna döndürebilirsiniz. İnsülin enjeksiyon (6 U/SC/gün) sonra hayvan refahı sağlamak için zorunludur. - Fareyi 10-12 gün sonra aşırı dozda Fentobarbital (182.2 mg/kg) kullanarak explantation ötenazi.
4. histolojik analizi: Hematoksilen ve Eozin boyama
- %4 paraformaldehyde (PFA) kullanarak alınan omenta düzeltmek ve parafin içinde embed.
- Bölüm 4 µm kalınlığında kesilmiş ve Hematoksilen ve Eozin leke nakli morfolojik değerlendirilmesi için geçerlidir.
5. istatistiksel analiz
- İstatistiksel anlamlılık istatistiksel analiz yazılımı ve tekrarlanan ölçüler Varyans analizi (ANOVA) kullanarak Tukey'nın dürüst önemi fark test ile bir öğleden hoc test olarak belirleyin. P değerleri olarak temsil: *p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001.
Representative Results
İzleme yöntemi intravasküler implantasyon kaçınma ve adacıklar doğumdan bir organ izin verir. 8-10 dk en fazla bir zaman anestezi, dahil olmak üzere tüm adacık implantasyon yordam için gerekli olan bir zaman çizelgesi klasik karaciğer nakli için karşılaştırılabilir.
Adacıkları omental doku içinde dağıtıldığı şekilde çalışmaya dextran boncuk (Şekil 2) izleme yöntemiyle nakledilen. Bir gün sonra implantasyon, sıçan kurban edildi ve omental doku histolojik analiz için alınan. Hematoksilen ve Eozin boyama doku (Şekil 2sağ alt) boyunca boncuk tekdüze dağılım ortaya koydu. Çoğu zaman, boncuk yakın kan damarları ve yağ dokusu iyi implante vardı. İmplantasyon hemen sonra etrafında doku adacıkları iç içe geçirmek için doku düzenlenmesi sonuçlanan boncuklar, inflamatuar reaksiyon oluşur.
Şekil 2: yön belirleme tekniği ve boncuk üzerinden dağıtım omental doku implantasyonu sonrası bir gün açıklaması. (A)yön belirleme tekniği Illustration. Organ maruz kaldıktan sonra (A, solda), (mavi renkli dextran boncuk daha iyi görselleştirme için tarafından değiştirilmiştir) adacık hidrojel mix dikkatle Atravmatik iğne (bir, orta) kullanarak doku enjekte ettiler. Doku implante boncuk görünür (A, sağ) vardır. (B) Hematoksilen ve Eozin Omentumun boyama 1 gün sonra boncuk enjeksiyon explanted. Boncuk tekdüze dağılım ile doku bulunur. Ölçek çubuğu = 100 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Biz isogenic çalışmalar Lewis sıçan kullanarak gerçekleştirilen bu teknik doğrulamak için (n = 8). Diyabetik sıçan adacık nakli (7660 adacık eşdeğeri, IEQ) posta kullanarak kg sıçan vücut ağırlığı alma glycemia ve C-peptidemia için iki ay için takip. Glycemia ( şekil 3Aiçinde gözlenen glycemia ilk düşüş için tasdik) olarak insülin Pelet implantasyonu tarafından kontrol ediliyordu. Greft işlevi tarafından yaklaşık 2 g/L ve C-peptidemia glycemia yansıyan > 500 pM. Nakli önce fareler diyabetik (kolestorol > 5 g/L ve C-peptidemia < 200 pM). Transplantasyon ve insülin Pelet alma sonra glycemia bakım ve normalleştirme sadece 3 gün nakli sonrası hOMING gözlendi ve greft alımı (p < 0,05 düzeyleri önceden nakli için karşılaştırıldığında) kadar devam edildi. Omental explantation sonra glycemia tekrar hOMING tarafından nakledilen adacıklar işlevine tasdik öncesi nakli düzeyi yükseldi (şekil 3A). C-peptidemia model tam tersi ardından bir artış ve bakım çalışma seyri boyunca artan bu düzeyde greft, daha önce tespit edilemez düzeylere düşük olduğunu (p < 0,05) ve sonra omental explantation, bir düzeyleri (şekil 3B) önceden nakli için azaltın. Histoloji tarafından explanted Omentumun analizi son derece yeniden bozukluklarına adacıkları, olasılıkla yakınlıkları kan damarları (şekil 3 c) bir sonucu olarak ortaya koydu.
Resim 3: iki aylık metabolik takip yolu bulabilen ve greft değerlendirme alma sıçan. (A)Glycemia ölçüm ve (B) C-peptid değerlendirme aljinat bir adacık taşıyıcı olarak posta sonra (Tx: transplantasyon ve insülin Pelet alma; Explantation: Explantation, Omentumun). Greft normoglycemia bakım tarafından insülin Pelet alma sonra gösterildiği gibi işlevsel ve C-peptidemia içinde adacık implantasyon sonra artış. Gri gölgeli alanlarda, her zaman bir noktada minimal ve maksimal kayıtlı değerleri temsil eder. (C) Hematoksilen ve Eozin omental bir bölümünü izleme yöntemini kullanarak adacık nakli sonra boyama. Adacıkları iki ay sonra implantasyon olmadan herhangi bir çevreleyen fibrotik doku doku iyi entegre. Gemiler etrafında ve içinde adacıkları, oklarla gösterildiği gibi büyüdü ve böylece tamamen adacık işlevi geri yüklemek. Morfoloji adacıklar da iyi korunmuş gibi görünüyor. Ölçek çubukları 50 µm. = (n = 8) (*p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 tekrarlanan ölçüler Varyans analizi (ANOVA) kullanarak Tukey'nın dürüst önemi fark test ile bir öğleden hoc test olarak belirlenen). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bazı kritik adımlar bu protokol için vurgulanabilir. İlk olarak, kırılgan olduğu gibi ameliyat ve doku manipülasyonu kişi yağ dokusu ile hassas olması gerekir. Kırma veya Omentumun zarar kaçınılması gerekir. Omentumun, savunma bir doku, makrofajlar ve diğer lökositler zenginleştirilmiştir. Bu bağışıklık hücreleri tarafından aşırı manipülasyon etkinleştirilebilir ve greft olumsuz yönde etkileyebilir. İkinci olarak, yükleme greft (adacık hidrojel karışımı) da önemlidir. Yordamı gerçekleştiren kişi ölü birimleri kaçınmak gerekir ve tüm hidrojel adacık karışımı enjeksiyon aygıtı yüklemeniz gerekir. Hemen bu adımdan sonra başka bir kritik nokta enjeksiyon kendisi olduğunu. Enjeksiyon yavaş yavaş, dikkatli ve kibar bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Şırınga kalan herhangi bir adacıkları almak için başlangıçta yüklenen boş hidrojel tarafından kopyalanması gerekir. Üçüncü olarak, dikiş özenle ve iki adımda yapmanız gerekir. Kas planı ilk olarak, kas ile Omentumun dikiş değil için dikkat çekici sütüre ve cilt ayrı ayrı sütüre. İle ilgili explantation yordam omental greft için özel dikkat ne zaman mide (Gastroepiploik arterleri) yakın arterler basamağında şu anda alınmalıdır. Ortaya ve onları birkaç gün içinde hayvan ölüm kalıcı herhangi bir kanama neden olarak hayvan, dikiş önce durdurmak herhangi bir kanama dikkat etmek önemlidir.
Sorun giderme ile ilgili orta adacıkları taşımak için gerekli olabilir; hidrojel enjekte edilebilir olduğu sürece hidrojel deneyci kadar seçimdir. Farklı malzeme kullanımı değişken yol açabilir grefti işlevi (ile ya da ezelî takviyesi, örneğin). Burada açıklanan yöntemi 7660 IEQ/kg bir adacık oranında etkisiz co nakli malzeme için verimlilik kanıtlamıştır.
Mevcut yöntemi omental boyutu ve hidrojel özellikleri ile sınırlı. Diyabetik bir kemirgen modeli kullanmak için yeterli aşılama alan sağlamak için adacık implantasyon öncesinde insülin tedavisi zorunludur. Diyabetik kemirgenler ağırlığı ve yağ kitlesi STZ kaynaklı diyabet nedeniyle bir çok şey kaybettin. Bu çalışmada kayıtlı hayvanlar küçük ağırlığını göz önüne alındığında, daha küçük bir alanda aşılama mümkün değildir.
Uygun glycemia Yönetimi (önce granül ve bundan sonra uzun etkili insülin kullanarak nakli) korunması zorunludur. Burada, insülin Pelet nakli güne çeşitli nedenlerden dolayı kadar tasarruf etmek seçtik. İlk olarak, uygun Glisemik kontrol bakım önemli ölçüde diyabet adacık nakli11 için zararlı olabilir ve yoğun insülin tedavisi ve alıcı devamı sağlayan alıcı organlarında tarafından indüklenen oksidatif stresi azaltır Klinik12içinde gözlenen hazırlık. İkinci olarak, anestezi yordamlar fareler için en fazla sayısını sınırlama istedim. Uzun etkili insülin kullanma metabolik takip sırasında insülin tedavisi uygulanması ile ilgili olarak kullanılan düzeni büyük komplikasyonlar nedeniyle (da Greftler yok eden) glucotoxicity ve bir "gerçek" glycemia değer korumak için kaçınılmalıdır.
Fareler granül kullanarak insülin tedavisi alıyorsanız greft etkinliğini izlemek için glycemia ilgili bir parametre ilk birkaç gün içinde değil. Bu nakli için C-Peptid Düzeyi birkaç kez önceden zorunludur kontrol nedeni budur. Bu kez hayvanları STZ enjeksiyon sonra seçmek için çalışma, başlangıç ve sonra sadece önceki nakli fareler diyabetik kalır ve yeniden oluşturma işlemi en az olduğundan emin olun, sonunda içerir.
Hidrojel özellikleri de önemlidir. Sıvı hidrojel omental doku dışarı sızıntı olacaktır ve yüksek viskoz hidrojel enjekte edilebilir olmayacaktır. Hidrojel viskozite ve injectability var kullanmadan önce test edilecek, ancak aynı zamanda doğrudan adacık veya başka bir hücre survival tüp bebek değerlendirilmesi tarafından malzeme test etmek için gerekli görünüyor. Burada, adacıkları hipoksi ve yüksek viskoz bir taşıyıcı kullanımı için çok hassas olduğu gibi Oksijen difüzyon etkileyebilir.
Burada mevcut yöntemleri ile ilgili olarak anlatılan yöntemi önemi açısından, bu içi doku nakli tekniği içinde dönem-in tekrarlanabilirlik faydası vardır. Aynı zamanda Atravmatik için doku ve, ekstra vasküler konumu nedeniyle, kanama ve tromboz risk önler. Ayrıca, adacık nakli dikkate alınarak, anında kan-aracılı inflamatuar kaçınılmalıdır14tepkidir. Ayrıca, posta içine içine hepatik fonksiyon15açısından riskine de yol açar karaciğer nakli aksine sigara hayati bir organ adacıkları nakli sağlar.
En iyi performans üretmek için bir hidrojel taşıyacak hücrelere adapte zorunda. Büyüme faktörleri veya spesifik proteinlerin transplante hücreleri16,17üzerinde olumlu bir etkisi olabilir.
Özellikle etkin bir metabolik ortam, adacıkları gelince gerekli olduğunda sonuç olarak, bu teknik bir hidrojel farklı hücre tipleri, tarih içinde vivo doğrulama için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu cerrahi teknik birden çok uygulamaları için geçerli ve gelecekte, insanlar için laparoskopi kullanarak kolayca gerçekleştirilebilir hızla transfer olabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Région Alsace, BioArtMAtrix-Pôle Alsace Biovalley-CQDM tarafından finanse edildi; 53/14/C1. Yazarlar bu yenilikçi tekniği geliştirmek yardımcı olduğunuz için Hôpitaux Universitaires de Strasbourg takım halkla ilişkiler Bruant-Rodier, minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
| Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
| CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
| C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
| Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
| Ethilon 4/0 | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
| Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
| Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
| Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
| Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
| NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
| Needle 26 G | TERUMO | 050101B | |
| Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
| Sodium pentobarbital | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
| Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
| Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
| Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
| Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |
References
- Bakhshandeh, B., et al. Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials. Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
- Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A.
- Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced healthcare materials. 2, 57-71 (2013).
- Bai, X., et al. Bioactive hydrogels for bone regeneration. Bioactive Materials. 3, 401-417 (2018).
- Allbright, K. O., et al. Delivery of adipose-derived stem cells in poloxamer hydrogel improves peripheral nerve regeneration. Muscle Nerve. , (2018).
- Van Der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N. M., Cooper, D. K. C. The Choice of Anatomical Site for Islet Transplantation. Cell transplantation. 17, 1005-1014 (2008).
- Zweifach, B. W., Lipowsky, H. H. Quantitative studies of microcirculatory structure and function. III. Microvascular hemodynamics of cat mesentery and rabbit omentum. Circ Res. 41, 380-390 (1977).
- Bruant-Rodier, C., Dissaux, C., Baratte, A., Francois Fiquet, C., Bodin, F.
- Schaschkow, A., et al. Extra-Hepatic Islet Transplantation: Validation of the h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) Technique on a Rodent Model Using an Alginate Carrier. Cell transplantation. 27, 1289-1293 (2018).
- Schaschkow, A., et al. Impact of the Type of Continuous Insulin Administration on Metabolism in a Diabetic Rat Model. Journal of diabetes research. 2016, 8310516 (2016).
- Schaschkow, A., et al. Impact of an autologous oxygenating matrix culture system on rat islet transplantation outcome. Biomaterials. 52, 180-188 (2015).
- Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an Islet Cell Resources study. Clinical transplantation. 24, 236-242 (2010).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver microenvironment. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 30, 227-238 (2017).
- Leitao, C. B., et al. Liver fat accumulation after islet transplantation and graft survival. Cell transplantation. 23, 1221-1227 (2014).
- Narang, A. S., Mahato, R. I. Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation. Pharmacological reviews. 58, 194-243 (2006).
- Alvarado-Velez, M., Pai, S. B., Bellamkonda, R. V. Hydrogels as carriers for stem cell transplantation. IEEE Trans Biomed Eng. 61, 1474-1481 (2014).
