Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

doi: 10.3791/58938 Published: January 20, 2019

Summary

نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية زيموجرافيك معدلة التي تستخدم الببتيدات فلوري كالركيزة القابلة للتحلل بدلاً من البروتينات الأصلية. التفريد العينات البيولوجية في الببتيد نيون زيموجرامس تمكن من كشف طائفة أوسع من البروتياز تقنيات زيموجرافيك السابقة.

Abstract

والغرض من هذا الأسلوب لقياس النشاط proteolytic العينات البيولوجية المعقدة. يتم فصل العينات بالوزن الجزيئي باستخدام التفريد من خلال حل جل المضمنة مع ركيزة القابلة للتحلل. يختلف هذا الأسلوب عن زيموجرافي هلام التقليدية في ببتيد فلوروجينيك مروي تساهمي أدمجت في جل حل بدلاً من كامل طول البروتينات، مثل الجيلاتين أو الكازين. استخدام الببتيدات فلوروجينيك تمكن من كشف مباشرة من نشاط proteolytic دون خطوات إضافية المصبوغة. الإنزيمات في عينات بيولوجية تنشق الببتيد فلوروجينيك مروي، أدى إلى زيادة في الأسفار. إشارة مضيئة في المواد الهلامية ثم تصويرها مع ماسح ضوئي جل فلورسنت قياسية وكمياً باستخدام قياس كثافة. استخدام الببتيدات كالركيزة القابلة للتحلل يوسع إلى حد كبير البروتياز المحتملة القابلة للاكتشاف مع تقنيات زيموجرافيك.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

زيموجرافي هلام تقنية بيولوجية المستخدمة لقياس النشاط proteolytic داخل العينات البيولوجية، مثل سوائل الجسم أو الخلية وسائط الثقافة1،،من23. يتم فصل العينات أوزانها الجزيئية مع التفريد خلال جل polyacrylamide المضمنة مع ركيزة القابلة للتحلل. وتشمل مشتركة الركازات التحلل الجيلاتين، الكازين، الكولاجين والايلاستين، التي استخدمت لقياس نشاط ميتالوبروتيناسيس مصفوفة (يتولى)-1،-2،-3،-7،-8،-9، و-11، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من كاثيبسينس1،2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8-بعد التفريد، الإنزيمات ريناتوريد وسمحت للحط من البروتين داخل الجل. في زيموجرافي هلام التقليدية، الهلام هو ملطخة بصبغة بروتين، مثل أخذ الأزرق، وتم الكشف عن نشاط البروتياز كفقدان إشارة، وعصابات (تحلل البروتين) أي أبيض على خلفية زرقاء داكنة.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لطريقة بديلة لجل زيموجرافي، الذي الركيزة القابلة للتحلل قصيرة، الببتيد فلوروجينيك تساهمي أدرجت في جل polyacrylamide (الشكل 1). الاستعاضة عن الببتيدات الاصطناعية كركائز للتحلل تمكن من كشف مجموعة أوسع نطاقا من البروتياز بالمقارنة مع زيموجرافي هلام التقليدية مع البروتينات الأصلية9. الروابط التساهمية من الببتيد فلوروجينيك يمنع نشر الببتيد والهجرة أثناء التفريد جل لاحظ مع الأساليب السابقة9،10. علاوة على ذلك، يمكن استخدام الركيزة فلوروجينيك الكشف المباشر لنشاط البروتياز دون تلطيخ إضافية وخطوات إزالة المصبوغة. والهدف العام لهذا الأسلوب هو الكشف عن نشاط البروتياز في العينات البيولوجية عن طريق إدماج الببتيدات فلوروجينيك في الهلام زيموجرام التساهمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-إعداد طبقة جل حل

  1. إعداد polyacrylamide 10% من حل حل جل وفقا الجدول 1. إضافة تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) وفوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) مباشرة قبل سكب الهلام كما يبدأ إضافة رد فعل البلمرة.
  2. ملء كاسيت جل مصغرة فارغة 1.5 مم نصف الطريق (5 مل) مع حل جل حسم 10 في المائة.
  3. إضافة طبقة رقيقة من الايزوبروبانول (~ 500 ميليلتر) إلى الجزء العلوي من جل polyacrylamide لإنتاج هلام مستوى ومنع الفقاعات. استخدم الحل polyacrylamide بقايا لتتبع التقدم المحرز في تفاعل البلمرة. عندما بولياكريلاميدي في الأنبوب قد وطدت تماما، رد فعل كاملة (~ 40 دقيقة).

2-إعداد الجزيء رابط أزيدو-PEG3-ماليميدي

  1. بينما حل جل الطبقة الأولى هو مبلمرة، استرداد كيت أزيدو-PEG3-ماليميدي من التخزين-20 درجة مئوية والسماح للمكونات لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. تجدر الإشارة إلى أن هناك عنصرين في كل مجموعة. قنينة 1 يحتوي إستر ماليميدي--دائرة الصحة الوطنية، البيض إلى رمادي صلب. فيال 2 يحتوي على أزيدو-PEG3-أمين، زيت أصفر قليلاً.
    ملاحظة: يقترح المؤلفون استخدام كيت أزيدو-PEG3-ماليميدي 25 ملغ كما يمكن تخزينه فقط لفترات قصيرة من الوقت (1-2 ساعة) في-20 درجة مئوية بعد إعداده قبل أن تبدأ أن تتحلل. 25 ملغ كافية لإنتاج 10 الببتيد الهلام. استخدام المواد الهلامية في غضون 3 أسابيع التحضير.
  2. حل مكونات 2 قنينة في الشركة المصنعة وأوصى حجم ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) ودوامه لمدة 30 s لضمان السوائل متفاوتة أيضا.
  3. نقل محتويات 1 قنينة إلى قارورة مستديرة قاع نظيفة وجافة 100 مل التي تحتوي على شريط إثارة.
    ملاحظة: شطف قارورة مع الأسيتون وجاف تماما قبل الاستخدام لمنع الرطوبة من التداخل مع رد فعل.
  4. فورا إدراج سداده الغشاء المطاطي مع غشاء يمكن تثقيب مع حقنه في فم قارورة. العمل بسرعة للحيلولة دون دخول في قارورة الرطوبة.
  5. إدراج اثنين 18 قياس المحاقن الإبر إلى الحجاب الحاجز والاتصال واحد إلى خزان غاز خامل (مثل غاز الأرجون). السماح غاز خامل لملء قارورة للحد الأدنى 3 مزيج مكونات قنينة 1 و 2 تحت غاز خامل لمنع منتجات رد فعل غير مرغوب فيها.
    تنبيه: إبرة حقنه الثاني توفير تنفيس، مما يسمح للهواء الجوي داخل قارورة تتدفق من قارورة حيث يملأ بغاز خامل. لا تنسى أن تدرج إبرة تنفيس!
  6. إيقاف غاز خامل ويفصله من الإبرة. استخدام المحاقن، حقن كامل محتويات قنينة 2 قارورة.
  7. إزالة الإبر والمحاقن، والسماح للعناصر المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما التحريك.
  8. إزالة سداده الغشاء المطاطي ونقل المحتويات إلى أنبوب الطرد مركزي نظيفة 5 مل. يجب أن تستخدم الحل أزيدو-PEG3-ماليميدي 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

3-إعداد الببتيد حل طبقة هلام

  1. بمجرد حل أول جل قد بلمرة طبقة، من أجل إيقاف طبقة الايزوبروبانول. شطف الجزء العلوي من الجل من بيبيتينج 1 مل من المياه على رأس الجل وثم صب قبالة المياه.
  2. استرداد الببتيد نيون فونكتيوناليزيد ثيول من مخزن-80 درجة مئوية، والسماح لها بالذوبان في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن تحضير الببتيد فونكتيوناليزيد ثيول كما هو موضح سابقا11،12. الببتيدات متوفرة تجارياً يمكن أن تستخدم أيضا ولكن تتطلب إضافة بقايا سيستين المحطة الطرفية لتمكين ماليميدي-ثيول انقر فوق رد. حل الببتيد إلى تركز أسهم من 10 ملم وتخزينها في-80 درجة مئوية في مختبرين (30 ماي) الصغيرة للحد من دورات تجميد أذاب المتكررة.
  3. إعداد 10 ٪ حل جل محلول يحتوي على جزيء رابط أزيدو-PEG3-ماليميدي والببتيد الفلورسنت وفقا الجدول 1. إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية فورا قبل سكب الهلام كما يبدأ إضافة رد فعل البلمرة.
  4. ملء نصف الجزء المتبقي من كاسيت هلام (3 مل) مع الببتيد حل جل الحل.
    ملاحظة: اتباع نهج متعدد الطبقات جل حل يقلل من كمية الببتيد ورابط اللازمة لكل جيل. يمكن ضبط حجم طبقة جل حل الببتيد لاستيعاب أكبر مجموعة من الأوزان الجزيئية حسب الحاجة.
  5. "الماصة؛" طبقة رقيقة من الايزوبروبانول (~ 500 ميليلتر) إلى الجزء العلوي من جل polyacrylamide لإنتاج هلام مستوى ومنع الفقاعات. استخدم الحل polyacrylamide بقايا لتتبع التقدم المحرز في تفاعل البلمرة. عندما بولياكريلاميدي في الأنبوب قد وطدت تماما، رد فعل كاملة (~ 40 دقيقة).
    ملاحظة: الببتيد نيون حساسة للضوء. الحفاظ على المواد الهلامية مغطاة برقائق الألومنيوم لمنع فوتوبليتشينج أثناء إعداد جل والتفريد والغسيل والتنمية.
  6. من أجل إيقاف طبقة الايزوبروبانول وشطف الجزء العلوي من الببتيد حل جل مع المياه. كما في الخطوة 3، 1.
  7. إذا كان استخدام المواد الهلامية على الفور، انتقل إلى الخطوة 4، خلاف ذلك، تزج استعداد المواد الهلامية في 100 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية في علبة بلاستيكية لمنع المواد الهلامية من الجفاف. التفاف المربع في رقائق الألومنيوم لمنع فوتوبليتشينج. ويمكن تخزين المواد الهلامية في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى 3 أسابيع قبل الاستخدام.

4-إعداد التراص هلام

  1. إعداد حل جل تراص 5% وفقا الجدول 1. إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية فورا قبل سكب الهلام كما يبدأ إضافة رد فعل البلمرة.
  2. ملء الجزء المتبقي فارغة من كاسيت هلام (~ 2 مل) مع حل جل التراص.
  3. بسرعة إدخال مشط جل 1.5 مم في طبقة جل التراص، والتأكد من أي فقاعات لا تزال المحاصرين تحت الآبار. استخدم الحل polyacrylamide بقايا لتتبع التقدم المحرز في تفاعل البلمرة. عندما بولياكريلاميدي في الأنبوب قد وطدت تماما، رد فعل كاملة (~ 10 دقيقة).
  4. إزالة بلطف المشط والشريط من الجزء الخلفي كاسيت هلام.

5-إعداد العينات البيولوجية للتفريد

  1. إعداد الوسائط المحمولة مكيفة وخلية ليساتيس، homogenates الأنسجة ومعايير نظام التمثيل التناسبي المختلط كما هو موضح في مكان آخر تحت ظروف غير الحد2. لا تسخين عينات.
  2. على سبيل المثال، تعد الخلية مكيفة وسائل الإعلام على النحو التالي:
    1. لوحة 40,000 الخلايا/سم2 الخلايا الموجودة في لوحة 6-جيدا في 10% مصل بقرى الجنين (FBS) ثقافة الإعلام. احتضان خلايا في دائرة هوميديفيد (5% CO2 في 37 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة، والسماح لهم بالوصول إلى التقاء 70-80%.
      ملاحظة: إذا لم يبلغوا الخلايا كونفلوينسي المرجوة بعد 24 ساعة، تسمح لهم بالنمو في 10% FBS ثقافة وسائل الإعلام عن 24 ساعة إضافية.
    2. تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل وسائط ثقافة خالية من المصل. احتضان الخلايا في دائرة هوميديفيد (5% CO2 في 37 درجة مئوية) ل 24 ساعة إضافية.
    3. استخدام ماصة مصلية، جمع وسائل الإعلام مكيفة من كل بئر. الطرد المركزي وسائط الإعلام 1200 لفة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لإزالة أي حطام الخلايا. تأخذ المادة طافية والتركيز على استخدام 15 مل، والوزن الجزيئي كاتشين 10 قطع تصفية الطرد المركزي وحدة. الطرد المركزي وحدات التصفية في 4000 x ز لمدة 15 دقيقة في دوار دلو يتأرجح أو 5,000 ز س لمدة 15 دقيقة في دوار زاوية ثابتة.
      ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولكن يمكن تعزيز كثافة العصابات proteolytic في الهلام زيموجرافي الببتيد.
    4. نقل filtrate تتركز على أنبوب الطرد مركزي طازجة 1.5 مل. قاسمة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاث دورات تجميد أذاب.
  3. التحديد الكمي لمحتوى البروتين باستخدام تحليل الكمي بروتين قياسية (مثل اتفاق التعاون الأساسي، "مقايسة برادفورد"، إلخ).

6-التفريد البيولوجية عينات في الهلام زيموجرافي الببتيد

  1. حل عينات في المخزن المؤقت لنموذج زيموجرافي التقليدية (62.5 مم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، والغليسيرول 25%، 4% الحزب الديمقراطي الصربي، 0.01 ٪ بروموفينول الأزرق). لعينات الخلايا والأنسجة، من المستحسن ~ 30 ميكروغرام من البروتين الكلي للبئر، و 50-100 نانوغرام من البروتين لمعايير نظام التمثيل التناسبي المختلط.
  2. إضافة 400 مل 1 × تريس-جليكاين "الحزب الديمقراطي الصربي تشغيل المخزن المؤقت" لجهاز هلام. تحميل يصل إلى 35 ميليلتر للعينة الواحدة جيدا. تشغيل العينات في 120 V في 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة أو حتى بمعايير الوزن الجزيئي تشير إلى أن البروتياز الاهتمام داخل الببتيد حل طبقة هلام (التي لون برتقالي مرئية).
    ملاحظة: يتولى معظم وأشكالها تقع ضمن نطاق كاتشين 35-100. عندما معايير الوزن الجزيئي تشير إلى أن هذه الأوزان داخل الببتيد حل طبقة هلام، يمكن إيقاف التفريد. يمكن تطبيق نفس المبدأ على فئات أخرى من البروتياز مع الأوزان الجزيئية المعروفة. إذا لم يكن هناك مصلحة في الكشف عن البروتياز متعددة على نطاق أكبر من الأوزان الجزيئية، تقليل حجم طبقة جل حل وزيادة حجم طبقة جل حل الببتيد.
  3. وبعد التفريد، إزالة المواد الهلامية من الكاسيت البلاستيك وتغسل الجل ثلاث مرات لكل 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات لطيف في المخزن المؤقت ريناتورينج التي تحتوي على 2.5% X-100 تريتون و 1 ميكرومتر زنكل2و 5 مم كاكل2 في 50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5.
  4. نقل المواد الهلامية إلى حل نامية المخزن مؤقت الذي يحتوي على 1% X-100 تريتون، 1 ميكرومتر زنكل2 والمخزن المؤقت الحل كاكل 5 مم2 في 50 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5 لاستبدال 15 دقيقة مع وضع جديد واحتضان المواد الهلامية في 37 درجة مئوية تحت الانفعالات لطيف لمدة 24 ساعة ، مع التأكد من أن المواد الهلامية هي سوبميرسيد تماما في الحل.

7-تصوير زيموجرافي الببتيد والهلام

  1. بعد 24 ساعة، جل الجل الصورة فلوري باستخدام الماسح الضوئي/جهاز التصوير باستخدام عوامل التصفية المناسبة الإثارة والانبعاثات. على سبيل المثال، المواد الهلامية الببتيد سيظهر في نتائج الممثل هي مترافق مع Fluorescein وتم تصويرها باستخدام عامل تصفية إثارة من 488 نانومتر وعامل تصفية انبعاثات من 521 شمال البحر الأبيض المتوسط. استخدام عوامل التصفية المناسبة لجهاز فلوروفوري سوف تعظيم الكشف عن نشاط بروتيوليتيك.
    ملاحظة: يمكن أن تؤخذ الصور أيضا مع تصوير جل مجهزة ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية، غالباً ما تستخدم لتصوير الحمض النووي الهلام الملون مع اثيديوم بروميد. صورة الجل استخدام ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) الإعداد وعامل تصفية انبعاثات من 590 نانومتر.
  2. إجراء تقييم دينسيتوميتريك للفرقة كثافات استخدام إيماجيج كما هو موضح في مكان آخر من13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

استخدام الطريقة الموصوفة هنا، واثنين من الببتيدات حوزتي التحلل الفلورسنت أدرجت في الهلام polyacrylamide: GGPQG↓IWGQK(PEG)2ج (مختصر النحو قجيو في جميع أنحاء النص والأرقام) و GPLA↓CبميوبزلWARK(PEG)2 (ج) (مختصر النحو لاكو طوال النص والأرقام). ↓ يشير إلى الموقع للانقسام. قجيو هو الكولاجين--أنا مشتقة تسلسل مصممة للكشف عن collagenases الخلوية14. لاكو هو سلسلة التي تم الأمثل للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط-14 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-1115. تتم تسمية الببتيدات مع دابسيل (تقضي) وفلوريسسين (فلوروفوري) باستخدام N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS)-إستر-أمين الكيمياء11. يمكن أن يكون من الصعب تطوير الببتيدات فلوروجينيك الجديدة التي تبريد fluorescence كافية وقابلة للذوبان في المخازن المؤقتة قياسية. ولذلك، تكييف الببتيد تسلسل من ركائز حوزتي الفلورسنت المتاحة تجارياً تشمل سيستين طرفي ج غالباً استراتيجية ناجحة لتطوير أجهزة استشعار جديدة فلوروجينيك. لإثبات قدرة زيموجرافي الببتيد لفصل المخاليط حوزتي المعقدة، جمعت الوسائط مكيفة من سطرين خلية السرطان المختلفة. كانت مطلي HT1080 فيبروساركوما الخلايا ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا غدية الثدي في 10% FBS وسائل الإعلام لمدة 24 ساعة، بعد الذي استعيض عن وسائط الإعلام مع وسائل الإعلام الحرة المصل ل 24 ساعة إضافية. جمعت عينات وسائل الإعلام المكيفة ويتركز استخدام 10 وحدات تصفية الطرد المركزي الانقطاع في الوزن الجزيئي كاتشين. تم قياس محتوى البروتين من وسائط الإعلام مقايسة µBCA قياسية باستخدام. كانت اليكتروفوريسيد 30 ميكروغرام من البروتين من وسائل الإعلام مكيفة. كعناصر إيجابية، الآبار مع نوع أنا كولاجيناز البكتيرية (100 ميكروغرام) أو تنقيتها، وتنشيط نظام التمثيل التناسبي المختلط-9 (125 نغ) أدرجت أيضا. وكانت المواد الهلامية المحتضنة ل 24 ساعة في وضع المخزن المؤقت للسماح بالانقسام ونظام التمثيل التناسبي المختلط من ركائز التحلل داخل المواد الهلامية (الشكل 2) وثم تصويرها. وكشف التصوير الفلورسنت عصابات عديدة كانت مرئية داخل الجل الببتيد لاكو (2A الشكل14)، بينما عصابة واحدة فقط كان واضحا داخل الجل قجيو (2D الشكل14). بالمقارنة مع زيموجرافي الجيلاتين (2 الشكل14)، المواد الهلامية لاكو كانت قادرة على الكشف عن عصابات proteolytic أكثر، مما يدل على قدرة زيموجرافي الببتيد للكشف عن مجموعة أوسع نطاقا من البروتياز موجودة داخل عينات بيولوجية من ركائز الأصلي باستخدام الأساليب التقليدية.

للتحقق من هوية العصابات تصور كما يتولى، كانت المحتضنة الببتيد زيموجرافي المواد الهلامية في المخزن المؤقت للتنمية التي تتضمن أما مكم 20 GM6001، مثبط MMP واسعة الطيف، أو 10 ميكرون E-64، مثبط كاثيبسين عامة. معاملة الببتيد لاكو الهلام مع GM6001 (الشكل 214) انخفضت كثافة العصابات، بينما العلاج مع E-64 (الشكل 214) لم يكن لها تأثير ملموس. معاملة المواد الهلامية الببتيد قجيو مع GM6001 أدى إلى الاستئصال الكامل للعصابات شهدت سابقا (2E الشكل14). كما كان متوقعا، لم E-64 أي أثر (2F الشكل14). في كل المواد الهلامية الببتيد، GM6001 تحول دون تنقية النشاط MMP-9 ولكن لم تؤثر على نشاط كولاجيناز البكتيرية، وكذلك التحقق من أن تصور زيادة الأسفار كان نتيجة proteolytic النشاط الذي يتولى موجودة داخل البيولوجية المختبرة عينات.

لمقارنة حساسية زيموجرافي الببتيد إلى معيار الذهب الحالي، زيموجرافي الجيلاتين، أجرى تحليل حساسية استخدام المنقاة، وتفعيل نظام التمثيل التناسبي المختلط-9. كانت اليكتروفوريسيد تخفيف المسلسل من نظام التمثيل التناسبي المختلط-9 (1-250 نانوغرام) في الهلام زيموجرافي لاكو، قجيو والجيلاتين (3A الشكل14). أثر التنمية وتصوير فلوري، كثافات موسيقى كانت كمياً مع إيماجيج وقطع كثافة طبيعية الفرقة تم إنشاؤها لحساب المفوضية الأوروبية50 تركيز القيم، التي تنتج 50% الإشارات كحد أقصى (الشكل 3B 14)-الجل الببتيد لاكو كانت قادرة على الكشف عن تركيزات أصغر من نظام التمثيل التناسبي المختلط-9، بقيمة50 EC 17.28 نغ، بالمقارنة مع زيموجرامس قجيو والجيلاتين مع قيم 59.50 نغ و 31.85 نغ، على التوالي. وتشير هذه البيانات إلى أن استخدام الببتيد زيموجرافي يمكن يطابق أو يتجاوز حدود حساسية من ركائز الأصلية مثل الجيلاتين.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي لعملية زيموجرافي الببتيد الفلورسنت. (أ) إعداد polyacrylamide متعدد الطبقات حل جل. معيار 10 ٪ حل حل جل المستخدمة لتكوين الطبقة الأولى من جل زيموجرافي الببتيد. حسم 10% الثانية جل الطبقة التي تحتوي ببتيد مروي، فلوري وهو ثم بلمرة جزيء رابط أزيدو-PEG3-ماليميدي على رأس الطبقة الأولى. الطبقة العليا النهائي 5% هلام تراص. التفريد القياسية (ب) تحت الحد من غير شروط يتم استخدامه لفصل العينات المحتوية على حوزتي في الهلام بولياكريلاميدي فونكتيوناليزيد. المواد الهلامية تغسل لإزالة مخزونات النشر الاستراتيجي والسماح للبروتينات إلى ريناتوري. ثم هي المحتضنة المواد الهلامية في المخزن مؤقت تنمية عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، السماح البروتياز تهزم الببتيدات فلوروجينيك، أدى إلى زيادة الأسفار. هذه الأسفار، تتناسب مع نشاط البروتياز، يتم التقاطها ثم استخدام تصوير جل فلورسنت إثارة من 488 نانومتر والانبعاثات من 521 نانومتر (مواءمة مع إذن من المشتغلون وعلوم المستقبل14). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الكشف عن الخلية يفرز البروتياز في خطوط خلايا السرطان البشرية. تحليل لأنزيم كولاجيناز (100 ميكروغرام)، نظام التمثيل التناسبي المختلط-9 (125 نغ) وتكييف وسائل الإعلام خلية من HT1080 فيبروساركوما (30 ميكروغرام) وجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 غدية الثدي خطوط الخلايا السرطان (30 ميكروغرام) في المواد الهلامية الببتيد لاكو وقجيو. تعامل مع [دمس] (التحكم بالسيارة) (A & D)المواد الهلامية، وتعامل مع GM6001 (ب & ه) أو تعامل مع E-64 (C & F). (ز) مكيفة الجيلاتين زيموجرام HT1080 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 خلية الإعلام (مواءمة مع إذن من المشتغلون وعلوم المستقبل14). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: مقارنة بين نظام التمثيل التناسبي المختلط-9 حساسية الببتيد والجيلاتين زيموجرامس. قجيو (A) (أعلى)، لاكو (الأوسط) والمواد الهلامية زيموجرافي الجيلاتين (أسفل) تعرضوا لتخفيف المسلسل من نظام التمثيل التناسبي المختلط-9. (ب) كانت كثافات الفرقة Normalized تآمروا ضد تركيز نظام التمثيل التناسبي المختلط-9 ومناسباً لمنحنى انحدار متغير معلمة أربعة. تشير القيم50 المفوضية الأوروبية إلى التركز في نصف إشارة الحد الأقصى. النتائج التي يتم تمثيلها ك n = 3، يعني SD (مواءمة مع إذن من المشتغلون وعلوم المستقبل14). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

حل هلام
الأسهم الأسفلت الأسفلت النهائي 5 المواد الهلامية المواد الهلامية 10
اكريلاميد/مكررا-اكريلاميد (19:1) 40% 10 ٪ 10 مل 20 مل
تريس-HCl pH 8.7 م 1 م 0.375 15 مل 30 مل
دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) 20% 0.10 في المائة 200 ميليلتر 400 ميليلتر
منزوع ح2س -- -- 14.4 مل مل 28.7
تيميد -- -- 40 ميكروليتر ميليلتر 80
وكالة الأنباء الجزائرية 10 ٪ 0.10 في المائة 400 ميليلتر 800 ميليلتر
الحجم الإجمالي 40 مل 80 مل
هلام حل الببتيد
الأسهم الأسفلت الأسفلت النهائي 5 المواد الهلامية المواد الهلامية 10
اكريلاميد/مكررا-اكريلاميد (19:1) 40% 10 ٪ 5 مل 10 مل
تريس-HCl pH 8.7 م 1 م 0.375 7.5 مل 15 مل
دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) 20% 0.10 في المائة 100 ميليلتر 200 ميليلتر
منزوع ح2س -- -- ميليلتر 6.5 مل 13
الببتيد نيون 10 ملم 75 ميكرون 150 ميليلتر 300 ميليلتر
كروسلينكير أزيدو-PEG3-ماليميدي 75 مم 1.5 مم 400 ميليلتر 800 ميليلتر
تيميد -- -- 20 ميليلتر ماي 40
وكالة الأنباء الجزائرية 10 0.10 في المائة 200 ميليلتر 400 ميليلتر
الحجم الإجمالي 20 مل 40 مل
التراص هلام
الأسهم الأسفلت الأسفلت النهائي 5 المواد الهلامية المواد الهلامية 10
اكريلاميد/مكررا-اكريلاميد (19:1) 40% 5% 2.5 مل 5 مل
تريس-HCl pH 6.9 م 1 0.125 M 2.5 مل 5 مل
دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) 20% 0.10 في المائة 100 ميليلتر 200 ميليلتر
منزوع ح2س -- -- مل 14.75 مل 29.5
تيميد -- -- 50 ميليلتر 100 ميليلتر
وكالة الأنباء الجزائرية 10 ٪ 0.10 في المائة 100 ميليلتر 200 ميليلتر
الحجم الإجمالي 20 مل 40 مل

الجدول 1: الجدول كاشف لإعداد الببتيد نيون الجل زيموجرافي. تركيزات ووحدات التخزين لإعداد جيل زيموجرافي ببتيد متعدد الطبقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تقنيات زيموجرافيك الحالية تعتمد على إدماج ركائز الأصلية في المواد الهلامية polyacrylamide للكشف عن بروتيوليسيس. بينما حصل هذه التقنيات على استخدامها على نطاق واسع، أنها لا تزال محدودة في عدد البروتياز أنها يمكن الكشف عن. هنا، كان وصف بروتوكول في الببتيدات الفلورسنت، والقابلة للتحلل البروتياز التي تدمج polyacrylamide حل جل. التساهمية اقتران باستخدام جزيء رابط أزيدو-PEG3-ماليميدي تمكين فصل والكشف عن مجموعة أوسع من البروتياز مما يمكن تحقيقه حاليا مع ركائز الأصلي. طبيعة الانضباطي درجة عالية من الببتيدات الفلورسنت يتيح للباحثين القدرة على تصميم ركائز التي يمكن أن تستهدف البروتياز بهم للفائدة. حددت عديدة الببتيد ركائز لمجموعة متنوعة واسعة من البروتياز استخدام مكتبات الببتيد، وهناك عدد متزايد من المصادر التجارية صناعة الببتيدات مخصصة. يمكن أن يكون من الصعب تطوير الببتيدات فلوروجينيك الجديدة التي تبريد fluorescence كافية وقابلة للذوبان في المخازن المؤقتة قياسية. ولذلك، تكييف الببتيد تسلسل من الناحية التجارية ركائز حوزتي الفلورسنت المتاحة تشمل سيستين طرفية ج غالباً ما استراتيجية ناجحة لتطوير أجهزة استشعار جديدة فلوروجينيك.

حين الانتهاء من هذا البروتوكول، ينبغي الحرص أثناء التعامل مع المواد الهلامية الببتيد نيون لمنع الإفراط في التعرض للضوء كهذا يمكن أن تقلل إلى حد كبير إشارة الفلورسنت تم الكشف عنها. بالإضافة إلى ذلك، يتم التركيز الحالي من الببتيد المستخدمة في كل جيل 75 ميكرون. ويمكن تعديل هذا لخفض تركيزات للحفاظ على الببتيد، مع الأخذ في الاعتبار أنه يجب إضافة الحل أزيدو-PEG3-ماليميدي للحل في المولى على الأقل 20 الزائدة إلى الببتيد. ويمكن شراء طقم أزيدو-PEG3-ماليميدي في 3 أحجام (25، 100 و 1000 مغ). يوصي المؤلفون بشراء الطقم 25 ملغ كما يمكن فقط تخزين الحل المعدة في فترات قصيرة من الوقت في-20 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، مجموعة 25 ملغ تكفي لإعداد 10 الببتيد الهلامية، التي يجب أن تستخدم في غضون 3 أسابيع التحضير.

واحد أوجه قصور زيموجرافي هو الصعوبة في التعرف على هوية العصابات حوزتي تصور نظراً للتداخل الكبير في الأوزان الجزيئية بالضبط. في المستقبل دراسات، ستكون حاسمة بالنسبة لإجراء تحليل ثانوي لتحديد الهوية استخدام تقنيات مثل الطيف الكتلي16،17. قيد آخر من زيموجرافي هو ريفولدينج للبروتينات لما تكيف نشطة أثر يشوه جزئية من الحزب الديمقراطي الصربي والتفريد. هذه العمليات يمكن أن تسبب تغييرا في تكيف النشطة في حوزتي، تقديم البروتينات بروتيوليتيكالي الخاملة، نشط. على سبيل المثال، يمكن اكتشاف برو-MMP-2 في زيموجرامس الجيلاتين على الرغم من وجود الواجب سليمة المؤيدة المجال المثبطة لما ريناتوريشن بشكل نشط وسيطة. أساليب تكميلية مثل المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) أو "اسطوانات الغربية يقوم" يمكن استخدامها لتحديد هوية ووجود مجموع من مبطلات للفائدة.

يوضح هذا المقال استخدام الببتيد نيون ركائز لتعزيز حساسية التقنيات الحالية التي زيموجرافيك. باستخدام نظام التمثيل التناسبي المختلط المنقي-9، أجرى تحليل الانحدار تركيز مقارنة لاكو، قجيو والجيلاتين الهلام زيموجرافي. حاليا، هو زيموجرافي الجيلاتين تقنية معيار الذهب الذي جيلاتيناسيس (MMP-2 و-9) وتكتشف في عينات بيولوجية. مقارنة قيم50 EC ركائز ثلاث، كان الجل الببتيد لاكو قيم أدنى، مشيراً إلى حساسية أعلى. استخدام تسلسلات الببتيد مختلفة مصممة للكشف عن البروتياز محددة يمكن أن يحتمل أن تعزز هذه الحساسيات أبعد. يمكن أيضا استخدام معاملة المواد الهلامية مع عامل تفعيل نظام التمثيل التناسبي المختلط مثل اسيتات 4-أمينوفينيلميركوريك (أبما) أو الهيبارين لزيادة إشارة ضعيفة كما هو موضح سابقا18.

بالإضافة إلى قياس نشاط البروتياز للدراسات البيولوجية، الببتيدات حوزتي التحلل تستخدم أيضا في كثير من الأحيان crosslinking الهلاميات المائية الاصطناعية للأنسجة الهندسة والمخدرات طلبات التسليم. التدهور التي تسيطر عليها أمر بالغ الأهمية لهذه التطبيقات. حاليا، تتميز حركية تدهور هذه الببتيدات استخدام واحد، وتنقية الإنزيمات. ومع ذلك، تحديد الإنزيمات التي خلايا تنتج فعلا، وهي المسؤولة عن الانقسام ومن هذه الببتيدات قد صعوبة في تحديد. استخدام الببتيد زيموجرافي لتحديد الخلية والإفراج عن إنزيم الأنسجة الخاصة سيساعد إلى حد كبير في تصميم هذه التسلسلات crosslinking الببتيد رشيدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يوفر التمويل ولاية أوهايو الدولة جامعة كلية الهندسة وقسم الهندسة الطبية الحيوية، ومركز السرطان الشامل-آرثر ج. جيمس مستشفى السرطان وريتشارد ج. سلف معهد البحوث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes ThermoFisher Scientific NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs ThermoFisher Scientific NC3510
1x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
20% SDS Solution Ambion AM9820
3x Zymography Sample Buffer Bio-Rad 1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) Ambion AM9022
6 Well Tissue Culture Plates ThermoFisher Scientific 087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) Sigma-Aldrich UFC201024
Ammounium Persulfate Sigma-Aldrich A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit Click Chemistry Tools AZ107
Calcium Chloride ThermoFisher Scientific BP510100
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231
Isopropanol Fisher Scientific A416P
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826
Round Bottom Flask (100 mL) Fisher Scientific 50-873-144
Septum Rubber Stopper Fisher Scientific 50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) Fisher Scientific 14-823-434
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trizma hydrochlroide Sigma-Aldrich T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager GE Amersham 8149-30-9410
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10, (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102, (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255, (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63, (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38, (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64, (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28, (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34, (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40, (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273, (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375, (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3, (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293, (1), 38-42 (2001).
الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).More

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter