Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for en modificeret zymographic teknik hvor fluorescerende peptider bruges som de nedbrydelige substrat i stedet for native proteiner. Elektroforese af biologiske prøver i fluorescerende peptid zymograms giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af proteaser end tidligere zymographic teknikker.
Formålet med denne metode er at måle den proteolytiske aktivitet af komplekse biologiske prøver. Prøverne er adskilt af Molekylær vægt ved hjælp af elektroforese gennem en løsning gel indlejret med et nedbrydeligt substrat. Denne metode adskiller sig fra traditionelle gel zymography, idet en slukket fluorogenic peptid er kovalent indarbejdet i den løse gel i stedet for fuld længde proteiner, såsom gelatine eller kasein. Brug af fluorogenic peptider muliggør direkte påvisning af proteolytiske aktivitet uden yderligere farvning skridt. Enzymer i biologiske prøver kløver bratkølet fluorogenic peptid, hvilket resulterer i en stigning i fluorescens. Den fluorescerende signal i geler er derefter afbildet med en standard fluorescerende gel scanner og kvantificeres ved hjælp af densitometri. Brugen af peptider som nedbrydeligt underlaget i høj grad udvider de mulige proteaser påvises med zymographic teknikker.
Gel zymography er en biologisk teknik, der anvendes til at måle proteolytiske aktivitet inden for biologiske prøver, kropsvæsker eller celle kultur medier1,2,3. Prøverne er adskilt af deres molekylære vægte med elektroforese gennem en polyacrylamid gel indlejret med et nedbrydeligt substrat. Fælles nedbrydeligt substrater inkluderer gelatine, kasein, kollagen og elastin, som har været brugt til at måle aktivitet af matrix metalloproteinases (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 og -11, ud over en række cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. efter elektroforese, enzymerne, der er renatured og lov til at nedbryde protein i gelen. I traditionelle gel zymography, gelen er plettet med et protein farvestof, såsom Coomassie blå, og protease aktivitet registreres som et tab af signal, dvs. hvid bands (nedbrydning af protein) på en blå baggrund.
Her, beskriver vi en protokol for en alternativ metode til gel zymography, hvor de nedbrydelige substrat er en kort, fluorogenic peptid kovalent indarbejdet i polyacrylamid gel (figur 1). Substitution af syntetiske peptider som de nedbrydelige substrater giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af proteaser i forhold til traditionelle gel zymography med native proteiner9. Kovalente sammenkædning af fluorogenic peptid forhindrer peptid diffusion og migration under gelelektroforese observeret med tidligere metoder9,10. Derudover muliggør brugen af en fluorogenic substrat direkte påvisning af protease aktivitet uden yderligere farvning og de-farvning trin. Det overordnede mål med denne metode er påvisning af protease aktivitet i biologiske prøver via den kovalente indarbejdelse af fluorogenic peptider i zymogram geler.
Nuværende zymographic teknikker stole på inkorporering af indfødte substrater i polyacrylamidgeler til påvisning af proteolyse. Mens disse teknikker har vundet udbredelse, er de stadig begrænset antallet af proteaser de kan opdage. Her, blev en protokol, der beskrevet i hvilke fluorescerende, protease-nedbrydeligt peptider er indarbejdet i polyacrylamid løsning gel. Kovalente kobling ved hjælp af en azido-PEG3-maleimide linker molekyle muliggør adskillelse og påvisning af en bredere vifte af proteaser end er i ?…
The authors have nothing to disclose.
Ydes støtte ved The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering Department og Comprehensive Cancer Center – Arthur G. James Cancer Hospital og Richard J. Solove Research Institute.
1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |