Her presenterer vi en detaljert protokoll for en modifisert zymographic teknikk som brukes fluorescerende peptider som nedbrytbart underlaget i stedet for native proteiner. Geleelektroforese av biologiske prøver i fluorescerende peptid zymograms gjør påvisning av et bredere spekter av proteaser enn forrige zymographic teknikker.
Formålet med denne metoden er å måle proteolytiske av komplekse biologiske prøver. Prøvene er atskilt med molekylvekt bruker geleelektroforese gjennom en retting gel innebygd med en nedbrytbar substrat. Denne metoden er forskjellig fra tradisjonell gel zymography i et let fluorogenic peptid bygges covalently inn løse gel i stedet for full lengde proteiner, som gelatin eller kasein. Bruk av fluorogenic peptider gjør direkte deteksjon av proteolytisk aktivitet uten flekker forholdsregler. Enzymer i de biologiske prøvene cleave Let fluorogenic peptid, resulterer i en økning i fluorescens. Fluorescerende signalet i geléer er da fotografert med en standard fluorescerende gel skanner og kvantifisert ved hjelp av densitometry. Bruk av peptider som nedbrytbart underlaget utvider mulig proteaser synlig med zymographic teknikker.
Gel zymography er en biologisk teknikk som brukes til å måle proteolytisk aktivitet innen biologiske prøver, som kroppsvæsker eller celle kultur medier1,2,3. Prøvene er atskilt med deres molekylvekt med geleelektroforese gjennom en polyakrylamid gel innebygd med en nedbrytbar substrat. Vanlige nedbrytbart underlag inkluderer gelatin, kasein, kollagen og elastin, som har blitt brukt til å måle aktiviteten til matrise metalloproteinases (MMPs) -1 -2, -3, -7,-8,-9 og-11, i tillegg til en rekke cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. etter geleelektroforese, enzymer er rehabilitert og lov til å svekke protein i gel. I tradisjonell gel zymography, gel er farget med en protein fargestoff, for eksempel Coomassie blå, og protease-aktiviteten er registrert som tap av signal, dvs. hvite band (nedbrytning av protein) på en mørk blå bakgrunn.
Her beskriver vi en protokoll for en alternativ metode for gel zymography, der nedbrytbart underlaget er en kort, fluorogenic peptid covalently innlemmet i polyakrylamid gel (figur 1). Substitusjon av syntetiske peptider som nedbrytbart substrater gjør påvisning av et bredere spekter av proteaser sammenlignet med tradisjonelle gel zymography med innfødt proteiner9. Kovalente kombinasjon av fluorogenic peptid forhindrer peptid diffusjon og migrasjon ved gel geleelektroforese observert med tidligere metoder9,10. Videre gjør bruk av en fluorogenic substrat direkte deteksjon av protease aktivitet uten ekstra flekk og fjern flekker skritt. Det overordnede målet med denne metoden er oppdagelsen av protease aktivitet i biologiske prøver via kovalente inkorporering av fluorogenic peptider i zymogram gels.
Gjeldende zymographic teknikker er avhengige av inkorporering av innfødte underlag polyakrylamid gels for påvisning av proteolyse. Mens disse teknikkene har fått utbredt bruk, er de fortsatt begrenset i antall proteaser de kan oppdage. Her, ble en protokoll som beskrevet i hvilke fluorescerende, protease-nedbrytbar peptider er innlemmet i polyakrylamid løse gel. Kovalente kopling med en azido-PEG3-maleimide koblingsfunksjonalitet molekyl aktiverer separasjon og påvisning av flere proteaser enn er for tiden oppnåeli…
The authors have nothing to disclose.
Midler gitt av The Ohio State University College of Engineering, biomedisinsk Engineering avdeling og Comprehensive Cancer Center – Arthur G. James kreft sykehus og Richard J. Solove Research Institute.
1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |