Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents

doi: 10.3791/58938 Published: January 20, 2019

Summary

Nous présentons ici un protocole détaillé pour une technique mis à jour le zymographic dans lequel les peptides fluorescents sont utilisés comme substrat biodégradable en lieu et place des protéines natives. Électrophorèse d’échantillons biologiques dans zymogrammes de peptides fluorescents permet la détection d’un plus large éventail de protéases que les techniques de zymographic précédente.

Abstract

Le but de cette méthode est de mesurer l’activité protéolytique des échantillons biologiques complexes. Les échantillons sont séparés par le poids moléculaire en utilisant l’électrophorèse par un gel résolution intégré avec un substrat biodégradable. Cette méthode diffère de zymographie gel traditionnel qu’un peptide fluorogène trempé est par covalence incorporé dans le gel résolution au lieu de protéines pleine longueur, tels que la gélatine ou de la caséine. Utilisation des peptides fluorogène permet une détection directe de l’activité protéolytique sans coloration des étapes supplémentaires. Enzymes dans les échantillons biologiques fendent le peptide fluorogène trempés, résultant en une augmentation de fluorescence. Le signal fluorescent dans les gels est alors photographié avec un scanner de gel fluorescent standard et quantifiées par densitométrie. L’utilisation de peptides comme le substrat biodégradable élargit considérablement les protéases possibles détectables avec les techniques de zymographic.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zymographie gel est une technique biologique utilisée pour mesurer l’activité protéolytique dans des échantillons biologiques, tels que des fluides corporels ou des milieux de culture de cellule pour1,2,3. Les échantillons sont séparées par leurs poids moléculaires avec électrophorèse par un gel de polyacrylamide embarqué avec un substrat biodégradable. Substrats dégradables communs incluent gélatine, caséine, collagène et élastine, qui ont été utilisés pour mesurer l’activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 et -11, en plus d’une variété de cathepsines1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. après électrophorèse, les enzymes sont renaturé et laisse se pour dégrader les protéines dans le gel. En gel traditionnel zymographie, le gel est coloré avec un colorant de la protéine, comme le bleu de Coomassie, et activité de la protéase est détectée comme une perte de signal, c'est-à-dire blanc bandes (dégradation des protéines) sur un fond bleu foncé.

Nous décrivons ici un protocole pour une autre méthode de gel zymographie, dans laquelle le substrat biodégradable est un court, peptide fluorogénique par covalence incorporé dans le gel de polyacrylamide (Figure 1). La substitution de peptides synthétiques comme les substrats dégradables permet la détection d’un plus large éventail de protéases contre zymographie gel traditionnel avec des protéines natives9. Liaison covalente du peptide fluorogène empêche la diffusion de peptide et de migration au cours de l’électrophorèse sur gel, observée avec les précédentes méthodes9,10. De plus, l’utilisation d’un substrat fluorogène permet la détection directe de l’activité de la protéase sans coloration supplémentaire et étapes de coloration. L’objectif général de cette méthode est la détection de l’activité protéase dans des échantillons biologiques via l’incorporation covalente des peptides fluorogéniques dans les gels zymogramme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. préparation de la couche de Gel résolution

  1. Préparer un 10 % de polyacrylamide résoudre solution de gel conformément au tableau 1. Ajouter la Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et le Persulfate d’Ammonium (APS) immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.
  2. Remplir une cassette de mini gel de vide de 1,5 mm à mi-chemin (5 mL) avec la solution de gel résolution de 10 %.
  3. Ajoutez une fine couche d’isopropanol (~ 500 µL) en haut du gel polyacrylamide de produire un gel niveau et éviter les bulles. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 40 min).

2. préparation de la molécule Azido-PEG3-maléimide Linker

  1. Alors que la première couche de gel résolution est polymérisant, récupérer le kit azido-PEG3-maléimide du stockage-20 ° C et laisser les composants à température ambiante. Il y a deux composantes dans chaque kit. Flacon 1 contient un ester maléimide-NHS, un blanc cassé au gris solide. Flacon 2 contient azido-PEG3-amine, une huile légèrement jaune.
    Remarque : Les auteurs vous suggérons d’utiliser le kit d’azido-PEG3-maléimide 25 mg car il ne peut être stocké pendant de courtes périodes de temps (1 à 2 heures) à-20 ° C après être préparé avant de commencer à se dégrader. 25 mg est suffisante pour produire 10 gels de peptide. Utiliser des gels dans les 3 semaines de préparation.
  2. Dissoudre les composants du flacon 2 dans le fabricant recommandé volume de diméthylsulfoxyde (DMSO) et vortexer pendant 30 s pour assurer les liquides ont été bien mélangés.
  3. Transvaser le contenu du flacon 1 dans un ballon à fond rond propre et sec 100 mL contenant une barre de remuer.
    Remarque : Rincer le ballon avec de l’acétone et sécher complètement avant utilisation pour empêcher l’humidité d’interférer avec la réaction.
  4. Insérer immédiatement un bouchon en caoutchouc de cloison avec un diaphragme qui peut être percé avec une seringue dans la bouche du ballon. Travailler rapidement pour empêcher l’humidité d’entrer dans la fiole.
  5. Insérer deux 18 jauge aiguilles de seringues dans le diaphragme et connecter l’un à un réservoir de gaz inerte (gaz argon,etc. ). Laisser le gaz inerte pour remplir la fiole pendant 3 min. mélanger les composants des flacons 1 et 2 sous gaz inerte pour éviter que des produits de réaction indésirable.
    Attention : La deuxième aiguille de seringue est de fournir un évent, permettant ainsi à l’air atmosphérique, contenue dans le ballon s’écouler de la fiole qu’il remplit de gaz inerte. N’oubliez pas d’inclure une aiguille de vent !
  6. Couper le gaz inerte et retirez-le de l’aiguille. À l’aide d’une seringue, injecter la totalité du contenu du flacon 2 dans la fiole.
  7. Retirer les aiguilles et seringues et laisser les composants à mélanger pendant 30 min à température ambiante tout en remuant.
  8. Enlever le bouchon du septum en caoutchouc et verser le contenu dans un tube à centrifuger propre de 5 mL. La solution azido-PEG3-maléimide doit être utilisée au sein de 1 heure à température ambiante.

3. préparation du Peptide résoudre la couche de Gel

  1. Une fois la première couche de gel résolution a polymérisé, décanter la couche de l’isopropanol. Rincez la partie supérieure du gel par pipetage 1 mL d’eau désionisée sur le dessus du gel et puis versez l’eau.
  2. Extraire le peptide fluorescent fonctionnalisés thiol du stockage de-80 ° C et laisser décongeler à température ambiante.
    Remarque : Le peptide fonctionnalisés thiol peut être préparé comme décrit plus haut11,12. Peptides disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés, mais exigent l’ajout d’un résidu cystéine terminale pour permettre le maléimide-thiol cliquez sur réaction. Dissoudre le peptide à une concentration de stock de 10 mM et conserver à-80 ° C dans de petites aliquotes (30 uL) pour limiter les cycles répétés de gel-dégel.
  3. Préparer une solution de gel contenant la molécule azido-PEG3-maléimide linker et le peptide fluorescent conformément au tableau 1de résoudre de 10 %. Ajouter le TEMED et APS immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.
  4. Remplir la moitié de la portion restante de la cassette de gel (3 mL) avec le peptide résoudre solution de gel.
    Remarque : Une approche multicouche de gel résolution réduit la quantité de peptide et linker nécessaire à chaque gel. La taille de la couche de gel résolution de peptide est réglable pour s’adapter à un plus large éventail de poids moléculaires au besoin.
  5. Pipeter une mince couche d’isopropanol (~ 500 µL) vers le haut du gel polyacrylamide de produire un gel niveau et éviter les bulles. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 40 min).
    Remarque : Le peptide fluorescent est sensible à la lumière. Garder les gels recouverts de papier aluminium pour éviter le Photoblanchiment au développement, électrophorèse, lavage et préparation du gel.
  6. Décanter la couche isopropanol et rincer la partie supérieure du peptide résoudre le gel avec de l’eau désionisée comme au point 3.1.
  7. Si utiliser les gels immédiatement, passez à l’étape 4, dans le cas contraire, immergez les gels préparés dans 100 mL de 1 x tamponné phosphate salin (PBS) à 4 ° C dans une boîte en plastique pour éviter les gels ne se dessèchent pas. Envelopper la boîte en papier d’aluminium pour éviter le Photoblanchiment. Gels peuvent être stockées dans du PBS jusqu'à 3 semaines avant son utilisation.

4. préparation du Gel empilable

  1. Préparer une solution de gel empilage de 5 % selon le tableau 1. Ajouter le TEMED et APS immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.
  2. Remplir la partie restante de vide de la cassette de gel (environ 2 mL) avec la solution de gel empilage.
  3. Insérer rapidement un peigne de gel de 1,5 mm dans la couche de gel d’empilement, n’assurant aucune bulle reste coincés sous les puits. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 10 min).
  4. Retirez délicatement le peigne et le ruban à l’arrière de la cassette de gel.

5. préparation des échantillons biologiques pour l’électrophorèse

  1. Préparer les milieux cellulaires conditionné, lysats cellulaires, homogénats tissulaires et les normes MMP comme décrit ailleurs sous des conditions de non réducteur2. Ne pas chauffer les échantillons.
  2. Par exemple, préparer des milieux cellulaires conditionné comme suit :
    1. Plaque 40 000 cellules/cm2 cellules dans la plaque de 6 puits dans les milieux de culture pour le sérum fœtal (SVF) 10 %. Incuber les cellules dans une chambre humidifiée (5 % CO2 à 37 ° C) pendant 24 heures et leur permet d’atteindre le confluent de 70 à 80 %.
      Remarque : Si les cellules n’ont pas atteint la confluence désirée après 24 heures, leur permettre de se développer dans les milieux de culture pour le BF 10 % pendant 24 heures supplémentaires.
    2. Laver les cellules deux fois avec du PBS et ajouter 2 mL de milieu de culture sans sérum. Incuber les cellules dans une chambre humidifiée (5 % CO2 à 37 ° C) pendant 24 heures supplémentaires.
    3. À l’aide d’une pipette sérologique, recueillir les milieux conditionnés dans chaque puits. Centrifuger les médias à 1200 tr/min pendant 3 minutes pour enlever les débris cellulaires. Prenez le surnageant et concentré à l’aide d’un 15 mL, 10 kDa poids moléculaire coupure filtre centrifuge. Centrifuger les blocs filtrants à 4 000 x g pendant 15 min dans un rotor oscillant de seau ou 5 000 x g pendant 15 min dans un rotor à angle fixe.
      Remarque : Cette étape est facultative mais peut augmenter l’intensité des bandes protéolytiques dans les gels de zymographie peptide.
    4. Transvaser le filtrat concentré dans un tube à centrifuger fraîches 1,5 mL. Échantillons aliquote et magasin à-80 ° C pendant jusqu'à trois cycles de gel-dégel.
  3. Quantifier la teneur en protéines à l’aide d’un test de quantification des protéines standard (p. ex. BCA, analyse de Bradford, etc.).

6. électrophorèse of Biological Samples in Peptide Zymographie Gels

  1. Dissoudre les échantillons dans un tampon échantillon zymographie classiques (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25 % de glycérol, 4 % SDS, 0,01 % bleu de bromophénol). Pour les échantillons de cellules et de tissus, ~ 30 µg de protéines totales par puits est recommandé et 50-100 ng de protéines pour les normes MMP.
  2. Ajouter 400 mL de 1 x Tris-Glycine SDS exécutant le tampon à l’appareil de gel. Charge jusqu'à 35 µL de l’échantillon par puits. Exécuter les exemples à 120 V à 4 ° C pendant 1 h 30 ou jusqu'à ce que les normes de poids moléculaire indiquent que les protéases d’intérêt sont dans le peptide résoudre la couche de gel (qui a une couleur orange visible).
    Remarque : La plupart des MMPs et leurs variantes entraient dans le cadre de 35 à 100 kDa. Lorsque les normes de poids moléculaire indiquent que ces poids sont dans le peptide résoudre la couche de gel, électrophorèse peut être arrêté. Le même principe peut être appliqué à d’autres classes de protéases avec des poids moléculaires connus. S’il y a un intérêt dans la détection de plusieurs protéases sur un plus large éventail de poids moléculaires, réduire la taille de la couche de gel de résoudre et augmenter la taille de la couche de gel résolution de peptide.
  3. Après électrophorèse, retirez les gels de la cassette en plastique et lavez les gels trois fois pour chaque 10 min à température ambiante sous agitation modérée dans un tampon de renaturation contenant 2,5 % X-100 de Triton, 1 µM ZnCl2et 5 mM CaCl2 à 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
  4. Gels de transfert à une pays en développement solution tampon contenant 1 % Triton X-100, 1µm ZnCl2 et 5 mM CaCl2 en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 pendant 15 min. remplacer avec frais de développement solution tampon et incuber les gels à 37 ° C sous agitation modérée pendant 24 heures , en s’assurant que les gels sont complètement immergés dans la solution.

7. imagerie du Peptide Zymographie gelées

  1. Après 24 heures, gels d’image à l’aide d’un fluorescent gel scanner/imageur en utilisant les filtres appropriés d’excitation et d’émission. Par exemple, les gels de peptide montrés les résultats représentatifs sont conjugués à la fluorescéine et ont été photographiés à l’aide d’un filtre d’excitation de 488 nm et un filtre d’émission de 521 nm. En utilisant les filtres appropriés pour votre fluorophore maximisera la détection d’activité protéolytique.
    NOTE : Images peuvent également être prises avec un imageur de gel équipé d’un transilluminateur UV, souvent utilisé pour l’imagerie des gels d’ADN coloré au bromure d’éthidium. Image les gels en utilisant le transilluminateur UV (365 nm) réglage et un filtre d’émission de 590 nm.
  2. Effectuer une évaluation densitométrique des intensités de bande à l’aide de ImageJ comme décrit ailleurs13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

À l’aide de la méthode décrite ici, deux peptides fluorescents de protéase-dégradables ont été incorporées dans des gels de polyacrylamide : GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abrégé en QGIW dans tout le texte et les figures) et GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abrégé en LACW dans tout le texte et les figures). ↓ indique le site de clivage. QGIW est un collagène-j’ai dérivé séquence conçu pour détecter les collagénases cellulaire14. LACW est une séquence qui a été optimisée pour la détection des MMP-14 et15de la MMP-11. Les peptides sont étiquetés avec dabcyl (extincteur) et de fluorescéine (fluorophore) à l’aide de N-hydroxysuccinimide (NHS) - ester - amine chimie11. Il peut être difficile de développer de nouveaux peptides fluorogène extinction de la fluorescence adéquat qui sont solubles dans les tampons standards. Par conséquent, adapter les séquences peptidiques de substrats disponibles dans le commerce de protéase fluorescent pour inclure une cystéine terminale C est souvent une stratégie efficace pour développer de nouveaux capteurs fluorogène. Pour montrer la capacité du peptide zymographie pour séparer des mélanges complexes de protéase, milieux conditionnés a prélevé deux lignées cellulaires de cancer différents. Cellules de fibrosarcome HT1080 et cellules d’adénocarcinome mammaire MDA-MB-231 ont été plaqués dans les médias FBS de 10 % pendant 24 heures, après quoi les médias a été remplacé par un milieu sans sérum pour 24 heures supplémentaires. Milieux conditionnés échantillons ont été prélevés et concentrent à l’aide de 10 unités de coupure filtre centrifuge pour un poids moléculaire de kDa. La teneur en protéines des médias a été mesurée à l’aide d’un test standard µBCA. 30 µg de protéines provenant de milieux conditionnés sont grande. Comme témoins positifs, puits avec type j’ai collagénase bactérienne (100 µg) ou purifiée, activé MMP-9 (125 ng) ont également été incluses. Les gels ont été incubées pendant 24h dans le développement de tampon pour permettre un clivage MMP des substrats dégradables dans les gels (Figure 2) et ensuite imagés. Imagerie de fluorescence révèle que nombreuses bandes étaient visibles dans les gels de peptide LACW (Figure 2 a14), tandis que qu’une seule bande était apparente dans les gels de QGIW (2D Figure14). En comparaison avec gélatine zymographie (Figure 2,14), LACW gels ont pu déceler plusieurs bandes protéolytiques, démontrant la capacité du peptide zymographie pour détecter un éventail plus large de protéases présentes dans les échantillons biologiques que méthodes traditionnelles en utilisant des substrats natives.

Pour vérifier l’identité des bandes visualisées comme MMP, gels de zymographie peptide sont incubées dans un tampon de développement contenant soit 20 µM GM6001, un inhibiteur de la MMP à large spectre, ou 10 µM E-64, un inhibiteur de la cathepsine générales. Traitement du peptide LACW gelées avec GM6001 (Figure 2 b14) a diminué l’intensité des bandes, alors que le traitement avec E-64 (Figure 2,14) n’a eu aucun effet perceptible. Traitement des gels QGIW peptide avec GM6001 a entraîné une ablation complète des bandes précédemment vus (2E Figure14). Comme prévu, E-64 n’avait aucun effet (2F de la Figure14). Les deux gels de peptide, GM6001 inhibée purifié l’activité des MMP-9, mais n’a pas affecté l’activité bactérienne de collagénase, vérifier plus loin que l’augmentation visualisée en fluorescence est le résultat d’une activité protéolytique par MMP présents au sein de l’essai biologique échantillons.

Pour comparer la sensibilité du peptide zymographie à l’étalon-or actuel, gélatine zymographie, une analyse de sensibilité a été réalisée à l’aide de MMP-9 purifiée, activés. Des dilutions de MMP-9 (1-250 ng) étaient électrophorèse en gels de zymographie LACW, QGIW et gélatine (Figure 3 a14). Après développement et imagerie fluorescente, des intensités de bande ont été quantifiées avec ImageJ et parcelles d’intensité normalisée de bande ont été générés pour calculer des valeurs-la concentration de50 EC qui produit 50 % du signal maximum (Figure 3 b 14). LACW peptide gels ont été en mesure de détecter les plus petites concentrations de MMP-9, avec une valeur de50 EC de 17,28 ng, comparativement à des zymogrammes QGIW et de la gélatine avec des valeurs de 59.50 ng et 31,85 ng, respectivement. Ces données indiquent que l’utilisation du peptide zymographie peut égaler ou dépasser les limites de sensibilité des substrats indigènes comme la gélatine.

Figure 1
Figure 1 : schéma du processus zymographie peptides fluorescents. (A) préparation de la multicouche polyacrylamide gel de résoudre. Un standard 10 % résolution solution de gel est utilisé pour former la première couche du gel zymographie peptide. Une deuxième résolution de 10 % gel calque contenant un peptide trempé, fluorescent et une molécule azido-PEG3-maléimide linker est polymérisée ensuite sur le dessus de la première couche. La couche finale est un gel de concentration de 5 %. (B) l’électrophorèse Standard sous non réductrice des conditions est utilisé pour séparer des échantillons contenant des protéases dans les gels de polyacrylamide fonctionnalisés. Les gels sont lavés pour éliminer SDS et autoriser les protéines pour renaturaliser. Les gels sont ensuite incubés dans un tampon de développement pendant 24 h à 37 ° C, ce qui permet des protéases en conjonction avec les peptides fluorogène, résultant en une augmentation de la fluorescence. Cette fluorescence, correspondant à l’activité de la protéase, est capturée à l’aide d’un gel fluorescent imageur à une excitation des 488 nm et d’émission de 521 nm (adapté avec la permission de Biotechniques et Science de l’avenir14). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : détection des protéases cellulaires-sécrété dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines. Analyse de l’enzyme collagénase (100 µg), MMP-9 (125 ng) et conditionné milieux cellulaires de la fibrosarcome HT1080 (30 µg) et des lignées de cellules cancéreuses (30 µg) par cancer du sein d’adénocarcinome MDA-MB-231 dans les gels de peptide LACW et QGIW. Gels ont été traités avec le DMSO (excipient) (A-D), traités avec GM6001 (B & E) ou traitées E-64 (C & F). (G) zymogramme gélatine HT1080 et MDA-MB-231 conditionné milieux cellulaires (adapté avec la permission de Biotechniques et Science de l’avenir14). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : comparaison de la sensibilité de MMP-9 du Peptide et gélatine Zymogrammes. (A) QGIW (en haut), LACW (au milieu) et gels de zymographie gélatine (en bas) ont été soumis à des dilutions de MMP-9. (B) normalisée bande intensités ont comploté contre des concentrations de MMP-9 et apte à une courbe de pente variable paramètre quatre. EC50 valeurs indiquent la concentration à moitié le signal maximal. Résultats sont représentés sous forme de n = 3, moyenne écart-type (adapté avec la permission de Biotechniques et Science de l’avenir14). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Résolution de Gel
Stock conc. Finale conc. 5 gels 10 gels
L’acrylamide/Bis-Acrylamide (19:1) 40 % 10 % 10 mL 20 mL
Tris-HCl pH 8,7 1 M 0,375 M 15 mL 30 mL
Dodécylsulfate de sodium (SDS) 20 % 0,10 % 200 ΜL 400 ΜL
Désionisée H2O -- -- 14,4 mL 28,7 mL
TEMED -- -- 40 ΜL 80 ΜL
APS 10 % 0,10 % 400 ΜL 800 ΜL
Volume total 40 mL 80 mL
Peptide Resolving Gel
Stock conc. Finale conc. 5 gels 10 gels
L’acrylamide/Bis-Acrylamide (19:1) 40 % 10 % 5 mL 10 mL
Tris-HCl pH 8,7 1 M 0,375 M 7,5 mL 15 mL
Dodécylsulfate de sodium (SDS) 20 % 0,10 % 100 ΜL 200 ΜL
Désionisée H2O -- -- 6.5 ΜL 13 mL
Peptide fluorescent 10 mM 75 ΜM 150 ΜL 300 ΜL
Reticulation azido-PEG3-Maléimide 75 mM 1,5 mM 400 ΜL 800 ΜL
TEMED -- -- 20 ΜL 40 uL
APS 10 0,10 % 200 ΜL 400 ΜL
Volume total 20 mL 40 mL
Gel de concentration
Stock conc. Finale conc. 5 gels 10 gels
L’acrylamide/Bis-Acrylamide (19:1) 40 % 5 % 2,5 mL 5 mL
Tris-HCl pH 6,9 1 M 0,125 M 2,5 mL 5 mL
Dodécylsulfate de sodium (SDS) 20 % 0,10 % 100 ΜL 200 ΜL
Désionisée H2O -- -- mL 14,75 29,5 mL
TEMED -- -- 50 ΜL 100 ΜL
APS 10 % 0,10 % 100 ΜL 200 ΜL
Volume total 20 mL 40 mL

Tableau 1: tableau de réactif pour la préparation de peptides fluorescents gels de zymographie. Les concentrations et volumes pour la préparation du gel zymographie peptide multicouche.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Les techniques actuelles de zymographic s’appuient sur l’incorporation des substrats indigènes dans des gels de polyacrylamide pour la détection de la protéolyse. Alors que ces techniques ont rallié la généralisation, elles sont encore limitées dans le nombre des protéases, qu'ils peuvent détecter. Ici, un protocole a été décrite dans les peptides fluorescents, protéase-dégradables sont incorporés dans le polyacrylamide gel de résoudre. À l’aide de couplage covalent une molécule azido-PEG3-maléimide linker permet la séparation et la détection d’une plus grande variété de protéases qu’est actuellement réalisable avec les substrats natives. La nature hautement accordable de peptides fluorescents offre aux chercheurs la possibilité de concevoir des substrats qui peuvent cibler leurs protéases d’intérêt. Nombreux substrats peptidiques ont été identifiés pour une grande variété de protéases qui utilisent les bibliothèques de peptide, et il y a un nombre croissant de peptides personnalisés de fabrication de sources commerciales. Il peut être difficile de développer de nouveaux peptides fluorogène extinction de la fluorescence adéquat qui sont solubles dans les tampons standards. Par conséquent, adapter commercialement les séquences peptidiques de substrats disponibles protéase fluorescent pour inclure une cystéine de C-terminal est souvent une stratégie efficace pour développer de nouveaux capteurs fluorogène.

Tout en terminant ce protocole, il faut lors de la manipulation des gels de peptides fluorescents pour éviter une exposition excessive à la lumière, car cela pourrait réduire considérablement le signal fluorescent détecté. En outre, la concentration actuelle de peptide utilisé dans chaque gel est 75 µM. Cela peut être réglé pour abaisser les concentrations pour conserver le peptide, gardant à l’esprit que la solution azido-PEG3-maléimide doit être ajoutée à la solution dans au moins une molaire 20 excédentaire au peptide. Le kit azido-PEG3-maléimide peut être acheté en 3 tailles (25, 100 et 1000 mg). Les auteurs recommandent d’acheter le kit de 25 mg car la solution ne peut être stockée à courtes périodes de temps à-20 ° C. En outre, un kit de 25 mg est suffisant pour préparer 10 gels de peptide, qui doivent être utilisés dans les 3 semaines de préparation.

Une des limites de zymographie est la difficulté à discerner l’identité exacte des bandes de protéase visualisées en raison d’un chevauchement important du poids moléculaire. À l’avenir des études, il sera essentiel de mener une analyse secondaire afin de déterminer leur identité à l’aide de techniques telles que la spectrométrie de masse16,17. Une autre limitation de zymographie est le repliement des protéines à leur conformation active après dénaturation partielle par le SDS et l’électrophorèse. Ces processus peuvent entraîner un changement dans la conformation active de la protéase, rendant les protéines clivage protéolytique inactifs, actif. Par exemple, pro-MMP-2 peut être détectée dans les zymogrammes de gélatine malgré l’inhibiteur régulière intacte pro-domaine à sa renaturation d’une forme intermédiaire active. Méthodes complémentaires comme le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou Western Blots peut être utilisé pour déterminer l’identité et la présence totale d’une protéase d’intérêt.

Cet article illustre l’utilisation de substrats fluorescents peptidiques pour accroître la sensibilité des techniques actuelles de zymographic. À l’aide de MMP-9 purifiée, gradient de concentration a réalisé une analyse comparant les gels de zymographie LACW, QGIW et gélatine. Gélatine zymographie est actuellement la technique de l’étalon-or par lequel les gélatinases (MMP-2 et -9) sont détectés dans des échantillons biologiques. En comparant les valeurs de50 EC des trois substrats, gels de peptide LACW avaient les valeurs les plus faibles, ce qui indique la sensibilité la plus élevée. Utilisant des séquences de peptides différents conçus pour la détection des protéases spécifiques peut potentiellement améliorer ces sensibilités encore plus loin. Traitement des gels avec un agent activant MMP tels que l’acétate de 4-aminophenylmercuric (AFPA) ou de l’héparine peut également être utilisé pour poussée un signal faible comme décrit précédemment18.

En plus de la mesure de l’activité de la protéase pour des études biologiques, les peptides protéase-dégradables sont également souvent utilisés pour hydrogels synthétiques de réticulation pour les applications de tissu ingénierie et drogue de livraison. La dégradation contrôlée est critique pour ces applications. Actuellement, la cinétique de dégradation de ces peptides sont caractérisées à l’aide d’enzymes purifiées unique. Toutefois, déterminer quels enzymes des cellules en fait produisent et sont responsables de clivage de ces peptides a été difficile à déterminer. La conception rationnelle de ces séquences de réticulation du peptide facilitera grandement l’utilisation du peptide zymographie pour quantifier les cellules et la libération enzymatique spécifique des tissus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Financement fourni par The Ohio State University College of Engineering, département de génie biomédical et le Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital et Richard J. Solove Research Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes ThermoFisher Scientific NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs ThermoFisher Scientific NC3510
1x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
20% SDS Solution Ambion AM9820
3x Zymography Sample Buffer Bio-Rad 1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) Ambion AM9022
6 Well Tissue Culture Plates ThermoFisher Scientific 087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) Sigma-Aldrich UFC201024
Ammounium Persulfate Sigma-Aldrich A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit Click Chemistry Tools AZ107
Calcium Chloride ThermoFisher Scientific BP510100
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231
Isopropanol Fisher Scientific A416P
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826
Round Bottom Flask (100 mL) Fisher Scientific 50-873-144
Septum Rubber Stopper Fisher Scientific 50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) Fisher Scientific 14-823-434
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trizma hydrochlroide Sigma-Aldrich T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager GE Amersham 8149-30-9410
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10, (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102, (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255, (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63, (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38, (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64, (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28, (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34, (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40, (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273, (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375, (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3, (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293, (1), 38-42 (2001).
Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).More

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter