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Cancer Research

फ्लोरोसेंट पेप्टाइड Zymography द्वारा चिढ़ा गतिविधि का पता लगाने

doi: 10.3791/58938 Published: January 20, 2019

Summary

यहां, हम एक संशोधित zymographic तकनीक है जिसमें फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स देशी प्रोटीन के स्थान पर सड़ सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जाता है के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद । फ्लोरोसेंट पेप्टाइड zymograms में जैविक नमूनों की ट्रो पिछले zymographic तकनीकों की तुलना में एक व्यापक रेंज का पता लगाने में सक्षम बनाता है ।

Abstract

इस विधि का उद्देश्य जटिल जैविक नमूनों की proteolytic गतिविधि को मापने का है । नमूनों आणविक वजन एक संपति एक सड़ सब्सट्रेट के साथ एम्बेडेड जेल के माध्यम से ट्रो का उपयोग करके अलग कर रहे हैं । इस विधि में पारंपरिक जेल zymography से अलग है कि एक बुझती fluorogenic पेप्टाइड covalently के बजाय पूर्ण लंबाई प्रोटीन, जैसे जिलेटिन या कैसिइन के समाधान जेल में शामिल किया गया है । fluorogenic पेप्टाइड्स का उपयोग अतिरिक्त दाग कदम के बिना proteolytic गतिविधि का प्रत्यक्ष पता लगाने में सक्षम बनाता है । जैविक नमूनों के भीतर एंजाइमों बुझती fluorogenic पेप्टाइड, प्रतिदीप्ति में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप सट । जैल में फ्लोरोसेंट संकेत तो एक मानक फ्लोरोसेंट जेल स्कैनर और densitometry का उपयोग कर quantified के साथ छवि है । पदावनति सब्सट्रेट के रूप में पेप्टाइड्स का उपयोग काफी संभव zymographic तकनीकों के साथ detectable का पता लगाता है का विस्तार ।

Introduction

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जेल zymography जैविक नमूनों के भीतर proteolytic गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया एक जैविक तकनीक है, जैसे शरीर के तरल पदार्थ या सेल संस्कृति मीडिया1,2,3. नमूने ट्रो के साथ एक polyacrylamide जेल एक सड़ सब्सट्रेट के साथ एंबेडेड के माध्यम से उनके आणविक भार से अलग कर रहे हैं । आम सड़ सब्सट्रेट जिलेटिन शामिल हैं, कैसिइन, कोलेजन और elastin, जो मैट्रिक्स metalloproteinases की गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है (MMPs)-1,-2,-3,-7,-8,-9, और-11, cathepsins की एक किस्म के अलावा1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. ट्रो के बाद, एंजाइमों स्वभाविक और जेल के भीतर प्रोटीन नीचा करने के लिए अनुमति दी जाती है । पारंपरिक जेल zymography में, जेल एक प्रोटीन डाई के साथ दाग है, इस तरह के Coomassie नीले रंग के रूप में, और एक गहरी नीली पृष्ठभूमि पर सफेद बैंड (प्रोटीन की गिरावट), यानी, संकेत की हानि के रूप में पता चला है ।

यहां, हम जेल zymography की एक वैकल्पिक पद्धति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, जिसमें सड़ सब्सट्रेट एक छोटी, fluorogenic पेप्टाइड covalently polyacrylamide जेल (चित्रा 1) में शामिल किया गया है । क्षरण सब्सट्रेट के रूप में सिंथेटिक पेप्टाइड के प्रतिस्थापन के रूप में देशी प्रोटीन9के साथ पारंपरिक जेल zymography की तुलना में एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है । fluorogenic पेप्टाइड के आबंध लिंकेज पेप्टाइड प्रसार और जेल ट्रो के दौरान प्रवास को रोकता है पिछले तरीकों9,10के साथ मनाया । इसके अलावा, एक fluorogenic सब्सट्रेट के उपयोग अतिरिक्त धुंधला और de-धुंधला कदम के बिना गतिविधि को छेड़ने का प्रत्यक्ष पता लगाने में सक्षम बनाता है । इस विधि का समग्र लक्ष्य zymogram जैल में fluorogenic पेप्टाइड्स के आबंध के माध्यम से जैविक नमूनों में गतिविधि को छेड़ने का पता लगाने है ।

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Protocol

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1. संपति जेल परत की तैयारी

  1. 1 तालिकाके अनुसार एक 10% polyacrylamide हल जेल समाधान तैयार करें । Tetramethylethylenediamine (TEMED) और अमोनियम Persulfate (ए पी एस) तुरंत जेल डालने से पहले जोड़ें के रूप में उनके अलावा बहुलकीकरण प्रतिक्रिया आरंभ करता है ।
  2. एक खाली १.५ mm मिनी जेल कैसेट आधा रास्ता (5 एमएल) के साथ 10% हल जेल समाधान भरें ।
  3. एक स्तर जेल का उत्पादन और बुलबुले को रोकने के लिए polyacrylamide जेल के शीर्ष करने के लिए isopropanol (~ ५०० µ एल) की एक पतली परत जोड़ें । बहुलकीकरण प्रतिक्रिया की प्रगति को ट्रैक करने के लिए बचे हुए polyacrylamide समाधान का उपयोग करें । जब ट्यूब में polyacrylamide पूरी तरह से जम गया है, प्रतिक्रिया पूर्ण (~ ४० मिनट) है ।

2. Azido-PEG3-maleimide linker अणु की तैयारी

  1. पहले समाधान जेल परत polymerizing है, जबकि-20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से azido-PEG3-maleimide किट पुनः प्राप्त करने और घटकों के कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं । प्रत्येक किट में दो घटक हैं । शीशी 1 एक maleimide-एन एच एस एस्टर, ग्रे ठोस करने के लिए एक बंद सफेद होता है । शीशी 2 में azido-PEG3-अमीन, थोड़ा पीला तेल होता है ।
    नोट: लेखकों का उपयोग सुझाव 25 मिलीग्राम azido-PEG3-maleimide किट के रूप में यह केवल समय की छोटी अवधि के लिए संग्रहीत किया जा सकता है (1-2 घंटे) पर-20 ° c के बाद इसे नीचा करने के लिए शुरू होता है तैयार होने से पहले । 25 मिलीग्राम 10 पेप्टाइड जैल उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है । तैयारी के 3 हफ्तों के भीतर जैल का उपयोग करें ।
  2. निर्माता में शीशी 2 के घटकों को भंग 30 एस के लिए dimethyl sulfoxide (DMSO) और भंवर की मात्रा की सिफारिश की तरल पदार्थ अच्छी तरह से मिश्रित किया गया है सुनिश्चित करने के लिए ।
  3. एक साफ, सूखी १०० मिलीलीटर दौर-नीचे कुप्पी एक हलचल पट्टी युक्त में शीशी 1 की सामग्री स्थानांतरण ।
    नोट: एसीटोन के साथ कुप्पी कुल्ला और पूरी तरह से उपयोग करने से पहले सूखी प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप से नमी को रोकने के लिए ।
  4. तुरंत एक डायाफ्राम है कि कुप्पी के मुंह में एक सिरिंज के साथ पंचर किया जा सकता है के साथ एक रबर पट डाट डालें । कुप्पी में प्रवेश करने से नमी को रोकने के लिए जल्दी से काम करें ।
  5. डायाफ्राम में २ १८ गेज सिरिंज सुई डालें और एक निष्क्रिय गैस टैंक (जैसे आर्गन गैस) से कनेक्ट करें. निष्क्रिय गैस के लिए कुप्पी भरने की अनुमति दें 3 min. अवांछनीय प्रतिक्रिया उत्पादों को रोकने के लिए निष्क्रिय गैस के तहत शीशियों 1 और 2 के घटकों को मिलाएं ।
    चेतावनी: दूसरी सिरिंज सुई एक वेंट प्रदान करना है, जिससे वायुमंडलीय हवा कुप्पी के भीतर समाहित करने के लिए कुप्पी के बाहर प्रवाह के रूप में यह निष्क्रिय गैस के साथ भरता है । एक वेंट सुई शामिल करने के लिए मत भूलना!
  6. निष्क्रिय गैस बंद और यह सुई से अलग । एक सिरिंज का उपयोग कर, शीशी 2 की कुप्पी में पूर्ण सामग्री इंजेक्षन.
  7. दोनों सुइयों और सिरिंज निकालें और घटकों को क्रियाशील करते हुए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिश्रण करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  8. रबड़ पट डाट निकालें और एक साफ 5 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए सामग्री हस्तांतरण । azido-PEG3-maleimide समाधान कमरे के तापमान पर 1 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

3. पेप्टाइड संपति जेल परत की तैयारी

  1. एक बार पहली समाधान जेल परत बहुलक है, isopropanol परत बंद डालो । जेल के ऊपर कुल्ला pipetting से 1 मिलीलीटर पानी की एक जेल के ऊपर पर और फिर पानी से डालना ।
  2. -८० ° c भंडारण से thiol कार्यात्मक फ्लोरोसेंट पेप्टाइड पुनः प्राप्त करने और इसे कमरे के तापमान पर गल करने की अनुमति ।
    नोट: thiol कार्यात्मक पेप्टाइड पहले11,12वर्णित के रूप में तैयार किया जा सकता है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेप्टाइड्स भी इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन maleimide-thiol क्लिक प्रतिक्रिया को सक्षम करने के लिए एक टर्मिनल cysteine अवशेष के अलावा की आवश्यकता होती है । 10 मिमी की एक शेयर एकाग्रता के लिए पेप्टाइड भंग और छोटे में ८० ° c (30 uL) aliquots दोहराया रुक-गल चक्र को सीमित करने के लिए यह दुकान.
  3. एक 10% azido-PEG3-maleimide linker अणु और 1 तालिकाके अनुसार फ्लोरोसेंट पेप्टाइड युक्त जेल समाधान को तैयार करें । TEMED और ए पी एस तुरंत जेल डालने से पहले जोड़ें के रूप में उनके अलावा बहुलकीकरण प्रतिक्रिया शुरू ।
  4. जेल कैसेट के शेष भाग के आधे भरें (3 एमएल) पेप्टाइड समाधान जेल समाधान के साथ ।
    नोट: एक बहु-परत संपति जेल दृष्टिकोण पेप्टाइड और प्रत्येक जेल के लिए आवश्यक linker की राशि कम कर देता है । पेप्टाइड संपति जेल परत के आकार की जरूरत के रूप में आणविक भार की एक बड़ी रेंज को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
  5. एक स्तर जेल का उत्पादन और बुलबुले को रोकने के लिए polyacrylamide जेल के शीर्ष करने के लिए isopropanol (~ ५०० µ एल) की एक पतली परत पिपेट । बहुलकीकरण प्रतिक्रिया की प्रगति को ट्रैक करने के लिए बचे हुए polyacrylamide समाधान का उपयोग करें । जब ट्यूब में polyacrylamide पूरी तरह से जम गया है, प्रतिक्रिया पूर्ण (~ ४० मिनट) है ।
    नोट: फ्लोरोसेंट पेप्टाइड प्रकाश संवेदनशील है । जेल की तैयारी, ट्रो, धुलाई और विकास के दौरान photobleaching को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर जैल रखें ।
  6. बंद isopropanol परत डालो और कुल्ला चरण ३.१ में के रूप में पानी के साथ पेप्टाइड समाधान जेल के ऊपर ।
  7. जैल तुरंत उपयोग करते हैं, तो चरण 4 के लिए आगे बढ़ना, अन्यथा, जैल बाहर सुखाने से रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x फास्फेट के १०० मिलीलीटर में तैयार जैल खारा (पंजाब) में विसर्जित कर दिया । photobleaching को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पंनी में बॉक्स लपेटें । जैल पंजाब में 3 सप्ताह तक उपयोग करने से पहले के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

4. टैक् स जेल की तैयारी

  1. 1 तालिकाके अनुसार एक 5% स्टैकिंग जेल समाधान तैयार करें । TEMED और ए पी एस तुरंत जेल डालने से पहले जोड़ें के रूप में उनके अलावा बहुलकीकरण प्रतिक्रिया शुरू ।
  2. जेल कैसेट (~ 2 एमएल) के स्टैकिंग जेल समाधान के साथ शेष खाली भाग भरें ।
  3. जल्दी से कोई बुलबुले कुओं के नीचे फंसे रहना सुनिश्चित कर रही है, स्टैकिंग जेल परत में एक १.५ mm जेल कंघी डालें । बहुलकीकरण प्रतिक्रिया की प्रगति को ट्रैक करने के लिए बचे हुए polyacrylamide समाधान का उपयोग करें । जब ट्यूब में polyacrylamide पूरी तरह से जम गया है, प्रतिक्रिया पूर्ण (~ 10 मिनट) है ।
  4. धीरे से कंघी हटाने और जेल कैसेट के पीछे से टेप ।

5. ट्रो के लिए जैविक नमूनों की तैयारी

  1. वातानुकूलित सेल मीडिया, सेल lysates, टिशू homogenates, और एमएमपी मानकों को गैर-कम करने की शर्तों2के अंतर्गत कहीं और बताए गए अनुसार तैयार करें । नमूनों को हीट न करें ।
  2. उदाहरण के लिए, वातानुकूलित कक्ष मीडिया निम्नानुसार तैयार करें:
    1. प्लेट ४०,००० कोशिकाओं/सेमी2 कोशिकाओं में एक 6 अच्छी तरह से थाली में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) संस्कृति मीडिया । 24 घंटे के लिए एक humidified चैंबर (5% ३७ डिग्री सेल्सियस पर2 सह) में कोशिकाओं की मशीन और उंहें 70-80% संगम तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं ।
      नोट: यदि कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद वांछित प्रवाह तक पहुंच नहीं है, उंहें 10% FBS संस्कृति मीडिया में एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें । एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए एक humidified चैंबर (5% ३७ डिग्री सेल्सियस पर2 CO) में कोशिकाओं की मशीन ।
    3. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, एक अच्छी तरह से वातानुकूलित मीडिया इकट्ठा । १२०० rpm पर मीडिया के लिए 3 मिनट के लिए किसी भी सेल मलबे को हटाने के लिए केंद्रापसारक । supernatant ले लो और एक 15 मिलीलीटर, 10 केडीए आणविक वजन कटऑफ केंद्रापसारक फिल्टर इकाई का उपयोग कर ध्यान केंद्रित । ४,००० x g में 15 मिनट के लिए एक निश्चित कोण रोटर में 15 मिनट के लिए एक झूलते बाल्टी रोटर या ५,००० एक्स जी में फ़िल्टर इकाइयों केंद्रापसारक ।
      नोट: यह चरण वैकल्पिक है लेकिन पेप्टाइड zymography जैल में proteolytic बैंड की तीव्रता को बढ़ा सकते हैं ।
    4. एक ताजा १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए केंद्रित निस्पंदन स्थानांतरण । Aliquot और स्टोर नमूनों पर-८० ° c अप करने के लिए तीन फ्रीज-गल चक्र के लिए ।
  3. एक मानक प्रोटीन ठहराव परख (जैसे बीसीए, ब्रैडफोर्ड परख, आदि) का उपयोग प्रोटीन सामग्री बढ़ाता है ।

6. पेप्टाइड Zymography जैल में जैविक नमूनों की ट्रो

  1. पारंपरिक zymography नमूना बफर में नमूनों को भंग (६२.५ mM Tris-HCl, pH ६.८, 25% ग्लिसरॉल, 4% एसडीएस, ०.०१% bromophenol ब्लू) । सेल और ऊतक के नमूनों के लिए, ~ 30 µ जी कुल प्रोटीन के प्रति अच्छी तरह से सिफारिश की है, और 50-100 एमएमपी मानकों के लिए प्रोटीन के एनजी ।
  2. जोड़ने के ४०० मिलीलीटर 1x Tris-Glycine एसडीएस जेल उपकरण के लिए चल रहे बफर । प्रति अच्छी तरह से नमूना के ३५ µ एल तक लोड । १.५ घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १२० वी पर नमूने चलाने के लिए या जब तक आणविक भार मानकों से संकेत मिलता है कि ब्याज की teases पेप्टाइड समाधान जेल परत के भीतर कर रहे हैं (जो एक दिखाई नारंगी रंग है).
    नोट: सबसे MMPs और उनके वेरिएंट 35-100 केडीए की सीमा के भीतर गिर जाते हैं. जब आणविक वजन मानकों से संकेत मिलता है कि उन वजन पेप्टाइड समाधान जेल परत के भीतर हैं, ट्रो रोका जा सकता है । इसी सिद्धांत को ज्ञात आणविक भार के साथ छेड़ने के अन्य वर्गों के लिए लागू किया जा सकता है. यदि आणविक भार की एक बड़ी रेंज पर एकाधिक चिढ़ाने का पता लगाने में रुचि है, संपति जेल परत के आकार को कम करने और पेप्टाइड संपति जेल परत के आकार में वृद्धि ।
  3. ट्रो के बाद, प्लास्टिक की कैसेट और धो जैल से जैल निकालें renaturing बफर में २.५% ट्राइटन एक्स-१००, 1 µ एम ZnCl2, और 5 मिमी CaCl2 में कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए तीन बार ५० मिमी में Tris-एचसीएल, पीएच ७.५.
  4. एक विकासशील बफर समाधान के लिए स्थानांतरण जैल 1% ट्राइटन एक्स-१००, 1 µ एम ZnCl2 और 5 मिमी CaCl2 में ५० मिमी Tris-एचसीएल, 15 मिनट के लिए पीएच ७.५ । नए विकासशील बफर समाधान और मशीन के साथ बदलें ३७ ° c पर 24 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के तहत , सुनिश्चित कर लें कि जैल समाधान में पूरी तरह से submersed हैं ।

7. पेप्टाइड Zymography जैल की इमेजिंग

  1. 24 घंटे के बाद, एक फ्लोरोसेंट जेल स्कैनर का उपयोग कर छवि जैल/imager उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर । उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया पेप्टाइड जैल Fluorescein के साथ संयुग्मित रहे हैं और ४८८ एनएम के एक उत्तेजना फिल्टर और ५२१ एनएम के उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर imaged थे । अपने fluorophore के लिए उपयुक्त फ़िल्टर का उपयोग करना proteolytic गतिविधि का पता लगाने को अधिकतम करेगा ।
    नोट: छवियां भी एक यूवी transilluminator, अक्सर ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग डीएनए जैल के इमेजिंग के लिए इस्तेमाल के साथ सुसज्जित एक जेल imager के साथ लिया जा सकता है । छवि यूवी transilluminator (३६५ एनएम) की स्थापना और ५९० एनएम के एक उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर जैल ।
  2. 13कहीं वर्णित के रूप में ImageJ का उपयोग कर बैंड तीव्रता का आचरण densitometric मूल्यांकन ।

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Representative Results

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विधि का उपयोग यहां वर्णित है, दो फ्लोरोसेंट चिढ़ाना-ह्रास पेप्टाइड्स polyacrylamide जैल में शामिल किया गया: GGPQG ↓ IWGQK (खूंटी)2सी (पाठ और आंकड़े भर में QGIW के रूप में संक्षिप्त) और GPLA ↓ सीpMeOBzlWARK (खूंटी)2 सी (पाठ और आंकड़े भर में LACW के रूप में संक्षिप्त) । ↓ दरार की साइट को इंगित करता है । QGIW एक कोलेजन-मैं सेलुलर collagenases14का पता लगाने के लिए डिज़ाइन अनुक्रम व्युत्पंन है । LACW एक अनुक्रम है कि एमएमपी-14 और एमएमपी-1115का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है । पेप्टाइड्स dabcyl (शमन) और fluorescein (fluorophore) N-hydroxysuccinimide (एन एच एस)-एस्टर-अमीन रसायन विज्ञान11का उपयोग कर के साथ लेबल कर रहे हैं । यह नए fluorogenic पेप्टाइड्स कि पर्याप्त प्रतिदीप्ति शमन है विकसित करने के लिए मुश्किल हो सकता है और मानक बफ़र्स में घुलनशील हैं । इसलिए, एक सी टर्मिनल cysteine शामिल करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट तंग सब्सट्रेट से पेप्टाइड अनुक्रम अनुकूलन अक्सर नए fluorogenic सेंसर विकसित करने के लिए एक सफल रणनीति है । करने के लिए पेप्टाइड zymography की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए अलग जटिल तंग मिश्रण, वातानुकूलित मीडिया दो अलग कैंसर सेल लाइनों से एकत्र किया गया था । HT1080 fibrosarcoma कोशिकाओं और एमडीए-एमबी-२३१ स्तन ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं 24 घंटे के लिए 10% FBS मीडिया में चढ़ाया गया, जिसके बाद मीडिया एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए सीरम मुक्त मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया गया था । वातानुकूलित मीडिया के नमूने एकत्र किए गए और 10 केडीए आणविक वजन कटऑफ केंद्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग कर ध्यान केंद्रित किया । मीडिया की प्रोटीन सामग्री एक मानक µ बीसीए परख का उपयोग कर मापा गया था । वातानुकूलित मीडिया से प्रोटीन के 30 µ जी electrophoresed थे । सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, प्रकार के साथ कुओं मैं बैक्टीरियल collagenase (१०० µ जी) या शुद्ध, सक्रिय एमएमपी-9 (१२५ एनजी) भी शामिल थे । जैल 24 ज के लिए बफर विकसित करने में जैल (चित्रा 2) के भीतर सड़ सब्सट्रेट के एमएमपी दरार की अनुमति दी गई और फिर imaged । फ्लोरोसेंट इमेजिंग कई बैंड से पता चला LACW पेप्टाइड जैल (चित्रा 2a14) के भीतर दिखाई दे रहे थे, जबकि केवल एक ही बैंड QGIW जैल (चित्रा 2 डी14) के भीतर स्पष्ट किया गया था । जिलेटिन zymography की तुलना में (चित्रा 2g14), LACW जैल अधिक proteolytic बैंड का पता लगाने में सक्षम थे, पेप्टाइड zymography की क्षमता से जैविक नमूनों के भीतर मौजूद एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए प्रदर्शन पारंपरिक तरीकों देशी सब्सट्रेट का उपयोग कर ।

MMPs के रूप में visualized बैंड की पहचान सत्यापित करने के लिए, पेप्टाइड zymography जैल विकास बफर में या तो 20 µ एम GM6001, एक व्यापक स्पेक्ट्रम एमएमपी अवरोध करनेवाला, या 10 µ एम ई-६४, एक सामान्य cathepsin अवरोधक से युक्त थे । GM6001 के साथ LACW पेप्टाइड जैल का उपचार (चित्रा 2 बी14) बैंड की तीव्रता में कमी आई, जबकि ई के साथ उपचार-६४ (चित्रा 2c14) कोई समझदार प्रभाव था. GM6001 के साथ QGIW पेप्टाइड जैल का उपचार पहले से देखा बैंड की पूरी पृथक में परिणाम (चित्रा 2E14). उम्मीद के मुताबिक ई-६४ का कोई असर नहीं हुआ (चित्रा 2F14) । दोनों पेप्टाइड जैल में, GM6001 शुद्ध एमएमपी-9 गतिविधि बाधित लेकिन बैक्टीरियल collagenase गतिविधि को प्रभावित नहीं किया, आगे की पुष्टि है कि प्रतिदीप्ति में visualized वृद्धि परीक्षण जैविक के भीतर proteolytic उपस्थित द्वारा MMPs गतिविधि का परिणाम था नमूने.

मौजूदा सोने के मानक, जिलेटिन zymography, एक संवेदनशीलता विश्लेषण के लिए पेप्टाइड zymography की संवेदनशीलता की तुलना शुद्ध, सक्रिय एमएमपी-9 का उपयोग कर आयोजित किया गया था । एमएमपी के सीरियल कमजोर पड़ने-9 (1-250 एनजी) LACW, QGIW और जिलेटिन zymography जैल (चित्रा 314) में electrophoresed थे । विकास और फ्लोरोसेंट इमेजिंग, बैंड तीव्रता के साथ quantified थे ImageJ और सामान्यीकृत बैंड गहनता के भूखंडों के लिए चुनाव आयोग५० मूल्यों की गणना-एकाग्रता है कि अधिकतम संकेत के ५०% का उत्पादन उत्पंन कर रहे थे (चित्र बी 14). LACW पेप्टाइड जैल के लिए एमएमपी-9 की छोटी सांद्रता का पता लगाने में सक्षम थे, १७.२८ एनजी के एक चुनाव आयोग५० मूल्य के साथ, के रूप में ५९.५० एनजी और ३१.८५ एनजी, क्रमशः के मूल्यों के साथ QGIW और जिलेटिन zymograms की तुलना में । इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि पेप्टाइड zymography का उपयोग मेल कर सकते हैं या जिलेटिन की तरह देशी सब्सट्रेट की संवेदनशीलता सीमा से अधिक.

Figure 1
चित्रा 1: फ्लोरोसेंट पेप्टाइड zymography प्रक्रिया की योजनाबद्ध । (क) बहु परत polyacrylamide संपति जेल की तैयारी. एक मानक 10% हल जेल समाधान पेप्टाइड zymography जेल की पहली परत बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक दूसरा 10% जेल एक बुझती, फ्लोरोसेंट पेप्टाइड और एक azido-PEG3-maleimide linker अणु युक्त परत को हल तो पहली परत के शीर्ष पर बहुलक है । अंतिम शीर्ष परत एक 5% स्टैकिंग जेल है । (ख) गैर-कम शर्तों के अंतर्गत मानक ट्रो कार्यात्मक polyacrylamide जैल में अलग-थलग करने वाले नमूनों को पृथक करने के लिए उपयोग किया जाता है. जैल एसडीएस को हटाने और प्रोटीन को पुनर्स्वरूपित करने की अनुमति देने के लिए धोया जाता है । जैल तो ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक विकास बफर में मशीन कर रहे हैं, fluorogenic पेप्टाइड्स सट करने के लिए अनुमति देता है, वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति में जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रतिदीप्ति, को तंग गतिविधि के साथ इसी, तो ४८८ एनएम और ५२१ एनएम के उत्सर्जन के एक उत्तेजना में एक फ्लोरोसेंट जेल imager का उपयोग कर कब्जा कर लिया है (से अनुमति के साथ रूपांतरित तकनीक और भविष्य विज्ञान14) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल का पता लगाने-मानव कैंसर सेल लाइनों में स्रावित teases । collagenase एंजाइम का विश्लेषण (१०० µ g), एमएमपी-9 (१२५ एनजी) और वातानुकूलित सेल मीडिया से HT1080 fibrosarcoma (30 µ g) और एमडीएस-एमबी-२३१ ग्रंथिकर्कटता स्तन कैंसर (30 µ ग्राम) LACW और QGIW पेप्टाइड जैल में सेल लाइनों । जैल DMSO (वाहन नियंत्रण) (एक & डी), GM6001 (बी & ई) या ई-६४ (सी & एफ)के साथ इलाज के साथ इलाज के साथ इलाज किया गया । (छ) HT1080 और एमडीए के जिलेटिन zymogram-एमबी-२३१ वातानुकूलित सेल मीडिया (से अनुमति के साथ रूपांतरित तकनीक और भविष्य विज्ञान14) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: पेप्टाइड और जिलेटिन Zymograms के एमएमपी-9 संवेदनशीलता की तुलना. (क) QGIW (ऊपर), LACW (मध्य) और जिलेटिन (नीचे) zymography जैल एमएमपी-९ के धारावाहिक कमजोर पड़ने के अधीन थे. (ख) सामान्यीकृत बैंड तीव्रता एमएमपी-9 एकाग्रता और एक चार पैरामीटर चर ढलान वक्र के लिए फिट के खिलाफ साजिश रची गई । चुनाव आयोग५० मान आधा अधिकतम संकेत एकाग्रता से संकेत मिलता है । परिणाम n = 3, मतलब एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे है (से अनुमति के साथ अनुकूलित-तकनीक और भविष्य विज्ञान14) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संपति जेल
स्टॉक का. अंतिम. 5 जैल 10 जैल
Acrylamide/बीआईएस-Acrylamide (19:1) ४०% 10 10 मिलीलीटर 20 मिलीलीटर
Tris-एचसीएल नं० ८.७ 1 मीटर ०.३७५ मीटर 15 मिलीलीटर 30 एमएल
सोडियम Dodecyl सल्फेट (एसडीएस) 20 ०.१०% २०० µ l ४०० µ l
क H2क हे -- -- १४.४ एमएल २८.७ एमएल
TEMED -- -- ४० µ l ८० µ l
अनुप 10 ०.१०% ४०० µ l ८०० µ l
कुल मात्रा ४० एमएल ८० एमएल
पेप्टाइड संपति जेल
स्टॉक का. अंतिम. 5 जैल 10 जैल
Acrylamide/बीआईएस-Acrylamide (19:1) ४०% 10 5 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर
Tris-एचसीएल नं० ८.७ 1 मीटर ०.३७५ मीटर ७.५ एमएल 15 मिलीलीटर
सोडियम Dodecyl सल्फेट (एसडीएस) 20 ०.१०% १०० µ l २०० µ l
क H2क हे -- -- ६.५ µ l 13 मिलीलीटर
फ्लोरोसेंट पेप्टाइड 10 एमएम ७५ µ m १५० µ l ३०० µ l
Azido-PEG3-Maleimide CrossLinker ७५ एमएम १.५ एमएम ४०० µ l ८०० µ l
TEMED -- -- 20 µ l ४० उल
अनुप 10 ०.१०% २०० µ l ४०० µ l
कुल मात्रा 20 मिलीलीटर ४० एमएल
स्टैकिंग जेल
स्टॉक का. अंतिम. 5 जैल 10 जैल
Acrylamide/बीआईएस-Acrylamide (19:1) ४०% 5 २.५ एमएल 5 मिलीलीटर
Tris-एचसीएल नं० ६.९ 1 मीटर ०.१२५ मीटर २.५ एमएल 5 मिलीलीटर
सोडियम Dodecyl सल्फेट (एसडीएस) 20 ०.१०% १०० µ l २०० µ l
क H2क हे -- -- १४.७५ एमएल २९.५ एमएल
TEMED -- -- ५० µ l १०० µ l
अनुप 10 ०.१०% १०० µ l २०० µ l
कुल मात्रा 20 मिलीलीटर ४० एमएल

तालिका 1: फ्लोरोसेंट पेप्टाइड zymography जैल तैयार करने के लिए तालिका एजेंट । बहु परत पेप्टाइड zymography जेल की तैयारी के लिए सांद्रता और मात्रा ।

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Discussion

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वर्तमान zymographic तकनीक प्रोटियोलिसिस का पता लगाने के लिए polyacrylamide जैल में देशी सब्सट्रेट का निगमन पर भरोसा करते हैं । हालांकि इन तकनीकों का व्यापक उपयोग हुआ है, वे अभी भी वे का पता लगा सकते है की संख्या में सीमित हैं । यहां, एक प्रोटोकॉल में बताया गया था जिसमें फ्लोरोसेंट, polyacrylamide संपति जेल में शामिल हैं, को छेड़ो-ह्रास पेप्टाइड्स । आबंध युग्मन एक azido-PEG3-maleimide linker अणु का उपयोग कर जुदाई और अलगाव की एक व्यापक विविधता का पता लगाने में सक्षम बनाता है से वर्तमान में देशी सब्सट्रेट के साथ प्राप्य है । फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स के अत्यधिक स्वरित्र प्रकृति के शोधकर्ताओं को डिजाइन करने के लिए सब्सट्रेट्स कि ब्याज की अपनी teases लक्ष्य कर सकते है की क्षमता । कई पेप्टाइड सब्सट्रेट पेप्टाइड पुस्तकालयों का उपयोग कर की एक विस्तृत विविधता के लिए पहचान की गई है, और वाणिज्यिक स्रोतों के निर्माण कस्टम पेप्टाइड्स की एक संख्या बढ़ रही हैं । यह नए fluorogenic पेप्टाइड्स कि पर्याप्त प्रतिदीप्ति शमन है विकसित करने के लिए मुश्किल हो सकता है और मानक बफ़र्स में घुलनशील हैं । इसलिए, एक सी-टर्मिनल cysteine शामिल करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट तंग सब्सट्रेट से पेप्टाइड अनुक्रम अनुकूलन अक्सर नए fluorogenic सेंसर विकसित करने के लिए एक सफल रणनीति है ।

जबकि इस प्रोटोकॉल को पूरा करने, देखभाल फ्लोरोसेंट पेप्टाइड जैल हैंडलिंग जबकि प्रकाश के लिए अत्यधिक जोखिम को रोकने के रूप में यह काफी का पता लगाया फ्लोरोसेंट संकेत कम कर सकते है लिया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, प्रत्येक जेल में प्रयुक्त पेप्टाइड की वर्तमान एकाग्रता ७५ µ मीटर है । इस पेप्टाइड के संरक्षण के लिए कम सांद्रता के लिए समायोजित किया जा सकता है, ध्यान में रखते हुए कि azido-PEG3-maleimide समाधान में कम से कम एक 20 दाढ़ अतिरिक्त पेप्टाइड के लिए समाधान करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए । azido-PEG3-maleimide किट 3 आकारों (25, १०० और १००० मिलीग्राम) में खरीदा जा सकता है । लेखक तैयार समाधान के रूप में 25 मिलीग्राम किट खरीदने की सिफारिश केवल-20 डिग्री सेल्सियस पर समय की छोटी अवधि में संग्रहित किया जा सकता है । इसके अलावा, एक 25 मिलीग्राम किट 10 पेप्टाइड जैल, जो तैयारी के 3 हफ्तों के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए तैयार करने के लिए पर्याप्त है ।

zymography की सीमाओं में से एक की वजह से महत्वपूर्ण आणविक भार में ओवरलैप के कारण चिढ़ा बैंड की सटीक पहचान समझदार में कठिनाई है । भविष्य के अध्ययन में, यह माध्यमिक विश्लेषण आचरण करने के लिए अपनी पहचान जैसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री16,17के रूप में तकनीक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा । zymography की एक और सीमा एसडीएस और ट्रो द्वारा आंशिक denaturing के बाद उनके सक्रिय अनुरूप करने के लिए प्रोटीन का खुलासा है । इन प्रक्रियाओं proteolytically निष्क्रिय प्रोटीन, सक्रिय प्रतिपादन की सक्रिय रचना में परिवर्तन पैदा कर सकता है । उदाहरण के लिए, प्रो-एमएमपी-2 जिलेटिन zymograms में एक मध्यवर्ती सक्रिय फार्म के लिए अपनी renaturation के कारण निरोधात्मक समर्थक डोमेन बरकरार होने के बावजूद पता लगाया जा सकता है । एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) या पश्चिमी दाग की तरह अनुपूरक तरीकों को पहचान और ब्याज की एक चिढ़ा की कुल उपस्थिति निर्धारित किया जा सकता है ।

यह लेख वर्तमान zymographic तकनीकों की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए फ्लोरोसेंट पेप्टाइड सब्सट्रेट का उपयोग प्रदर्शित करता है । शुद्ध एमएमपी-9 का उपयोग करना, एक एकाग्रता ढाल विश्लेषण LACW, QGIW और जिलेटिन zymography जैल की तुलना आयोजित किया गया था । वर्तमान में, जिलेटिन zymography स्वर्ण मानक तकनीक है जिसके द्वारा gelatinases (एमएमपी-2 और-9) जैविक नमूनों में पाए जाते हैं । चुनाव आयोग की तुलना तीन सब्सट्रेट के५० मूल्यों, LACW पेप्टाइड जैल सबसे कम मूल्यों था, सबसे अधिक संवेदनशीलता का संकेत. विशिष्ट टीज़ का पता लगाने के लिए बनाया गया अलग पेप्टाइड दृश्यों का उपयोग संभवतः आगे भी इन संवेदनशीलता को बढ़ाने कर सकते हैं । ऐसे 4-aminophenylmercuric एसीटेट (अपमा) या हेपरिन के रूप में एक एमएमपी सक्रिय एजेंट के साथ जैल का उपचार भी पहले वर्णित18के रूप में एक कमजोर संकेत को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

जैविक अध्ययन के लिए गतिविधि को छेड़ने की माप के अलावा, को चिढ़ाने-अपमानजनक पेप्टाइड भी अक्सर ऊतक इंजीनियरिंग और दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए crosslinking सिंथेटिक hydrogels के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । नियंत्रित क्षरण इन अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है । वर्तमान में, इन पेप्टाइड्स की गिरावट कैनेटीक्स एकल, शुद्ध एंजाइमों का उपयोग विशेषता है । हालांकि, जो एंजाइमों कोशिकाओं वास्तव में उत्पादन का निर्धारण और इन पेप्टाइड्स के दरार के लिए जिंमेदार है निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो गया है । पेप्टाइड zymography का उपयोग कोशिका और ऊतक-विशिष्ट एंजाइम जारी करने के लिए बहुत इन पेप्टाइड crosslinking दृश्यों के तर्कसंगत डिजाइन में सहायता करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

वित्तपोषण ओहियो राज्य विश्वविद्यालय इंजीनियरिंग, बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग के कॉलेज, और व्यापक कैंसर केंद्र आर्थर जी जेंस कैंसर अस्पताल और रिचर्ड जे Solove अनुसंधान संस्थान द्वारा प्रदान की है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes ThermoFisher Scientific NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs ThermoFisher Scientific NC3510
1x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
20% SDS Solution Ambion AM9820
3x Zymography Sample Buffer Bio-Rad 1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) Ambion AM9022
6 Well Tissue Culture Plates ThermoFisher Scientific 087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) Sigma-Aldrich UFC201024
Ammounium Persulfate Sigma-Aldrich A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit Click Chemistry Tools AZ107
Calcium Chloride ThermoFisher Scientific BP510100
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231
Isopropanol Fisher Scientific A416P
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826
Round Bottom Flask (100 mL) Fisher Scientific 50-873-144
Septum Rubber Stopper Fisher Scientific 50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) Fisher Scientific 14-823-434
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trizma hydrochlroide Sigma-Aldrich T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager GE Amersham 8149-30-9410
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086

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References

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फ्लोरोसेंट पेप्टाइड Zymography द्वारा चिढ़ा गतिविधि का पता लगाने
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Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).More

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).

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