Здесь мы представляем подробный протокол для модифицированных zymographic техники, в котором флуоресцентные пептиды используются как разложению субстрат вместо родной белков. Электрофорез биологических образцов в флуоресцентные пептидные zymograms позволяет выявлять широкий спектр протеаз, чем предыдущие методы zymographic.
Этот метод предназначен для измерения протеолитической активности сложных биологических образцов. Образцы разделены молекулярный вес с помощью электрофореза через разрешая гель, встроенных с разложению субстрата. Этот метод отличается от традиционных гель Зимография закаленном fluorogenic пептид ковалентно включены в разрешая гель вместо полной длины белков, таких как желатин или казеина. Использование fluorogenic пептидов позволяет прямое обнаружение протеолитической активности без дополнительных шагов окрашивание. Ферменты в биологических образцах расщеплять пептид закаленном fluorogenic, что привело к увеличению в флуоресцировании. Флуоресцентный сигнал в гелях затем образы с сканера стандартные флуоресцентные гель и количественно с помощью денситометрия. Использование пептидов как разложению субстрат существенно расширяет возможных протеаз обнаружению с zymographic методами.
Гель Зимография — биологические метод, используемый для измерения протеолитической активности в биологических образцах, например жидкости организма или клетки культуры СМИ1,2,3. Образцы разделены их молекулярным весом с электрофорезом через гель полиакриламида, встроенный с разложению субстрата. Общие разложению субстратов включают желатина, казеин, коллагена и эластина, которые были использованы для измерения активности матрицы металлопротеиназ (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 и -11, в дополнение к разнообразным катепсинов1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. после электрофореза, ферменты renatured и деградировать белок в гель. В традиционных гель Зимография гель запачкается с белком красителя, например Кумасси синий, и протеазы деятельность определяется как потери сигнала, т.е. белые полосы (деградации белка) на синем фоне.
Здесь мы описываем протокол для альтернативного метода Зимография геля, в котором разложению субстрата является короткий, fluorogenic пептид ковалентно включены в геле полиакриламида (рис. 1). Замена синтетических пептидов как разложению субстратов позволяет выявлять широкий спектр протеаз по сравнению с традиционными гель Зимография с родной белки9. Ковалентная связь fluorogenic пептид предотвращает пептид диффузии и миграции во время электрофорез с предыдущие методы9,10. Кроме того использование подложке fluorogenic позволяет прямое обнаружение активности протеаз без дополнительных окрашивания и исключения окрашивания шаги. Общая цель этого метода является обнаружение активности протеаз в биологических образцах через ковалентных включение fluorogenic пептидов в зимограммы гели.
Современные zymographic методы полагаются на включение родной субстратов в полиакриламидных гелей для обнаружения протеолиза. Хотя эти методы имеют получил широкое применение, они по-прежнему ограничены в количество протеаз, которые они могут обнаружить. Здесь протокол был описан, в котор?…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование предоставлено Огайо государственного университета инженерного колледжа, биомедицинская инженерия и всеобъемлющем онкологический центр – Артур G. Джеймс рака больницы и Ричард J. Solove научно-исследовательский институт.
1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |