Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifikasjon av meglere på T-celle reseptor signalering via Screening av kjemiske Inhibitor biblioteker

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58946
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 1,4
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Singapore Immunology Network, A*STAR, 3Curiox Biosystems, 4Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit (KU) Leuven
* These authors contributed equally

Summary

Dette dokumentet bruker en flyt-cytometri-baserte analysen til skjermen biblioteker av kjemiske hemmere for identifisering av hemmere og sine mål som påvirker T-celle reseptor signalering. Metodene som er beskrevet her kan også utvides for høy gjennomstrømming screenings.

Abstract

T-celle reseptor (TCR) signalering pathway består av en rekke meglere som overfører signaler ved aktivering av TCR. Forskjellige strategier har vært foreslått og implementert for identifisering av nye meglere TCR signalnettverk, som ville forbedre forståelsen av T-celle prosesser, inkludert aktivering og thymic utvalg. Vi beskriver en screening analysen som gjør identifisering av molekyler som påvirker TCR signalering basert på aktivering av utvikle thymocytes. Sterk TCR signaler føre utvikle thymocytes aktivere apoptotisk maskiner i en prosess kjent som negative utvalg. Gjennom anvendelse av kinase hemmere er de med mål som påvirker TCR signalering kan overstyre prosessen med negative utvalg. Metoden beskrevet i dette dokumentet kan brukes til å identifisere hemmere av kanoniske kinaser med etablerte roller i TCR signalveier og hemmere av nye kinaser ennå å bli etablert i TCR signalveier. Screening strategien her kan brukes til skjermer for høyere gjennomstrømming for identifikasjon av romanen druggable mål i TCR signalering.

Introduction

T-celler er en avstamning av lymfocytter spiller en sentral rolle i vedlikehold av adaptiv immunitet. De uttrykke TCR, slik at de kan anerkjenne deres ligander, komplekser som består av et store histocompatibility kompleks molekyl (MHC) med et bundet peptid, som finnes på overflater av antigen presentere celler (APCs). Følge av TCR signalveien gjennom TCR/MHC samspillet er avgjørende for T-celle aktivering og utvikling1.

I T-celle development overføre bein margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller (HSCs) mot thymus, der de gjennomgå differensiering og gå gjennom stadier av T celle avstamning progresjon2. Dobbel-positive (DP) thymocytes, uttrykke både CD4 og CD8 coreceptors, engasjere seg med selv-peptid/MHC på APCs. Thymocytes med en moderat affinitet til deres selv-peptid/MHC ligander moden til å bli enkelt-positive (SP) CD4 eller CD8 thymocytes, en prosess kalt som positiv valg. Derimot gjennomgår thymocytes mottar overdreven TCR stimulering gjennom selv-peptid/MHCs apoptose via negativ utvalg3,4. Denne prosessen med stimulering-indusert, caspase-avhengige apoptose kan være etterlignet i vitro ved å stimulere thymocytes, for eksempel med anti-CD3/28 antistoff perler5. Modne T-celler som passerer utvelgelsesprosessen er aktivert av ikke-selv-peptid/MHC ligander fra APCs i periferien. Self-peptid/MHCs er fortsatt relevant for eksterne T-celler, i sammenheng med tonic Signaliser for overlevelse og homøostatisk spredning, differensiering av hjelper T-celler og styrking av T-celle svar til ikke-selv-peptid/MHCs gjennom coagonism6,7,8,9. Høy affinitet TCR binding til peptid/MHC ligand aktiverer flere nedstrøms signalveier, som involverer mange signalnettverk molekyler utgjør en kompleks TCR signalering nettverk10. TCR signalveier har vært studert i flere tiår, og ennå oppdagelsen av nye meglere av veien viser ingen tegn til avta11,12. Modulering av TCR signalveier har klinisk relevans og kan omfatte potentiating T-celle svar for immunterapeutisk programmer eller hemming av T-celle svar for kontroll av autoimmunitet13. Strategier for modulering av T-celle svar avhenger hovedsakelig avbrudd i kinase eller fosfatase aktivitet14,15,16.

Vi beskriver en anvendelse av en flyt-cytometri-baserte analysen for screening av små kjemiske forbindelser til å modulere TCR signalisering og T-celle aktivering17til. Analysen er avhengig av fenomenet thymocytes aktivere apoptose veien når de utsettes for sterke TCR signaler. Analysen er tilstrekkelig sensitive til å identifisere endringer i stimulering styrke; rugende thymocytes uttrykke transgene TCR med peptid/MHC tetramers med økende affinitet resulterte i en tilsvarende økning i caspase aktivisering-brukt som et mål av apoptotisk svar5. For skjermen, vi brukte et bibliotek av kinase hemmere og vurdert deres evne til å modulere thymocyte svaret å sterk TCR signaler.

Flere flyt-cytometri-basert eller fluorescens-reporter-baserte strategier har blitt beskrevet for høy gjennomstrømming screening av et utvalg av perifer aktivisering fenotyper i ulike T-celle delsett. Slike strategiene omfatter bruk av genetisk fluorescerende journalister å vurdere timing og omfanget av T-celle aktivering18, bruk av omfatter degranulering som en presentasjon av cytotoksiske T-celle aktivitet19,20, og analyse av den fosforylering av ulike proteiner involvert i mobilnettet signalering21.

Screening analysen presenteres her er vellykket identifisere forbindelser som hemmer kanoniske molekyler av TCR signalering veien, så vel som potensielle, romanen forbindelser med hemmende effekt på TCR signalering. For eksempel identifisert vi hemmere av GSK3β og Hsp90 som nye forbindelser påvirker T-celle svar17. Analysen er kjøpedyktig skille hemmere som forstyrrer signaltransduksjon, på grunn av en reduksjon i apoptotisk svaret, fra TCR-uavhengig virkningene av hemmere på mobilnettet toksisitet. I tillegg til induksjon av apoptose måle vi også CD69 oppregulering og TCR downregulation som markører for aktivisering. Som TCR signalering nettverk er komplisert, kan bruken av flere readouts øke sjansene for å oppdage molekyler med spesifikke effekter på en enkelt bane. Her introduserer vi også bruk av en uavhengig av sentrifugering protokoll som en høy gjennomstrømming alternativ til de originale protokollen under fargingen cellene i forberedelse til flyt cytometric analysen. Analysen beskrevet i dette dokumentet bruker en liten sammensatt bibliotek med kinase hemmere, men i prinsippet kan det brukes for høyere gjennomstrømming screening. Biblioteket av valg kan også inkludere en rekke hemmere eller andre molekyler.

Protocol

I denne studien, ble 6 - til 8-uke-gamle mannlige og kvinnelige C57Bl/6 mus brukt. Mus ble avlet i dyr anlegget ved National University of Singapore (Singapore). National University of Singapore institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (IACUC) godkjent alle dyr eksperimentering.

1. forberedelse av Thymocyte suspensjon

  1. Euthanize mus i en CO2 kammer.
  2. Utføre fremgangsmåten i vev-kultur hette å unngå enhver kontaminering av i cellekulturer. Sikrer musa carcass til disseksjon bord, med pins, og spray musen med 70% etanol.
  3. Bruke et par saks, lage en loddrett snitt på ventral side, fra magen mot kjeven. Gjøre flere snitt langs hver av bakbena. Strekk huden for å avdekke ribbe buret og feste det.
  4. Kutt membranen og begge sider av ribbe buret fra den bakre enden med en saks. Løft ribbe buret og feste det til utsett thymus. Separat bindevev knyttet til thymus og ekstra thymus med en buet tang.
  5. Plass Brisselen i et godt av en 6-vel plate inneholder 5 mL av komplett RPMI medier.
    Merk: Vurdere å legge 10% kull-strippet fosterets bovin serum (FBS) til media for å forbedre thymocyte levedyktigheten hvis en lang ventetid er ventet mellom dissection og stimulering analysen.
  6. Forsiktig mash thymus, med den butte enden av en sprøyte, og cellene passere en 70 µM celle sil. Alternativt, for å samle thymocytes i en sunnere tilstand, vurdere å bruke to par tang å presse thymus og samle thymocytes at flyten av thymic epitel.
  7. Gå til celle teller, bruker en hemocytometer eller en automatisert celle teller instrument.

2. Serine Kinase hemmere til Nontoxic konsentrasjoner

Merk: Denne delen fokuserer på å forberede hemmere for bruk i T-celle aktiveringsskjermene. Hemmere brukes på høye konsentrasjoner kan forårsake celledød, som er en presentasjon av T-celle aktiveringsskjermene. Serien av fortynninger av hemmere mål å bestemme endelige konsentrasjonen av de personlige hemmere som ikke bør få apoptose uavhengig av TCR stimulering. Biblioteket av kinase hemmere brukt i denne studien ble kjøpt fra en ekstern leverandør. Listen over hemmere er inkludert i Tabellen for materiale.

  1. Utarbeidelse av plater kinase hemmere i lave konsentrasjoner
    1. For å forberede en tallerken med hemmere på 1 mM, legge til 10 µL av hemmere 90 µL av dimethyl sulfoxide (DMSO) for alle hemmere.
      Merk: Hemmere fra små molekyl biblioteket brukt i denne studien kommer i en lager konsentrasjon av 10 mM. Hvis hemmere i en pellet form, fremgangsmåten anbefalte rekonstituering fra leverandører. Hvis hemmere ikke finnes på 10 mM, forberede hemmer platene i alternative riktig konsentrasjoner i stedet, og Forbered separat føljetong fortynninger av hemmere med en egnet fortynningsfaktoren.
      Advarsel: I tilfeller av giftige hemmere, følg produsentens instruksjoner for sikker håndtering og avhending.
    2. For å forberede en tallerken med hemmere på 0,1 mM, legge til 10 µL av hemmere fra platen av 1 mM hemmere 90 µL av DMSO.
    3. For å forberede en tallerken med hemmere på 0,01 mM, legge til 10 µL av hemmere fra platen av 0,1 mM hemmere 90 µL av DMSO.
  2. Behandling av thymocytes med kinase hemmere
    1. Klargjør en thymocyte suspensjon som angitt i del 1.
    2. Fortynne thymocytes i fullstendig RPMI å få en thymocyte suspensjon av 5 x 106 celler/mL.
    3. Legge til 200 µL av thymocyte suspensjon i alle brønnene av en 96-brønns plate, ved hjelp av en flerkanals pipette.
    4. I hver brønn, legge 2 µL av hemmere fra tilsvarende godt av platen som inneholder 1 mM hemmere (siste konsentrasjonen av hemmere er 10 µM).
    5. I samme plate, Forbered fire brønner ubehandlet kontroller, fire brønner 5 µM deksametason-behandlet positiv kontroller og fire brønner kjøretøy-behandlet negative kontroller, ved å legge til 2 µL av DMSO.
    6. Inkuber thymocytes i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller over natten).
  3. Fastsettelse av egnet konsentrasjoner av personlige hemmere
    1. Spinn platen av thymocytes på 300 x g og 4 ° C, 5 min. Resuspend cellene i 250 µL av FACS vaskebuffer.
    2. Kjør en flyt cytometric analyse av prøvene og analysere resultatene med flyt cytometri analyseprogram.
    3. Angi prosenten av live cellene basert på FSC-SSC gating. Gating strategien er vist i figur 1B.
    4. Beregne gjennomsnittlig prosentandelen av live cellene basert på DMSO-behandlet kontrollene, som blir normalisert på 100%. Angi en vilkårlig vindu av akseptabel celledød (e.g.,20%). Hemmere som resulterte i prosent av levende celler under dette vinduet (i.e., under 80% av DMSO-behandlet kontrollene) er å bli testet igjen i lave konsentrasjoner.
    5. For hemmere som ikke bestod levedyktighet kriteriene i trinn 2.3.4, gjentar du trinnene fra trinn 2.2.1 - 2.3.4, men bruke platen av hemmere på 0,1 mM for trinn 2.2.4 i stedet for platen inneholder 1 mM-hemmere. Siste konsentrasjonen av hemmere her er 1 µM.
    6. For det hemmere som fortsatt produsere høye nivåer av celledød på 1 µM, teste hemmere 0,1 µM. Gjenta trinn 2.2.1 - 2.3.4, men bruke platen av hemmere 0,01 mM i trinn 2.2.4. Siste konsentrasjonen av hemmere her er 0,1 µM.
  4. Forberedelse av en lager tallerken kinase hemmere
    1. For hemmere som skal brukes ved 10 µM, legge til 10 µL av 10 mM hemmere 10 µL av DMSO.
    2. For hemmere brukes på 1 µM, legge til 1 µL av 10 mM hemmere 19 µL av DMSO.
    3. For hemmere brukes på 0,1 µM, legge til 1 µL av 10 mM hemmere 199 µL av DMSO (figur 1 c).
      Merk: Forberedt lager platen av hemmere er 500 x konsentrasjonen av den tiltenkte siste konsentrasjonen når lagt til av thymocyte suspensjon. Lager platen av hemmere kan tilberedes i PCR strimler eller i 96-brønnen plater.
    4. Lager platen av kinase hemmere kan brukes på thymocytes for screening i en vanlig sentrifugering-avhengige system (del 3, se figur 1A, fremgangsmåte 1 og 2) eller i et alternativt sentrifugering uavhengig system (seksjon 4, se Figur 1A, metode 3).

3. kinase Inhibitor biblioteket Screening (vanlig sentrifuge-baserte analysen)

  1. Behandling av thymocytes med kinase hemmere
    1. Klargjør en thymocyte suspensjon som angitt i del 1.
    2. Fortynne thymocytes i fullstendig RPMI å få en thymocyte suspensjon av 5 x 106 celler/mL.
    3. Legge til 200 µL av thymocytes hver brønn av en 96-brønns plate, ved hjelp av en flerkanals pipette. Plass platen på isen.
    4. Legg til 0,5 µL av hemmere av 96-brønns platen fra tilsvarende brønnene av hemmer lager plate forberedt i delen 2.4.
    5. Forbered åtte brønner ubehandlet kontroller. Forberede fire brønner kjøretøy-behandlet kontroller ved å legge til 0,5 µL av DMSO. Forberede fire brønner 5 µM deksametason-behandlet kontroller (figur 2).
  2. Stimulering av thymocytes bruker anti-CD3/CD28 perler
    1. 1 mL av perler og vaskes perler med 2 mL PBS. Separate perler med en magnetisk stå og Sug opp løsningen. Resuspend perler i 5 mL av fullstendig RPMI.
      Merk: Forholdet mellom perler celler er 1 til 2,5. Justere perler å ta, avhengig av antall brønner å stimulere og antall thymocytes brukes.
    2. Legge til 50 µL av perler i hvert inhibitor-behandlet utvalg, fire DMSO-behandlet prøvene og fire av de åtte ubehandlede prøvene. Legge til 50 µL av komplett RPMI gjenværende fire ubehandlet brønnene. Figur 2 viser det generelle oppsettet av platen.
    3. Bland innholdet av benytter en flerkanals pipette.
    4. Inkuber thymocytes i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller over natten).
  3. Farging av overflaten antigener
    1. Forbered et antistoff flekker blanding som inneholder anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 og anti-CD69 antistoffer. Fortynne antistoffer i FACS vaskebuffer (PBS med 0,5% bovin serum albumin [BSA]) i forholdet 1:200 (v/v).
      Merk: Vurdere optimalisere antistoff titers brukes til farging, stedet for å bruke faste antistoff fortynninger, å minimere variasjon i flekker over forskjellige eksperimenter og å forbedre signal-til-støy-forhold.
    2. Spinne platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min.
    3. Bla platen for å forkaste løsningen.
    4. På dette punktet, protokollen kan følge vanlig sentrifuge-avhengige protokollen (fortsette å gå 3.3.5, se figur 1A, metoden 1) eller alternativ sentrifugering uavhengig protokollen (fortsette å gå 4.4.4, se figur 1A, metoden 2).
    5. Resuspend cellene i 75 µL av flekker antistoff blandingen i trinn 3.3.1.
    6. Bland eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge dem på is 30 min.
  4. Fiksering av celler
    1. Vask brønner med 200 µL av FACS vaskebuffer og spinne platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min.
    2. Bla platen for å forkaste løsningen.
    3. Legge til fiksering/permeabilization buffer (kommer med aktiv caspase-3 apoptose kit, samme med 10 x perm/vaskebuffer nevnt i trinn 3.5.1 og anti-caspase-3 antistoffer i trinn 3.5.2) på 200 µL per brønn.
    4. Ruge på is 30 min.
  5. Intracellulær flekker for aktive caspase 3
    1. Forberede 1 x perm/vaskebuffer fortynne 5 mL 10 x perm/vaskebuffer i 45 mL ultrapure vann.
    2. Forberede intracellulær aktive caspase flekken ved å legge til 1,3 mL av anti-caspase-3 antistoff 6,5 mL 1 x perm/vaskebuffer. Antistoff perm/vaske bufferen er 1:5.
    3. Spinn platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min. bla platen forkaste løsningen. Vaske platen med 200 µL av 1 x perm/vaskebuffer.
    4. Gjenta trinn 3.5.3.
    5. Spinn platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min. bla platen forkaste løsningen. Legge til 75 µL av intracellulær caspase flekk i trinn 3.5.2 alle brønner.
    6. Bland eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge på is 1t.
    7. Vask prøvene med 200 µL av 1 x perm/vaskebuffer og spinne platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min.
    8. Bla platen for å forkaste løsningen. Vaske platen med 200 µL av 1 x perm/vaskebuffer. Spinne platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min.
    9. Bla platen for å forkaste løsningen og resuspend prøvene i 200 µL av FACS vaskebuffer.
    10. Kjør en flyt cytometric analyse av prøvene og analysere resultatene med FACS analyseprogram.
    11. Bruker en CD4 versus CD8 plot, gate på befolkningen i DP thymocytes med en positiv uttrykk av både CD4 og CD8 (figur 2, nederste halvdel). I DP thymocyte gate, Bestem prosentandelen av celler med aktivert caspase-3, med unstimulated prøven som negativ kontroll og deksametason som positive kontroll. For analyse av uttrykk for CD69 i DP thymocyte porten, bruke unstimulated prøven som kontrollen negative og stimulert prøven som positive kontrollen.
      Merk: Når gating på DP thymocytes, bekrefte at befolkningen i DP thymocytes Portes riktig for individuelle prøver. Stimulert celler downregulate overflate coreceptors og utilsiktede utelukkelse av hendelser kan oppstå hvis en stram DP gate brukes.

4. kinase Inhibitor biblioteket Screening (sentrifuge-uavhengig analysen)

  1. Behandling av thymocytes med kinase hemmere
    1. Klargjør en thymocyte suspensjon som angitt i del 1.
    2. Fortynne thymocytes i fullstendig RPMI å få en thymocyte suspensjon av 25 x 106 celler/mL.
    3. Legge til 40 µL av thymocytes hver brønn av en små volumer plate, ved hjelp av en flerkanals pipette. Plass platen på isen.
    4. Fortynne hemmere fra lager plate, DMSO og deksametason i fullstendig RPMI i fire deler av komplett RPMI forholdet til en del av hemmer/DMSO/deksametason (fortynningsfaktoren 5).
      Merk: Som volumene i denne små volumer platen er 5 ganger mindre enn i konvensjonelle metoden, hemmere og kontroll reagensene er utvannet femdoblet før du legger dem til thymocytes i platen.
    5. Legge til 0,5 µL av hemmere av 96-brønns platen fra tilsvarende brønnene av hemmer plate i trinn 4.1.4.
    6. Forbered åtte brønner ubehandlet kontroller. Forberede fire brønner kjøretøy-behandlet kontroller ved å legge til 0,5 µL av DMSO forberedt i trinn 4.1.4. Forberede fire brønner 5 µM deksametason-behandlet kontroller, bruker utvannet deksametason forberedt i trinn 4.1.4 (figur 2).
  2. Stimulering av thymocytes bruker anti-CD3/CD28 perler
    1. Kontroller at perlene er jevnt resuspended. 1 mL av perler og vaskes dem med 2 mL PBS. Separate perler med en magnetisk stå og Sug opp løsningen. Resuspend perler i 1 mL av fullstendig RPMI.
      Merk: Forholdet mellom perler celler er 1 til 2,5. Justere perler, avhengig av antall brønner å stimulere og antall thymocytes brukes.
    2. Legge til 10 µL av perle suspensjon hver inhibitor-behandlet prøve, fire DMSO-behandlet prøvene og fire av de åtte ubehandlede prøvene. Legge til 10 µL av komplett RPMI gjenværende fire ubehandlet brønnene. Figur 2 viser oppsettet generelle plate.
      NOTE Det siste bindet av brønnene er 50 µL, som er den maksimale kapasiteten av brønnene. Det er viktig å være forsiktig og holde platene oppreist, å unngå kryss-og søl.
    3. Hvis du vil blande, agitere platen ved hjelp av en microplate orbital shaker. Alternativt, bland innholdet av benytter en flerkanals pipette.
    4. Inkuber thymocytes i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller over natten) med en anti-fordampning lokk.
  3. Oppsett av platen vaskemaskinen
    Merk: Instruksjonene for å sette opp platen vaskemaskinen leveres av produsenten. Punktene er nevnt kort nedenfor. Omtrent er 150 mL løsning nødvendig for hvert grunning trinn.
    1. Prime vaskesystemet med 70% etanol som inneholder 1% mellom 20.
    2. Prime vaskesystemet med deionisert vann som inneholder 1% mellom 20.
    3. Prime vaskesystemet med FACS vaskebuffer.
  4. Farging av overflaten antigener
    1. Forbered et antistoff flekker blanding som inneholder anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 og anti-CD69 antistoffer. Fortynne antistoffer i FACS vaskebuffer i forholdet 1: 100 (v/v).
    2. Vaske platen 9 x, bruker 55 µL av FACS vaskebuffer per vask, bruker den automatiserte laminær strømning vaske system.
      Merk: På slutten av vasker, vil det være 25 µL av gjenværende volum i hver brønn.
    3. Resuspend cellene i 25 µL av flekker antistoff blandingen i trinn 4.4.1.
    4. Hvis utvalgene overføres fra en 96-brønns plate (fra trinn 3.3.4), resuspend cellene i 50 µL av antistoff blandingen i trinn 3.3.1 og overføre prøvene av små volumer platen. Dette trinnet tilsvarer metode nummer 2, som vist i figur 1A.
    5. Agitere platen med en microplate orbital shaker for å blande, blande eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge på is 30 min.
  5. Fiksering av celler
    1. Vaske platen 9 x, bruker 55 µL av FACS vaskebuffer per vask, bruker den automatiserte laminær strømning vaske system.
    2. Legge til fiksering/permeabilization buffer (kommer med aktiv caspase-3 apoptose kit, samme med 10 x perm/vaskebuffer nevnt i trinn 4.6.1 og anti-caspase-3 antistoffer i trinn 4.6.2) på 50 µL per brønn.
    3. Ruge på is 30 min.
  6. Intracellulær flekker for aktive caspase 3
    1. Forberede 1 x perm/vaskebuffer fortynne 25 mL 10 x perm/vaskebuffer i 225 mL ultrapure vann.
    2. Forberede intracellulær aktive caspase flekken ved å legge til 1 mL av anti-caspase-3 antistoff 2 mL 1 x perm/vaskebuffer. Antistoff perm/vaske bufferen er 1:2.
    3. Prime vaskesystemet med 1 x perm/vaskebuffer.
    4. Vaske platen 9 x med 1 x perm/vaskebuffer, på 55 µL for hver vask.
    5. Legg til 25 µL intracellulær caspase flekken i trinn 4.6.2 alle brønner.
    6. Agitere platen med en microplate orbital shaker for å blande, blande eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge på is 1t.
    7. Vaske platen 9 x med 1 x perm/vaskebuffer, på 55 µL for hver vask.
    8. Legg til 25 µL av FACS vaskebuffer alle brønnene.
    9. Overføre prøvene å være ferdig innen rør etter tilstrekkelig blande via pipettering.
    10. Legge til en annen 50 µL av FACS vaskebuffer tom brønnene og gjentar trinn 4.6.9.
    11. Gjenta 4.6.9 og 4.6.10 2 x til 200 µL av prøvene er samlet i være ferdig innen rørene.
      Merk: Hensikten med fremgangsmåtene i trinn 4.6.10 og 4.6.11 er å sikre en maks gjenoppretting av cellene fra små volumer platen. Hvis cellen tallene er ikke et problem, etter trinn 4.6.10, rør bare fylle opp den være ferdig innen til 200 µL med FACS vaskebuffer.
    12. Kjør en flyt cytometric analyse av prøvene og analysere resultatene med en FACS analyseprogram, som steg 3.5.11. Caspase-3 aktivisering og CD69 uttrykk er analysert i porten som inneholder CD4+CD8+DP thymocytes.

Representative Results

Tilnærming til screening analysen summeres i figur 1A. Kinase hemmere ble først vist for deres latente effekter på thymocyte levedyktighet. Som en positiv kontroll for apoptose, ble deksametason brukt som en proapoptotic agent. Gating for levende celle befolkningen var bestemt basert på ubehandlet negative kontrollene og deksametason-behandlet positiv kontrollene (figur 1B). Hemmere ble først testet på 10 µM på thymocytes, og prosentandelen av levedyktige cellers ble målt etter rugende 18 h. En 20%-vinduet for celledød ble valgt slik at forbindelsene som forårsaket en større enn 20% tap av celler i levende celle porten, sammenlignet med DMSO-behandlet utvalgene, ble testet i lave konsentrasjoner (figur 1B). Representant FACS tomter valgte inhibitor-behandlet prøver vises å illustrere levedyktighet analysen. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), en PI3K hemmer22, ikke sterkt økte celledød på 10 µM og inhibitor ble brukt på 10 µM for de påfølgende analyser. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), en dobbel hemmer PI3Kα/mTOR23, indusert høye nivåer av celledød 10 µM og på 1 µM men ikke på 0,1 µM og 0,1 µM ble identifisert som passer konsentrasjonen for programmet i nedstrøms analyser. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), en pan-protein kinase C hemmer med en etablerte evne til å indusere apoptose24, indusert betydelig celledød i alle konsentrasjoner testet, selv på 0,1 µM. Det ble brukt i påfølgende analyser på 0,1 µM som en mer positiv kontroll.

Siste konsentrasjonen av hemmere ble valgt basert på de høyeste konsentrasjonene der de ikke forsterke celledød med mer enn 20% av DMSO-behandlet prøvene. Med de siste konsentrasjonene av hemmere bestemt, var en lager tallerken med hemmere forberedt slik at alle hemmere var 500 ganger konsentrasjonen når brukt på cellene. Figur 1 c illustrerer plate oppsettet av lager plate, med de siste konsentrasjonene av hemmere. I alternativ protokollen for rugende cellene direkte i små volumer platene for laminær strømning vaske analysen, nødvendiggjort bruk av små volumer en ytterligere fortynning av hemmere. For å sikre at DMSO innholdet av kulturer etter hemmer tillegg ikke ville være for høyt for cellene, hemmere ble ytterligere fortynnet i fullstendig RPMI, webserverantallet fortynning av 5, slik at de var 100 ganger tiltenkte konsentrasjonen når på den celler.

De hemmere, utvannet til nontoxic konsentrasjoner ble brukt i analysen for TCR-stimulering-indusert apoptose i thymocytes5,17. Stimulering ble gjennomført med anti-CD3/CD28 perler på 18 h, og cellene var senere farget for caspase-3 aktivisering i CD4+ og CD8+ DP thymocyte befolkningen (figur 2). En økning i caspase-3 aktivisering og CD69 uttrykk, og også en TCR downregulation, ble observert i både den anti-CD3/CD28-stimulert og DMSO uekte-behandlet anti-CD3/28-stimulert prøvene, sammenlignet med de nonstimulated prøvene. Deksametason-behandlet prøvene viste en økning i caspase-3 aktivisering uavhengig av CD69 oppregulering, som forventes av apoptose-inducing effekten er uavhengig av TCR stimulering.

Figur 3A oppsummerer resultatene av biblioteket screening analysen for valgte hemmere. Både caspase-3 aktivisering og CD69 kan brukes til å identifisere potensielle hemmere av interesse på grunn av undertrykkelse av uttrykk. Som forventet, dukket hemmere av kanoniske meglere TCR signalnettverk opp som positive treff på skjermbildene. Slike hemmere, utstilte varierende hemmende styrke, inkludert bredspektret hemmere at målet flere kinaser og, mer spesifikt hemmere. Noen hemmere kunne undertrykke både caspase-3 aktivisering og CD69 oppregulering (figur 3B, øverste rad, venstre panel). En slik hemmer er bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), som hemmer alle protein kinase C isoformene, i tillegg til protein kinase A og PDK125,26,27. En annen hemmer i denne kategorien er CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), en foreslått hemmer IKK228.

Det var forbindelser som hemmet CD69 oppregulering men ikke svekke caspase-3 Aktivisering (figur 3B, øverste rad, rett paneler). CAY10626, en inhibitor av PI3Kα og mTOR23, og U-0126 (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) deg selv thio] methylene]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), en MEK hemmer29, var noen av de identifiserte hemmere. Resultatene viser at ulike hemmere målretting ulike kinaser fra forgreninger av TCR signalveien, særlig de målretting sent kinaser, kan resultere i selektiv svekkelse av T-celle aktivering fenomener.

Det var også hemmere som ikke undertrykke både CD69 oppregulering og caspase-3 Aktivisering (figur 3B, nederste, venstre panel). Paklitaxel (βS-(benzoylamino) - αR - hydroxy-benzenepropanoic syre, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), en disruptor microtubule dynamics30og necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), en inhibitor av RIP1 kinase31, er to hemmere kjennemerke for å være i denne kategorien. I slike tilfeller der CD69 oppregulering og caspase-3 aktivisering ikke var svekket, dette kan være på grunn av hemmere ikke rettet mot en relevant kinase for TCR signalveien.

Som nevnt tidligere, ble staurosporine brukt i skjermbildene, i en konsentrasjon som fortsatt indusert apoptose i thymocytes. Som forventet, viste staurosporine-behandlet prøven høye nivåer av caspase-3 Aktivisering (figur 3B, nederste, høyre kolonne). De lave nivåene av CD69 uttrykk kan tilskrives staurosporine-mediert hemming av PKC, som bisindolylmaleimide II, en pan-PKC inhibitor, undertrykkes også uttrykk for CD69. Eventuelt indusert staurosporine apoptose i cellene før de kunne upregulate CD69 uttrykket.

For å øke gjennomstrømming og automatisering av protokollen, ble parallelle protokoller som omfattet bruk av en automatisert plate vaske system via laminær strømning utarbeidet. To separate protokoller med automatiserte plate vask enheten var trialed og sammenlignet med konvensjonelle metoden for dyrking celler i 96-brønnen plater og flekker cellene i en sentrifugering-avhengige protokoll. En metode involvert dyrking cellene i 96-brønnen plater, etter standard prosedyre og deretter overføre cellene til plater forenlig med automatiserte plate skive den flekker trinn (Figur 4, DA-vask eksempler). Den andre metoden involvert dyrking cellene direkte i plate-skive-kompatible platene og fortsetter med fargeprotokoll på samme plate (Figur 4, DA-kultur eksempler). Sentrifugering uavhengig protokollene gir ikke mange oppfattes forskjeller i active caspase-3, CD69 eller TCRβ flekker over forskjellige prøvene testet, sammenlignet med vanlig sentrifugering-avhengige protokollen (Figur 4). Forskjeller i flekker intensiteten kan tilskrives bruke antistoffer i litt ulike konsentrasjoner under farging trinnene.

Figure 1
Figur 1 : Thymocyte levedyktighet etter behandling med hemmere. (A) eksperimentelle oversikt over hovedtrinnene i screening analysen. Det finnes tre foreslåtte metoder for stimulering og flekker av thymocytes brukes i aktivisering analysen, nemlig (1) dyrking av thymocytes i standard 96-brønns plater, etterfulgt av flekker ved hjelp av en vanlig sentrifugering-basert protokoll, (2) dyrking av thymocytes i standard 96-brønns plater, etterfulgt av flekker med en sentrifugering uavhengig vask protokoll og (3) dyrking av thymocytes i små volumer plater, etterfulgt av farging i samme platene med en sentrifugering uavhengig vask protokollen. (B) Gating strategier som brukes i levedyktighet analyser. Levende celle porten ble avledet fra frem scatter (FSC) og siden xy (SSC) tomter, som beskrevet tidligere17. Hemmere som ble ansett for å være for giftige på testet konsentrasjonen var underlagt ytterligere levedyktighet analyser i 10 ganger lave konsentrasjoner. Representative inhibitor-behandlet utvalg vises. Merk den felles kontrollen (DMSO-behandlet [DMSO]) på 1 µM og 0,1 µM prøver. (C) Plate utformingen av utvannet hemmere. En skjematisk fremstilling av plater hemmere utvannet i DMSO til en konsentrasjon av 500 x tiltenkte siste konsentrasjonen. Hver representerer godt en unik hemmer; grå brønnene er tomme. Konsentrasjonen vist er den endelige konsentrasjonen når lagt til cellekulturer, nemlig 10 µM (mørk rød), 1 µM (fuchsia) og 0,1 µM (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Plate utformingen av thymocyte aktivisering analysen. (Øverst) Kolonner 1 og 12 er reservert for kontroller, mens kolonnene 2 til 11 inhibitor-behandlet prøver (beige). Negativ kontrollen (nonstimulated [NS], grå) fyller brønner A1 til D1 og positiv kontrollen for celledød (dexamethasone-behandlet [DEX], lilla) fyller brønner E1 til H1. Kolonnene 2 til 12 inneholder thymocytes stimulert med anti-CD3/CD28 perler. Positiv kontrollen for thymocyte Aktivisering (stimulert prøver [α-CD3/CD28], grønn) fyller brønner A12 D12 og kontrollen kjøretøy (stimulert og DMSO-behandlet [α-CD3/CD28 + DMSO], rød) inntar brønner E12 til H12. (Nederst) Flow cytometri tomter i aktive caspase-3 (ActCasp3), CD69, og TCRβ flekker av thymocytes gated i dobbel-positive (DP) porten. Representant tomter ulike kontrollene vises. NS = nonstimulated; DEX = deksametason-behandlet prøver; Α-CD3/CD28 + DMSO = utvalg stimulert med CD3/CD28-belagt perler og behandlet med DMSO; Α-CD3/CD28 = utvalg stimulert med CD3/CD28-belagt perler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Screening av hemmer biblioteket på thymocyte aktivisering. (A) sammendragsdata for aktivisering analysen. Dette er resultatet av en representant eksperiment vise de normaliserte verdiene av celler med aktivert caspase-3 og CD69 uttrykk for valgte hemmere. Normalisering ble gjort ved å sammenligne prosentandelen av celler i aktiv-caspase-3-positiv eller CD69-positive gate verdi av DMSO-behandlet kontrollen, som er satt til relative verdien 0 i diagrammet. (B) valgt FACS tomter. Flow cytometri tomter hemmere som undertrykt både caspase-3 aktivisering og CD69 oppregulering (øverst til venstre), undertrykt bare CD69 oppregulering (øverst til høyre), eller hadde ingen effekt på caspase-3 aktivisering og CD69 oppregulering (nederst til venstre). Tomter på staurosporine-behandlet utvalget vises å illustrere effekten av å bruke en hemmer i giftig konsentrasjoner (nederst til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Sammenligning av forskjellige analysen protokoller. Flow cytometri tomter i aktive caspase-3 (ActCasp3), CD69, og TCRβ flekker av DP thymocytes etter tre forskjellige analysen protokoller. Fire ulike forhold er testet, nemlig kontrollen negative (nonstimulated [NS]), positiv kontrollen for celledød (dexamethasone-behandlet [DEX]), kjøretøy kontroll (stimulert og DMSO-behandlet [α-CD3/CD28 + DMSO]), og en inhibitor-behandlet eksempel (stimulert og PIK-75-behandlet [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Konvensjonelle = dyrking av thymocytes i standard 96-brønns plater og flekker med en vanlig sentrifugering-basert protokoll; DA-vask = dyrking av thymocytes i standard 96-brønns plater og flekker med en laminær strømning vaske protokoll; DA-kultur = dyrking av thymocytes i små volumer plater og farging i samme platene med en laminær strømning vaske protokollen.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Screening strategien foreslått her vurderer muligheten for små molekyl hemmere å undertrykke den apoptotisk effekten i thymocytes etter stimulering, i tillegg til mer konvensjonelle markører T-celle aktivering-CD69 oppregulering og TCR downregulation . Ekstra markører kan også bli inkludert aktivere analyse av ulike thymocyte delsett32. Et interessant aspekt til gjeldende analysen ligger i det faktum at hemmere som hindrer TCR signalering ville også dempe induksjon av apoptose, ytterligere utheving æren av TCR-uavhengig effekter hemmere kan ha på indusere celledød. Videre tillater en flyt-cytometri-baserte analysen bruk av flere readouts som tydelig aktivisering markører, som kunne rapportere virkningene av hemmere om personlige greiner TCR signalnettverk. I tilfellet her, var det hemmere som viste en differensiell hemming av caspase-3 aktivisering og CD69 oppregulering. Fordi noen forbindelser kan påvirke husarbeid funksjoner som proteinsyntese eller vesicula handel, er det ikke overraskende å observere effekter på oppregulering av de novo syntetisert markører (f.eks CD69) men ikke på posttranslational endringer (f.eks proteolytisk aktivering av caspase-3).

Som analysen presentert her måler apoptose som en presentasjon, er det viktig at de latente toksiske effektene av hemmere ikke skjule resultatene. For eksempel skjermen vi ikke utvanne staurosporine utover 1 nM, til tross for det fortsatt er giftig for cellene på at konsentrasjonen. Representant resultatene er enig med staurosporine å være en promiskuøse kinase inhibitor og en induser apoptose33. Uten en tilstrekkelig fortynning av forbindelser testet til nontoxic konsentrasjoner, er det mulig å overse mulige treff.

Screening strategien finnesher ville være vanskelig å bruke mennesker på grunn av komplikasjoner knyttet til å skaffe tilstrekkelig antall thymocytes for høy gjennomstrømming screening. Det er imidlertid mulig å få menneskelige thymus prøver fra pediatric cardiac biopsier34,35 eller fostre36,37. Likevel, som TCR signalnettverk trasé og amino acid sekvenser signalnettverk proteiner er i stor grad konservert mellom mus og mennesker, thymocyte analysen gir en nyttig foreløpige screening strategi, og noen resultater oppnådd med denne analysen ved hjelp av musen thymocytes kan deretter bekreftes i primære menneskelige lymfocytter.

En begrensning av vanlig sentrifugering-avhengige protokollen gjelder utsiktene til celle tap, som kan tilskrives må natur prosessen, som omfatter trinn som cellen permeabilization og sentrifugering. Hver sentrifugering og rørets trinn uunngåelig resulterer i tap av celler. Mens slike tap ikke kan være kritisk for studier som involverer noen eksempler, medføre det problemer når den brukes i høyere gjennomstrømming screening, spesielt som analysen format utvikler seg fra 96 til 384 - til 1536-brønnen. En måte å omgå dette problemet er gjennom bruk av celle-permeable fluorescerende caspase sensorer38 at påvisning av caspase aktivisering og unngå komplikasjoner av cellen permeabilization og flere vasker5. Alternativt, ansette en uavhengig av sentrifugering metode for vaske celler av laminær strømning er også mulig for å minimere tap av cellen. Med en automatisert plate vaske stasjon i forbindelse med en vegg-mindre plate, er celler vasket av laminær strømning uten bruk av en sentrifuge. Eksponentiell fortynning av reagenser tillater det grundig og effektiv skylling av celler i mindre enn 3 minutter, som representerer en tilsvarende fortynning to runder med sentrifugal vask. Uten eksterne stress på grunn av sentrifugering, cellene mer levedyktig og celle tap er minimert.

Vi utforsket også bruke automatiserte plate vaske stasjon etter dyrking thymocytes i 96-brønnen U bunn plater og også dyrking av celler i veggen mindre plater kompatible med automatiserte plate vaske stasjon. Dyrking av celler i veggen mindre platene aktivert eliminering av alle sentrifugering skritt og minimert celle tap ved å eliminere behovet for eksempel overføring over plater. Vanligvis er tre ulike protokollene sammenlignbare både stimulering effektivitet og flekker. Automatisert vask stasjonen gir fordelen med automatisering, hastighet og effektivitet, som gjør det lettere for høyere gjennomstrømming analyse. Videre med økt automatisering, vask fremgangsmåten kan utføres raskere, og det er en større konsistens mellom eksperimenter eller forskere. Men vask stasjonen har visse ulemper: store mengder vaske buffere kreves for skive grunning (150 mL per endringen, som 50 mL brukes for vask); ekstra forsiktighet er nødvendig når du håndterer platen for å unngå noen krysskontaminering av brønnene på grunn av begrenset partisjonering mellom brønnene av små volumer plate; gjenværende buffer på 25 µL i brønnene etter vask nødvendiggjør bruk av reagenser forberedt høyere enn 1 x konsentrasjonen. For å løse problemene med residualvolum og begrenset kapasitet på platen, kan ekstrautstyr utvide inkubasjon volumet fra 70 µL 150 µL legges, og tilrettelegging for bruk av konvensjonelle protokoller. Mens automatiserte plate håndteringssystemer er tilgjengelig, har de en viktig innflytelse i forhold til laminær vaskesystemet, som er en liten enhet for ~ 1 kubikk fot (~0.028 m3). Videre er integrering av sentrifugering i automatiserte plate håndteringssystemer utfordrende, begrense deres bruk i cellen vask. Det finnes ingen annen sentrifuge-uavhengig celle vaske instrumenter tilgjengelig, så vidt vi vet.

Screening strategien presenteres her er kjøpedyktig identifisere små molekyler og deres påståtte målet kinaser, som påvirker TCR signalisering og T-celle aktivering. Biblioteket her omfatter hovedsakelig små molekyl hemmere av kinaser og kunne generere en rekke muligheter interessant treff. Protokollen kan også brukes gjerne til hemmer biblioteker til andre enzym klasser eller andre typer små molekyler og biblioteker av andre stoffer (f.eks, ulike makromolekyler). Protokollen kan også brukes til skjermen andre celletyper, for eksempel perifere T-lymfocytter eller udødeliggjort celler, inkludert de uttrykker transgene TCRs eller bærer reporter systemer. Identifisere og karakterisere nye meglere av T-celle signalisering kan forbedre vår kunnskap om signalveien og også hjelp i utviklingen av målrettet terapi i immune sykdommer13,14,15, 16., denne studien legger utvalg av tilgjengelige alternativer for påvisning av meglere av T-celle signalnettverk via høy gjennomstrømming screening analyser.

Disclosures

Forfatteren Chyan Ying Ke er ansatt i Curiox Biosystems, som produserer DA celle vaskemaskin og DA-celle platene brukes i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Singapore helsedepartementets National Medical Research Council, NMRC CBRG15may017 og Singapore departementet for utdanning, 2014-T2-1-136 (til N.R.J.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI HyClone SH30027FS
FBS HyClone SH3007103
L-Glutamine HyClone SH3003401
Sodium pyruvate HyClone SH3023901
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
b-mercaptoethanol Sigma Aldrich 516732 
10X PBS Vivantis PB0344 – 1L
Kinase Screening Library (96-Well) Cayman Chemical 10505 Exact contents of the library may vary
DMSO Sigma Aldrich D2650
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 
anti-CD3/CD28 beads Thermo Fisher Scientific 11452D
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit BD Pharmingen 550480 Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody
DA-Cell Washer CURIOX HT1000
96-well DA-Cell Plate CURIOX 96-DC-CL-05
Antibodies
CD3e BioLegend 100236
TCRb BD Biosciences 553174
CD4 BD Biosciences 740007
CD8 BD Biosciences 563786
CD69 eBioscience 25-0699-42
Inhibitors
TG003 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PKC 412 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Doramapimod Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Paclitaxel Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erlotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-5 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-BEZ235 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Phthalazinone pyrazole Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-879 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
1-NA-PP1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Torin 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide II Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIBF 1120 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SMI-4a Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10657 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-703026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Chelerythrine chloride Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Tunicamycin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
GSK 1059615 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Ruxolitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 505124 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
INK128 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Canertinib (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 431542 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 173074 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Valproic Acid (sodium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 0325901 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
VX-702 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Emodin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CHIR99021 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIO Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Imatinib (mesylate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sunitinib Malate Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Gefitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
3-Methyladenine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide I Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IV Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide V Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 663284 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D 4476 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NU 7026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-9 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Indirubin-3'-monoxime Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-62 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-93 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CGP 57380 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Iso-Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VIII (acetate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ST638 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6656 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY364947 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10621 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
YM-201636 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 447439 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-041164 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP242 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ABT-869 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10622 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
17β-hydroxy Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10626 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6668 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10572 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
N,N-Dimethylsphingosine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY294002 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
U-0126 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Staurosporine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-92 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 (potassium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
O-1918 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 98059 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 169316 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TGX-221 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
OSU03012 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
JNJ-10198409 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Arachidonic Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lauric Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-252424 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10505 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI-103 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PIK-75 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sphingosine Kinase Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Piceatannol Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(R)-Roscovitine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BAY-43-9006 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10561 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-604850 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI3-Kinase α Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ML-9 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Triciribine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erbstatin Analog Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Kenpaullone Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-494 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-825 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1478 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 216763 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 415286 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-17 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-8 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LFM-A13 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-514 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Apigenin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10554 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
DRB Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-13022 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-14620 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-490 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-82 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-99 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-213 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-183 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lavendustin C Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 336372 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
5-Iodotubercidin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 202190 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10571 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Nilotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SP 600125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
L-threo-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-89 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
HA-1077 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-370 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1296 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KT 5823 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Janex 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10574 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10575 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10576 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NH125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TWS119 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 210902 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10577 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10578 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 184161 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CCT018159 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Myricetin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
  2. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
  3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
  4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
  5. Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
  6. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  7. Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
  8. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  9. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
  10. Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
  11. Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
  12. Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
  13. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  14. Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
  15. Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
  16. Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
  17. Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
  18. Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
  19. Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
  20. Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
  21. Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
  22. Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
  23. Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
  24. Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
  25. Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
  26. Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
  27. Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
  28. Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. Novel compounds. , (2003).
  29. Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
  30. Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
  31. Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
  32. Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
  33. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
  34. Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
  35. Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
  36. Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
  37. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
  38. Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 143 Caspase-3 aktivisering kinase hemmere bibliotek screening TCR signalnettverk T-celle aktivering thymocyte utvalg
Identifikasjon av meglere på T-celle reseptor signalering <em>via</em> Screening av kjemiske Inhibitor biblioteker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek,… More

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter