Summary
Sebrafisken (Danio rerio) blir en utbredda vertebrate djur modell för mikrobiell kolonisering och patogenes. Det här protokollet beskriver användningen av protozo Paramecium caudatum som ett fordon för livsmedelsburna infektioner hos zebrafiskar larver. P. caudatum lätt internaliserar bakterier och få tas upp av larval zebrafisk genom naturliga preying beteende.
Abstract
På grund av sin öppenhet, genetiska tractability och enkelt underhåll, zebrafisk (Danio rerio) har blivit en allmänt använd ryggradsdjur modell för infektionssjukdomar. Larval zebrafiskar offer naturligt på den encelliga protozo Paramecium caudatum. Det här protokollet beskriver användningen av P. caudatum som ett fordon för livsmedelsburna infektioner i larval zebrafiskar. P. caudatum internalisera ett brett spektrum av bakterier och bakteriella celler förbli lönsamt i flera timmar. Zebrafiskar sedan offer på P. caudatum, bakteriehalten släpps i framtarmen vid matsmältningen av fordonets paramecium och bakterierna kolonisera tarmen. Protokollet innehåller en detaljerad beskrivning av paramecia underhåll, laddning med bakterier, bestämning av bakteriell nedbrytning och dosen, samt infektion av zebrafisk genom utfodring med paramecia. Fördelen med att använda denna metod för livsmedelsburna infektioner är att den nära härmar funktionsläget av infektion som observerats i mänskliga sjukdomar, leder till mer robust colonization jämfört med nedsänkning protokoll och tillåter studier av ett brett utbud av patogener. Livsmedelsburna infektioner i zebrafisk modellen kan användas för att undersöka bakteriell genuttryck inom host, host-patogen interaktioner och kännetecken för patogenicitet inklusive bakteriell börda, lokalisering, spridning och sjuklighet.
Introduction
Zebrafiskar aktie morfologiskt och funktionellt bevarade funktioner med däggdjur, inklusive granulocytic härstamningar (t.ex. neutrofiler), monocyt/makrofag-liknande celler, Toll-liknande receptorer, pro-inflammatoriska cytokiner och antimikrobiella peptider1 . Tarmkanalen i zebrafisk är fullt utvecklad på 6 dagar efter befruktning (dpf) och visar morfologiska och funktionella bevarande med däggdjur magtarmkanalen, såsom bevarade Transkriptionsreglering i tarmepitelceller 2. Detta gör zebrafiskar en utmärkt modell för intestinal mikrobiell kolonisering och patogenes. Ett brett utbud av enteriska mikrober har undersökts i zebrafisk modellen, inklusive entrohemoragiska Escherichia coli3, Vibriocholerae4,5, Salmonella enterica6, den Zebrafiskar bakterieflora7,8, och rollen av probiotika i intestinal immunitet9. En klar fördel av zebrafisk modellen är att det är koloniserade av många mikrober utan att störa den endogena bakterieflora, vilket gör att utredningen av mikrobiell beteende i samband med blandade mikrobiella populationer3, 6. för närvarande, de flesta zebrafiskar modeller av gastrointestinala koloniseringen och sjukdom lita på administrationen av mikrober genom bad nedsänkning, där zebrafiskar inkuberas i en bakteriesuspension för en viss mängd tid10. Men detta gör det svårt att avgöra den exakta dosen av bakterier administreras, och leder till begränsad kolonisering med vissa mikrober, särskilt med icke-patogena bakterier. Alternativt en bakteriesuspension administreras för att fiska via oral sondmatning11, men detta är tekniskt utmanande och begränsad till äldre larver och vuxna fiskar.
Det här protokollet beskriver användningen av de encelliga protozo Paramecium caudatum som ett fordon för livsmedelsburna leverans av mikrober till mag-tarmkanalen av zebrafisk larver. Paramecia är lätta och billiga att underhålla och klarar av att mata på en mängd olika mikrober, alger, svampar och bakterier, som de internalisera genom en cilierade muntliga groove12,13,14. En gång internaliserat, bakterier hålls i vakuoler, bryts som så småningom syrsätt och innehåll över en tidsram på flera timmar15. Larval zebrafiskar fånga paramecia som naturliga bytesdjur snart efter kläckningen, omkring 3 – 4 dpf beroende på temperatur16, och ta upp dem med hög verkningsgrad. Processen för byte fånga tar på genomsnittet 1.2 s från upptäckt till fånga17, och fångade paramecia smälts snabbt i zebrafiskar framtarmen, sådan att internaliserade livskraftiga bakterier släpps ut i tarmkanalen3. Paramecia kan därför användas som en snabb och enkel metod för att leverera en hög och jämn dos av bakterier i mag-tarmkanalen av zebrafiskar. De levererade bakterierna kan antingen omvandlas för att uttrycka en fluorescerande protein, såsom mCherry som beskrivs här, eller, när det gäller genetiskt svårbehandlade bakterier, de kan vara pre färgas med ett fluorescerande färgämne att tillåta visualisering inom den mag-tarmkanalen.
Det här protokollet beskriver livsmedelsburna leverans av enteropathogenic E. coli (entrohemoragiska E. coli [EHEC] och vidhäftande invasiva E. coli [AIEC]), och Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Både patogena E. coli och S. typhimurium är överförda via den fekal-orala smittvägen18,19, och kan vara förvärvade via förorenade livsmedel, såsom kött, grönsaker och mejeriprodukter. Med P. caudatum som ett fordon, kolonisera E. coli och S. typhimurium framgångsrikt larvaena zebrafiskar inom 30 – 60 min samtidig inkubering med paramecium fordonet. Den uppnådda bakteriella bördan är tillräckligt robust för att visualisera koloniseringen och bestämma bördan av plätering vävnad homogenates.
Protocol
Zebrafiskar vård, avel, experiment som beskrivs här är förenliga med guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur och har godkänts av utskottet institutionella djur välfärd för University of Texas Health Science Center, protokoll antal AWC-16-0127.
1. tillväxt och underhåll av Paramecia
- Få live paramecia kulturer från källor såsom zebrafisk International Resource Center (ZIRC).
- Från en levande växande kultur, tillsätt 1 mL av den paramecia kulturen, 1 mL av en E. coli MG1655 kultur (optisk densitet OD600 1,0 – 2,0) resuspended i 1 x E3 (0,29 g/L NaCl, 13 mg/L KCl, 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0,48 g/L HEPES, pH 7,0, steril), och 8 mL av 1 x E3 i en 10 mL vävnadsodling kolv. Snurra försiktigt och sedan lagra på 22 ° C.
- För att bibehålla en kultur, passage varannan vecka, 1 mL av en paramecia kultur i en 10 mL vävnadsodling kolv med 9 mL färsk 1 x E3 medium innehållande 108 CFU/mL av E. coli MG1655 resuspended i 1 x E3.
2. bestämning av bakteriell dosen administreras till zebrafiskar
-
Bestämma bakteriell halveringstiden inom Paramecium
Obs: Halveringstiden för bakterier inom paramecia bestäms av plätering livskraftig E. coli återhämtat sig från paramecium, som beskrivs nedan.- Efter en 2 h inkubation av bakterier (OD600 1.0) med paramecia vid 22 ° C, kombinera paramecia och samtidig bakteriekulturen i en 50 mL konisk tub, tvätta paramecia med 1 x E3 och räkna antalet paramecia per milliliter (som beskrivs nedan i steg 3.2.7 och 3.2.8).
- Efter sammanräkning av antalet paramecia, ta bort 50 µL av paramecia och samtidig bakterieodling varje timme (för 6 h efter exponering) och lägga till varje prov i en fräsch 1,5 mL tub.
- Plats 950 µL av 1% icke-jonaktivt ytaktivt ämne (se Tabell för material) fosfat buffrad koksaltlösning (PBS) till varje 1,5 mL rör och virvel för 1 min att lysera paramecia. Utför 1:10 utspädningar av varje prov med steril PBS som ett spädningsmedel (dvs. 100 µL i 900 µL).
- Plåt 100 µL av varje utspädning på selektiv plattor (LB tet medium: 1 g/L trypton, 0,5 g/L jästextrakt, 1 g/L NaCl, 30 µg/mL tetracyklin) och inkubera vid 37 ° C i 16 h. Nästa dag, räkna och registrera antalet bakteriekolonier på plattan (koloni bildar enheter, CFUs) genom att räkna endast isolerade och distinkt enskilda kolonierna. Identifiera en tallrik med en utspädning som ger 30 – 300 CFU.
- Avgöra utspädningen faktor som används. Till exempel om 1 µL av den bakteriella kulturen blandas med 99 mL steril PBS, är detta en spädning 1: 100 (0,01). Detta nummer kommer att antalet CFU i utspädningstunneln. Utför beräkningen nedan, för varje tidpunkt, att avgöra CFU i det ursprungliga provet:
- Beräkna och graph antalet livskraftiga E.coli/paramecium motsvarar timmarna post exponering med hjälp av paramecia koncentrationen som beräknades i steg 3.3.1 och bestämma halveringstiden inom paramecia (figur 1).
- Med hjälp av CFU nummer beräknas för varje tidpunkt, beräkna och diagram antalet livskraftiga E. coli per paramecium på y-axeln kontra timmar post ruvning på x-axeln, med hjälp av paramecia koncentrationen som beräknades i steg 3.3.1. Bestämma halveringstiden inom paramecia.
-
Bestämma bakteriell dosering från bakteriell half-life och jagar Betygsätt.
Obs: För att avgöra den bakteriella doseringen, måste halveringstiden för bakterier inuti paramecia och andelen preying zebrafiskar på paramecia (se steg 3,4) beaktas.- Använda följande formel för att bestämma bakteriell sönderfall inom paramecia:
(1)
Där N0 är den ursprungliga mängden bakterier per paramecia efter 2 h ruvning, Nt är den återstående kvantiteten efter tiden t τ är den tid efter vilken antalet livskraftiga bakterier har halverats och k är konstanten förfall. - Från nedbrytning experimentet, fastställa den förfalla konstant k med bakteriell halveringstiden (dvs den tid efter vilken mängden livskraftiga bakterier/paramecium har halverats).
(2)
För bestämning av halveringstid, termen
och
(3)
eller
(4)
Obs: Halveringstiden av E. coli i paramecia baserat på figur 1, och är cirka 2,3 h. Alltså använder formel (4), decay rate, k, för E. coli är:
(5)
- Fastställa vilken decay (k) från half-life experiment att hitta dos av livskraftiga bakterier (Nt) tas upp av zebrafisk larver efter preying tid (t), där (P) är andelen preying eller antalet paramecia äts upp av en fisk per timme:
(6)
eller
(7)
Obs: Per figur 1är den ursprungliga mängden bakterier per paramecia (N0) efter en 2 h inkubation (t) 790 CFU. Per film 1 och figur 2är preying (P) 1539. - Använder dessa värden för att ersätta i ekvation (7), beräkna den bakteriella dosering som konsumeras av en zebrafiskar som efter en 2 h inkubation som:
(8)
- Använda följande formel för att bestämma bakteriell sönderfall inom paramecia:
och
eller
eller
3. livsmedelsburna infektioner av zebrafisk
- Inkubera bakterier med Paramecia.
- Förbereda en samtidig kultur av paramecia och E. coli MG1655 natten före infektion. Kombinera E3 media 8 mL, 1 mL av en pågående paramecia kultur och 1 mL av en E. coli MG1655 kultur (OD600 = 1,0) resuspended i 1 x E3 i T25 vävnadsodling kolvar. Inkubera kolvar i rumstemperatur (RT) över natten. För varje behandling villkor, förbereda två kolvar av paramecia.
- Inokulera bakterietillväxt media (LB: 1 g/L trypton, 0,5 g/L jästextrakt, 1 g/L NaCl) med infektiös stam av bakterier, genom att plocka en enskilda bakteriell koloni från en tallrik med en steril inympning loop. Inkubera flytande kulturen vid 37 ° C och låt skakar på 110 varv per minut (rpm) över natten.
Obs: Personlig skyddsutrustning (laboratorierock och handskar) ska bäras och biosäkerhet nivå 2 faciliteter bör användas vid hantering av smittämnen. - Nästa dag, mäta OD600 övernattande kultur. Beräkna volymen av kultur som krävs för att uppnå en OD600 1 när resuspended i 11 mL av media.
- Skörda volymen av bakterier från steget 3.1.2 via centrifugering vid 6 000 x g i 5 min, en volym för varje kolv i paramecia. Avlägsna supernatanten och återsuspendera bakteriell pelleten i 1 mL av E3 media.
- Du kan också pre fläcken bakterierna med ett fluorescerande färgämne.
- Tillsätt 1 µL av FM 4-64FX bakteriell fläcken (5 mg/mL stamlösning). Täcka röret med folie för att skydda från fotoblekning och inkubera roterande över slut på RT i 15 min.
- Ta bort överflödig färg genom tvättning med 1 x E3: Pellet bakterier via centrifugering vid 6000 x g för 1,5 min, sedan återsuspendera pelleten i 1 mL av E3 media. Upprepa tvättningen två gånger.
- Skörda färgade bakterier via centrifugering vid 6000 x g för 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera bakteriell pelleten i 1 mL av E3 media.
- Tillsätt 1 mL av de bakteriella suspensioner vardera till de två kolvarna av färska paramecia. Inkubera vid RT i 2 h.
Obs: Om arbetar med färgade bakterier, inkubera i mörker vid RT för 2 h.
- Tvätta bakterier/paramecia samtidig kultur.
- Kombinera innehållet i båda kolvarna paramecia/bakterier samtidig kultur till en 50 mL konisk tub. Centrifugera proverna på 300 x g vid 15 ° C i 10 min. Kontrollera att centrifugen är nedkylda innan detta steg.
- Ta bort ca 10 mL av E3 supernatanten med serologiska pipett och tillsätt ca 10 mL av färsk 1 x E3 till konisk röret.
Obs: Under alla tvätta steg är det viktigt att vara mycket snabb när du tar bort supernatanten, som paramecia kommer att börja simma av pelleten. Snurra och ta bort supernatanten från ett rör i taget att säkerställa tillräckligt snabb hantering vid detta steg, och undvika förlust av paramecia i supernatanten. - Snurra prover via centrifugering vid 300 x g vid 15 ° C för 5 min. ta bort ca 10 mL av E3 supernatanten med serologiska pipett, och tillsätt ca 10 mL färsk 1 x E3 till konisk röret. Upprepa detta steg två gånger.
- Centrifugera proverna vid 300 x g vid 15 ° C i 5 min. ta bort ca 10 mL av E3 supernatanten, utan för att störa pelleten.
- Återsuspendera pelleten i de återstående 10 mL av E3 media och överföra 500 µL av upphängningen in i en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör. Pellet den 500 µL av paramecia genom centrifugering vid 300 x g i 5 min för att räkna antalet paramecia.
- Ta bort 400 µL av E3 supernatant från 500 µL provet. Tillsätt 20 µL 36,5% formaldehydlösning i de resterande 100 µL av paramecia och försiktigt Omsuspendera och inkubera i 5 minuter vid 22 ° C.
Obs: Detta steg dödar paramecia att tillåta för inventering. - Mäta faktiska totala volymen med hjälp av pipetten och posten. Späd den paramecia suspension 1:1 v/v med 0,4% trypan blå lösning.
- Använda en cell counter eller hemocytometer för att räkna antalet döda paramecia/mL.
Obs: På grund av det föregående fixering steget, de flesta paramecia kommer vara död på denna punkt, men detta nummer återspeglar antalet levande paramecia för samtidig inkubering experimentet. Författarna har inte hittat betydande paramecia dödsfall på grund av bakteriell Co inkubation, så detta inte kan beaktas som en faktor här.
- Co Inkubera Paramecia och zebrafiskar larver.
- Beräkna koncentrationen av paramecia:
Obs: Denna beräkning ger koncentrationen av paramecia i 50 mL koniska röret från steg 3.2.5. - Beräkna volymen av tvättade paramecia krävs för en koncentration av 2 x 105 paramecia/mL i en slutlig volym av 3 mL E3.
Obs: Koncentrationen av paramecia kan justeras baserat på önskad bakteriell dosen, som är föremål för optimering. - Söva zebrafisk genom att lägga till tricaine i 100 mM Tris pH 8,0 till en slutlig koncentration av 100 mg/L. överföring 10 zebrafiskar i varje brunn 6-well platta till en total volym på 3 mL färsk E3 som innehåller lämpliga koncentrationen av paramecia (som beräknades i steg 3.3.2). se till att överföra larver i en minimal mängd vätska, att säkerställa att de återhämta sig från anestesi i mottagarens väl.
- Inkubera vid 30 ° C under 2 h i en dagaktiva inkubator i dag ljus, att säkerställa optimal lightning villkor för jagar.
- Tvätta zebrafiskar minst 5 gånger genom att överföra fisk i en ny väl innehållande 3 mL av färska E3 innehållande 100 mg/L tricaine varje gång.
Obs: Försök inte att utelämna tricaine under tvätt steg. Överföra mobila larver utan anestesi ökar risken för skador och lidande för djuret. - Alternativt förbereda zebrafiskar för avbildning av inbäddning zebrafiskar 3 ml 1% agaros som low-melt i en svart-walled 6-well platta: Low-melt agaros görs i 1xE3 och värms i mikrovågsugn. När smält, lägga till tricaine till en slutlig koncentration på 160 mg/mL. Ställning fisk under ett stereomikroskop, använder en klippt gel lastning tips, se till att huvudet är till vänster och svansen är till höger (figur 3). Vänta i 5 minuter för Agarens ställa, då overlay inbäddade fisken med 1 x E3 innehåller 160 mg/mL tricaine för avbildning.
- Beräkna koncentrationen av paramecia:
- Fastställa vilken preying.
Obs: Inga separata experiment måste ställas in för att fastställa vilken preying. Snarare kan detta göras under steg 3.3.4, som beskrivs nedan.- Under steg 3.3.4, Visa preying zebrafiskar på en stereomikroskopet och fånga videofilmer av bytesdjur fångst.
- Poäng videomaterialet. Prey fånga kännetecknas av en klockas slag av zebrafisk mot bytet. Räkna varje strejk som ett bytesdjur fånga händelse, även om detta är bara en approximation (se diskussion).
- Beräkna det genomsnittliga antalet bytesdjur fånga händelser per timme från flera videoklipp, var och en representerar en annan zebrafiskar larv (figur 2).
Representative Results
Paramecium caudatum internaliserar lätt ett brett spektrum av bakterier till lagring vakuoler. Det intracellulära bakteriella densitet beror på tätheterna av bakterier och paramecia i samtidig kulturen, liksom de bakteriearter som används. Med tiden vakuoler syrsätt och bakteriell nedbrytning inträder. Nedbrytningshastighet måste bestämmas individuellt för alla stammar används. För patogena E. coli, ursprungliga bakteriell tätheten är 790 bakterier /parameciumoch bakterier bryts med en halveringstid på cirka 2,3 h (figur 1).
Figur 1: bestämning av bakteriell halveringstiden i paramecia. (A) följande 2 h samtidig inkubering med infektiös E. coli, P. caudatum var tvättas och överförs till medium utan bakterier. Vid angivna tidpunkter, numrerar av livskraftiga E. coli celler bestämdes genom utspädning plätering på selektiv agar. Resultaten är medel ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM; n = 3). (B) typisk bild av paramecium redovisade internaliserat bakterier, med ljusa fält (Bi), fluorescerande bakterier (Bii), och sammanslagna kanaler (Biii). Skalstapeln = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vidare den zebrafiskar som jagar ränta, det vill säga takt med vilken zebrafiskar internalisera bakterier-lastad paramecia vid samtidig inkubering, studerades. Larval zebrafiskar börja jaga och fånga levande byten från 5 dpf20, även om det konstaterades att, när upp vid 30 ° C, larval development accelereras och djur Visa preying beteende från 4 dpf. Jagar åtföljs av ett kännetecken som slående beteende20 (figur 2A) och bestämning av andelen preying är baserad på antagandet att varje strejk leder till internalisering av en paramecium, även om detta kan bara ses en tillnärmning (se diskussion). Baserat på häri beskrivna observationer av jagar zebrafiskar larver, är paramecia upptag cirka 1 539 per h (figur 2B).
Figur 2: bestämning av zebrafisk preying. (A) stillbilder från en preying video, som visar en zebrafiskar larver (5 dpf) jagar paramecia bära fluorescerande bakterier. Tid i [sekunder]. Pilen anger huvudaxeln rörlighet under en klockas slag. (B) kvantifiering av preying rate (paramecia intag per timme), baserat på n = 10 filmer tagit över hela 2 h exponeringstiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter internalisering av paramecia försämrar zebrafiskar effektivt bytet i framtarmen, släppa smittsamma bakterier i matsmältningssystemet. Som beskrivs häri, paramecia nedbrytning fortsätter snabbt och gratis bakterier kan upptäckas i tarmkanalen inom 30 minuter efter jagar. Gratis bakterier då flytta från framtarmen till mitten och bakre tarmen, där de upptäcks cirka 1 – 2 timmar efter början av preying (figur 3). Bakteriella persistens i tarmen beror på arten och dos men spänner från flera h till flera dagar i fråga om E. coli och S. enterica. S. enterica lokaliserar främst i de tarmens slemhinnor, med vissa epitelial invasion (figur 3D), leder till infiltration av neutrofiler i epitelet (figur 3 c).
Figur 3: koloniseringen av zebrafisk med bakterier. Zebrafiskar på 5 dpf var kvar uninfected (A) eller koloniserade med mCherry uttrycker (B) E. coli eller (C) S. enterica. Infektion experiment kan utföras i vildtyp (A och B) fisk eller transgena linjerna (t.ex. raden Tg (MPO::EGFP) jag114 uttrycker grön fluorescerande neutrofiler som visas i (C). Den rektala öppningen är markerad med en pil. (D) högre förstoring av intestinal avsnitt från hela-mount inbäddade larver smittats med Salmonella enterica infektion. (Di) blå = Hoechst märkning kärnor, (Dii) lila = phalloidin märkning F-aktin, (Diii) röd = Salmonella, (Div) dokument. Skalstapeln = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Video bilder av bytesdjur tillfångatagandet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Discussion
Det grundläggande protokollet som beskrivs här har optimerats för patogena E. coli, och har framgångsrikt anpassats för andra bakteriearter, inklusive Salmonella enterica och Vibriocholerae. För vissa arter som inte kolonisera zebrafiskar tarmen efter bad nedsänkning, inklusive vissa Salmonella enterica stammar och vissa anaerober, kan livsmedelsburna infektioner som beskrivs här användas att framgångsrikt etablera colonization. Jämfört med microgavage, som också används för att fastställa höga bakteriell bördor i larval tarmkanalen, livsmedelsburna infektioner är tekniskt mindre utmanande och kräver mindre specialiserad utrustning. Kritiska parametrar bör dock optimeras för bakteriell arter och stammar skall användas. Sådana faktorer inkluderar bakteriell och paramecium densitet för bakterier-paramecium samtidig kultur steg: om bakteriell nummer inom paramecia är låg, detta kan förbättras genom att öka bakteriell tätheten i steget samtidig kultur. Vissa bakteriearter kan skada paramecium värden, och detta bör bedömas av mikroskopi.
En annan viktig faktor i detta protokoll är bytesdjur fånga av zebrafiskar. Andelen preying baseras som beskrivs här på antagandet att varje byte fånga strike resultat i intag av en paramecium. Höga tätheter av paramecia per fisk används i protokollet för att säkerställa hög preying priser. Dock byte capture är beroende av tätheten av paramecia i systemet, och i mycket utspädd paramecium kulturer, preying priser kan vara så låg som 13 – 15 paramecia per timme21,22. En begränsning är att byte bindningsandel är också starkt beroende på ljusförhållanden och i mörkret, bindningsandel är 80% lägre än i ljus21 och detta bör beaktas när du konfigurerar experiment. Om exponering gånger att offer måste utökas för att optimera koloniseringen, har hänsyn ges till sekundär exponering för bakterier genom avföring. De villkor som beskrivs ovan – 2 h byte exponering – är denna exponering försumbar, eftersom tarmen Passagetiden av bakterier är mer än 1 h och koncentrationen av bakterier i fordonet är mycket högre än i avföring. Dock om prey exponeringstiden ökas avsevärt, kan detta bli en betydande faktor.
Lämpliga kontroller bör ingå i detta protokoll, inklusive koloniseringen av zebrafisk efter utfodring med paramecia som innehåller icke-patogena E. coli MG1655. Om flera bakteriestammar jämförs för deras förmåga att kolonisera zebrafiskar värden, är det viktigt att testa om deras halveringstiden inom paramecia är jämförbara. Bakteriella mutationer, inklusive de äventyrar cellväggen integritet eller syra avkänning, kan äventyra bakteriell stabilitet inom paramecia. I sådana fall måste zebrafiskar utfodring justeras för skillnader i dosering.
Protokollet beskrivs här kan användas för att undersöka bakteriell kolonisation och dess konsekvenser, inklusive av imaging bakteriell kolonisering av zebrafiskar som beskrivits ovan samt att fastställa CFU per zebrafiskar från vävnad Homogenatet3, eller utredande-infektionsassocierad morbiditet och mortalitet. Idealiskt, för bakteriell visualisering, bakteriestammar som uttrycker fluorescerande proteiner såsom mCherry eller röd fluorescerande protein (RFP) bör användas. Detta gör att visualisering av växande bakterie befolkning. Om bakteriestam är inte genetiskt eftertraktansvärda eller användning av fluorescerande proteinuttryck hindras av andra skäl, kan bakterier färgas med ett fluorescerande färgämne, såsom FM 4-64FX, före samarbete kultur med paramecia. När du använder protokollet beskrivs här, samtidig kultur med paramecia minskar inte ljusstyrkan för färgen och färgade bakterier syns tydligt i zebrafiskar tarmen. Färgen kommer dock spädas över tid sker betydande bakteriell spridning inom zebrafiskar värden. I båda fallen är röd fluorescerande bakterier att föredra över grön fluorescerande bakterier, eftersom vävnad autofluorescens kan vara högre i gröna än i den röda kanalen.
Det har konstaterats att detta protokoll kan anpassas för aerob och namnet bakteriearter. Det kan vara möjligt att anpassa det för utfodring av sporer och svamp arter, även om detta återstår testas experimentellt.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i gruppen Krachler för kritiskt läsande och kommentarer på manuskriptet. Detta arbete finansierades av en UT system STAR award, BBSRC och NIH (R01AI132354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
