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Immunology and Infection

Zebrafish लार्वा में भोजन जनित संक्रमण के लिए वाहन के रूप में प्रोटोजोआ Paramecium caudatum का प्रयोग

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1McGovern Medical School, Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Zebrafish (ढाणियो rerio) माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण और रोगजनन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया हड्डीवाला पशु मॉडल बन रहे हैं । यह प्रोटोकॉल zebrafish लार्वा में भोजन जनित संक्रमण के लिए एक वाहन के रूप में प्रोटोजोआ Paramecium caudatum के उपयोग का वर्णन करता है । पी caudatum आसानी से internalizes बैक्टीरिया और लार्वा zebrafish द्वारा प्राकृतिक शिकार व्यवहार के माध्यम से लिया जाना ।

Abstract

उनकी पारदर्शिता, आनुवंशिक संश्वसनता, और रखरखाव में आसानी के कारण, zebrafish (ढाणियो rerio) संक्रामक रोगों के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया हड्डीवाला मॉडल बन गए हैं । कोशिकीय प्रोटोजोआ Paramecium caudatumपर लार्वा zebrafish स्वाभाविक रूप से शिकार करते हैं । इस प्रोटोकॉल लार्वा zebrafish में भोजन जनित संक्रमण के लिए एक वाहन के रूप में पी caudatum के उपयोग का वर्णन है । पी caudatum internalize बैक्टीरिया और बैक्टीरियल कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला कई घंटे के लिए व्यवहार्य रहते हैं । Zebrafish तो caudatumपर शिकार, बैक्टीरियल लोड paramecium वाहन के पाचन पर अग्रांत्र में जारी किया जाता है, और बैक्टीरिया आंत्र पथ उपनिवेश । प्रोटोकॉल paramecia रखरखाव का एक विस्तृत विवरण शामिल है, बैक्टीरिया के साथ लोड हो रहा है, बैक्टीरियल क्षरण और खुराक के निर्धारण, साथ ही paramecia के साथ खिलाने से zebrafish के संक्रमण. भोजन जनित संक्रमण की इस पद्धति का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह बारीकी से मानव रोग में मनाया संक्रमण की विधा की नकल है, विसर्जन प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक मजबूत औपनिवेशीकरण की ओर जाता है, और रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन की अनुमति देता है । zebrafish मॉडल में खाद्य जनित संक्रमण मेजबान के भीतर बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, और बैक्टीरियल बोझ, स्थानीयकरण, प्रसार और रुग्णता सहित pathogenicity की पहचान.

Introduction

Zebrafish शेयर आकृति विज्ञान और कार्यात्मक स्तनधारियों के साथ सुविधाओं के संरक्षण, granulocytic वंश सहित (जैसे, न्यूट्रोफिल), monocyte/मैक्रोफेज की तरह कोशिकाओं, टोल रिसेप्टर्स की तरह, समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स1 . zebrafish में आंत्र पथ पूरी तरह से 6 दिनों के बाद निषेचन (dpf) में विकसित होता है और स्तनधारी जठरांत्र संबंधी मार्ग के साथ रूपात्मक और कार्यात्मक संरक्षण से पता चलता है, जैसे आंत्र उपकला कोशिकाओं में संरक्षित transcriptional विनियमन के रूप में 2. यह आंतों माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण और रोगजनन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल zebrafish बनाता है । enterohemorrhagic ई कोलाई3, Vibrio हैजा4,5, साल्मोनेला enterica6, सहित zebrafish मॉडल में प्रवेश रोगाणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन किया गया है, zebrafish microbiota7,8, और आंतों उन्मुक्ति में प्रोबायोटिक्स की भूमिका9. zebrafish मॉडल का एक विशिष्ट लाभ यह है कि यह अंतर्जात microbiota, जो मिश्रित माइक्रोबियल आबादी3के संदर्भ में माइक्रोबियल व्यवहार की जांच की अनुमति देता है को बाधित किए बिना कई रोगाणुओं द्वारा बृहदांत्र है, 6. वर्तमान में, जठरांत्र औपनिवेशीकरण और रोग के सबसे zebrafish मॉडल स्नान विसर्जन द्वारा रोगाणुओं के प्रशासन पर निर्भर करते हैं, जहां zebrafish10समय की एक विशेष राशि के लिए एक जीवाणु निलंबन में मशीन हैं । हालांकि, इस प्रशासित बैक्टीरिया की सटीक खुराक निर्धारित करने के लिए मुश्किल बनाता है, और विशेष रूप से गैर रोगजनक बैक्टीरिया के साथ कुछ रोगाणुओं के साथ सीमित औपनिवेशीकरण की ओर जाता है. वैकल्पिक रूप से, एक जीवाणु निलंबन मौखिक gavage11के माध्यम से मछली के लिए प्रशासित है, लेकिन यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और पुराने लार्वा और वयस्क मछली के लिए सीमित है ।

इस प्रोटोकॉल zebrafish लार्वा के जठरांत्र संबंधी मार्ग के लिए रोगाणुओं के भोजन वहन वितरण के लिए एक वाहन के रूप में कोशिकीय प्रोटोजोआ Paramecium caudatum के उपयोग का वर्णन करता है । Paramecia आसान और सस्ते बनाए रखने के लिए कर रहे है और रोगाणुओं की एक विस्तृत विविधता पर खिलाने में सक्षम हैं, शैवाल, कवक सहित, और बैक्टीरिया, जो वे एक ciliated मौखिक नाली12,13,14के माध्यम से internalize । एक बार आंतरिक, बैक्टीरिया रिक्तिकाएं, जो अंततः acidify और सामग्री में आयोजित कर रहे है कई घंटे15की एक समय सीमा से अधिक नीचा दिखा रहे हैं । लार्वा zebrafish प्राकृतिक शिकार के रूप में जल्दी ही सेने के बाद paramecia पर कब्जा, 3 के आसपास-4 dpf तापमान के आधार पर16, और उंहें उच्च दक्षता के साथ ले लो । शिकार कैप्चर की प्रक्रिया का पता लगाने के लिए17पर कब्जा करने से औसत १.२ s पर ले जाता है, और कब्जा कर लिया paramecia जल्दी से zebrafish अग्रांत्र में पचा रहे हैं, ऐसी है कि आंतरिक व्यवहार्य बैक्टीरिया आंत्र पथ3में जारी कर रहे हैं । नतीजतन, paramecia zebrafish के जठरांत्र संबंधी मार्ग में बैक्टीरिया की एक उच्च और सुसंगत खुराक देने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वितरित बैक्टीरिया या तो ऐसे mCherry के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त बदल सकता है के रूप में यहां वर्णित है, या, आनुवंशिक रूप से असभ्य बैक्टीरिया के मामले में, वे पूर्व एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग के भीतर दृश्य की अनुमति हो सकती है जठरांत्र संबंधी मार्ग ।

इस प्रोटोकॉल enteropathogenic ई. कोलाई के भोजन वहन वितरण का वर्णन (enterohemorrhagic ई. कोलाई [EHEC] और अनुयाई इनवेसिव ई. कोलाई [AIEC]), और साल्मोनेला enterica एसएसपी. Typhimurium. दोनों रोगजनक ई. कोलाई और एस typhimurium मल-मौखिक मार्ग18,19के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं, और इस तरह के मांस, सब्जियां, और डेयरी के रूप में दूषित भोजन, के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । एक वाहन के रूप में पी caudatum का उपयोग करना, ई. कोलाई और एस typhimurium सफलतापूर्वक 30 के भीतर zebrafish लार्वा उपनिवेश-सह के 60 मिनट-paramecium वाहन के साथ मशीन । प्राप्त बैक्टीरियल बोझ काफी मजबूत करने के लिए औपनिवेशीकरण कल्पना और ऊतक homogenates चढ़ाना द्वारा बोझ निर्धारित है ।

Protocol

Zebrafish देखभाल, प्रजनन, और प्रयोगों यहां वर्णित की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार कर रहे हैं, और टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र, प्रोटोकॉल के विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है संख्या AWC-16-0127.

1. Paramecia की वृद्धि और अनुरक्षण

  1. ऐसे Zebrafish अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र (ZIRC) के रूप में स्रोतों से लाइव paramecia संस्कृतियों प्राप्त करें ।
  2. एक जीवित बढ़ती संस्कृति से, paramecia संस्कृति के 1 मिलीलीटर, एक ई. कोलाई MG1655 संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़ें (ऑप्टिकल घनत्व आयुध डिपो६०० 1.0 – 2.0) 1x E3 (०.२९ g/l NaCl, 13 mg/l KCl, ४४ मिलीग्राम/l CaCl2, ८१ mg/l MgSO4 में resuspend , ०.४८ g/L HEPES, पीएच ७.०, बाँझ), और एक 10 मिलीलीटर ऊतक संस्कृति कुप्पी में 1x E3 के 8 मिलीलीटर । हल्के से भंवर और फिर 22 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  3. एक संस्कृति को बनाए रखने के लिए, हर दो सप्ताह, एक paramecia संस्कृति के पारित होने के 1 10 मिलीलीटर ऊतक संस्कृति कुप्पी में 9 मिलीलीटर के साथ ताजा 1x e3 मध्यम 108 CFU/ ml MG1655 के एमएल 1x e3 में resuspend ।

2. Zebrafish करने के लिए प्रशासित बैक्टीरियल खुराक का निर्धारण

  1. Paramecium के भीतर बैक्टीरियल आधा जीवन का निर्धारण
    नोट: paramecia के भीतर बैक्टीरिया का आधा जीवन paramecium से बरामद व्यवहार्य ई. कोलाई , के रूप में नीचे वर्णित चढ़ाना द्वारा निर्धारित किया जाता है ।
    1. (१.० के आयुध डिपो६०० ) 22 डिग्री सेल्सियस पर paramecia के साथ बैक्टीरिया की एक 2 एच की मशीन के बाद, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में paramecia और बैक्टीरियल सह संस्कृति का मिश्रण, 1x E3 के साथ paramecia धो, और milliliter प्रति paramecia की संख्या गिनती (के रूप में नीचे दिए चरणों में वर्णित 3.2.7 और 3.2.8) ।
    2. paramecia की संख्या की गिनती के बाद, paramecia और बैक्टीरियल सह संस्कृति के ५० µ एल निकालें (6 के लिए एच के बाद जोखिम) और एक ताजा १.५ मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक नमूना जोड़ें ।
    3. प्लेस ९५० 1% के µ एल ईओण surfactant ( सामग्री की तालिकादेखें) फास्फेट में बफर खारा (पंजाब) समाधान के लिए १.५ मिलीलीटर ट्यूबों और भंवर में से प्रत्येक में 1 मिनट के लिए paramecia लाइसे । एक मंदक के रूप में बाँझ पंजाबियों का उपयोग कर प्रत्येक नमूने की 1:10 कमजोरियां प्रदर्शन (यानी, ९०० µ एल में १०० µ एल).
    4. प्लेट १०० चुनिंदा प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के µ एल (पौंड tet मध्यम: 1 g/l tryptone, ०.५ g/l खमीर निकालें, 1 g/l NaCl, 30 µ g/मब टेट्रासाइक्लिन) और 16 ज के लिए ३७ ° c पर मशीन । अगले दिन, गिनती और प्लेट पर बैक्टीरियल कालोनियों की संख्या रिकॉर्ड (कॉलोनी बनाने इकाइयों, CFUs) केवल अलग और अलग अलग कॉलोनियों की गिनती से । एक कमजोरता है कि 30-300 CFU देता है के साथ एक थाली की पहचान ।
    5. निर्धारित कमजोर पड़ने कारक इस्तेमाल किया । उदाहरण के लिए, यदि जीवाणु संस्कृति के 1 µ एल बाँझ पंजाबियों के ९९ मिलीलीटर के साथ मिलाया जाता है, यह एक 1:100 (०.०१) कमजोर पड़ने है । यह संख्या कमजोर पड़ने में CFU की संख्या होगी । मूल नमूना में CFU निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक समय बिंदु के लिए, नीचे परिकलन निष्पादित करें:
      Equation 1
    6. गणना और ग्राफ व्यवहार्य ई. कोलाई/paramecium की संख्या घंटे के बाद जोखिम paramecia चरण में गणना की एकाग्रता का उपयोग कर 3.3.1 और paramecia के भीतर आधे जीवन का निर्धारण (चित्रा 1) ।
    7. प्रत्येक समय बिंदु के लिए गणना की CFU संख्या का उपयोग करना, गणना और ग्राफ y पर paramecium प्रति व्यवहार्य ई. कोलाई की संख्या-घंटे बनाम एक्स-अक्ष पर, paramecia एकाग्रता का उपयोग करते हुए, 3.3.1 चरण में गणना । paramecia के भीतर आधा जीवन निर्धारित करते हैं ।
  2. जीवाणु आधा जीवन और शिकार दर से बैक्टीरियल खुराक का निर्धारण ।
    नोट: बैक्टीरियल खुराक का निर्धारण करने के लिए, paramecia के अंदर बैक्टीरिया का आधा जीवन और paramecia पर zebrafish के शिकार दर (३.४ कदम देखें) को ध्यान में रखा जाना है ।
    1. paramecia के भीतर बैक्टीरियल क्षय का निर्धारण करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का प्रयोग करें:
      1Equation 2
      जहां N0 paramecia प्रति बैक्टीरिया की प्रारंभिक मात्रा है 2 एच की मशीन के बाद, Nt समय टी के बाद शेष मात्रा है, τ समय है जिसके बाद व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या आधी हो गई है, और कश्मीर क्षय लगातार है ।
    2. गिरावट के प्रयोग से, क्षय का उपयोग कर लगातार बैक्टीरिया आधा जीवन (यानी, समय जिसके बाद व्यवहार्य जीवाणु की राशि/paramecium आधी हो गई है) ।
      2Equation 3
      आधे जीवन के निर्धारण के लिए, शब्द Equation 4 और
      (३) Equation 5 या
      4Equation 6
      नोट: 1 चित्राके आधार पर, paramecia में ई. कोलाई के आधे जीवन लगभग २.३ एच है । इस प्रकार, फार्मूला का उपयोग (4), क्षय दर, कश्मीर, ई. कोलाई के लिए है:
      5Equation 7
    3. क्षय दर (कश्मीर) आधा जीवन प्रयोग से निर्धारित करने के लिए व्यवहार्य बैक्टीरिया की खुराक (Nt) शिकार समय (टी), जहां (पी) शिकार दर या एक प्रति घंटे एक मछली द्वारा खाया paramecia की संख्या है zebrafish लार्वा द्वारा उठाए गए खोजने के लिए:
      (६) Equation 8 या
      7Equation 9
      नोट: प्रति चित्र 1, paramecia (N0) प्रति बैक्टीरिया की प्रारंभिक मात्रा के बाद एक 2 एच मशीन (टी) ७९० CFU है । फिल्म 1 और 2 चित्रा, शिकार दर (पी) प्रति १५३९ है ।
    4. समीकरण में स्थानापंन करने के लिए इन मूल्यों का प्रयोग (7), के रूप में एक 2 एच की मशीन के बाद एक zebrafish द्वारा भस्म बैक्टीरियल खुराक की गणना:
      8Equation 10

3. Zebrafish का भोजन जनित संक्रमण

  1. Parameciaके साथ मशीन जीवाणु ।
    1. paramecia और ई. कोलाई के एक सह संस्कृति तैयार MG1655 रात संक्रमण से पहले । E3 मीडिया, एक चल रहे paramecia संस्कृति के 1 मिलीलीटर के 8 मिलीलीटर का मिश्रण है, और एक ई. कोलाई MG1655 संस्कृति के 1 मिलीलीटर (आयुध डिपो६०० = १.०) T25 ऊतक संस्कृति कुप्पी में 1x E3 में resuspend । रात भर कमरे के तापमान (आरटी) में कुप्पी की मशीन । प्रत्येक उपचार की स्थिति के लिए, paramecia की दो कुप्पी तैयार करें ।
    2. Inoculate जीवाणु विकास मीडिया (LB: 1 g/l tryptone, ०.५ g/l खमीर निकालें, 1 g/l NaCl) बैक्टीरिया की संक्रामक तनाव के साथ, एक बाँझ टीका पाश का उपयोग कर एक थाली से एक व्यक्ति बैक्टीरियल कॉलोनी उठा कर. ३७ डिग्री सेल्सियस पर तरल संस्कृति की मशीन और प्रति मिनट (rpm) रातोंरात ११० घुमाव पर मिलाते हुए छोड़ दें ।
      नोट: व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने) पहना जाना चाहिए और सुरक्षा स्तर 2 सुविधाओं का इस्तेमाल किया जाना चाहिए जब संक्रामक एजेंटों से निपटने ।
    3. अगले दिन, रात भर संस्कृति के आयुध डिपो६०० को मापने । जब मीडिया के 11 मिलीलीटर में resuspend 1 के एक आयुध डिपो६०० को प्राप्त करने के लिए आवश्यक संस्कृति की मात्रा की गणना ।
    4. फसल 5 मिनट के लिए ६,००० x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से 3.1.2 कदम से बैक्टीरिया की मात्रा, paramecia के प्रत्येक कुप्पी के लिए एक मात्रा । supernatant त्यागें और E3 मीडिया के 1 मिलीलीटर में बैक्टीरियल गोली resuspend ।
    5. वैकल्पिक रूप से, पूर्व एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ बैक्टीरिया दाग ।
      1. जोड़ें 1 एफएम 4 के µ एल-64FX बैक्टीरियल दाग (5 मिलीग्राम/ पन्ना के साथ ट्यूब कवर photobleaching और 15 मिनट के लिए आर टी पर अंत घूर्णन से बचाने के लिए मशीन ।
      2. 1x e3 के साथ धुलाई द्वारा अतिरिक्त डाई निकालें: १.५ मिनट के लिए ६,००० x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से गोली बैक्टीरिया, तो E3 मीडिया के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend । दोहराएं दो बार कदम धो लो ।
      3. फसल ६,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक के माध्यम से दाग बैक्टीरिया 5 मिनट के लिए supernatant त्यागें और E3 मीडिया के 1 मिलीलीटर में बैक्टीरियल गोली resuspend ।
    6. ताजा paramecia की दो कुप्पी में से प्रत्येक के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन के 1 मिलीलीटर जोड़ें । 2 एच के लिए आर टी पर मशीन
      नोट: अगर दाग बैक्टीरिया के साथ काम कर रहे हैं, 2 एच के लिए आरटी पर अंधेरे में मशीन ।
  2. धो बैक्टीरिया/paramecia सह-संस्कृति ।
    1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में paramecia/बैक्टीरिया सह संस्कृति की दोनों कुप्पी की सामग्री का मिश्रण । 10 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर ३०० x g पर नमूने केंद्रापसारक सुनिश्चित करें कि इस कदम से पहले केंद्रापसारक पूर्व ठंडा है ।
    2. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर supernatant के लगभग 10 मिलीलीटर निकालें और ताजा 1x E3 के लगभग 10 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए जोड़ें ।
      नोट: सभी धोने चरणों के दौरान, यह बहुत जल्दी जब supernatant को हटाने के लिए आवश्यक है, के रूप में paramecia को गोली से बाहर तैरना शुरू हो जाएगा । स्पिन और एक समय में एक ट्यूब से supernatant निकालें इस कदम पर जल्दी पर्याप्त हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए, और supernatant में paramecia के नुकसान से बचें ।
    3. 5 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर ३०० x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से नमूने स्पिन । E3 supernatant के लगभग 10 मिलीलीटर निकालें एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, और ताजा 1x E3 के लगभग 10 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए जोड़ें । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
    4. 15 डिग्री सेल्सियस पर ३०० x g पर नमूनों के लिए 5 min. E3 supernatant के लगभग 10 मिलीलीटर निकालें, गोली को बाधित करने के लिए देखभाल नहीं ले ।
    5. E3 मीडिया के शेष 10 मिलीलीटर में गोली resuspend और एक नया १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में निलंबन के ५०० µ एल स्थानांतरण । paramecia की संख्या की गणना करने के लिए 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा paramecia के ५०० µ एल गोली ।
    6. ५०० µ l नमूना से E3 supernatant के ४०० µ l को निकालें । paramecia के शेष १०० µ एल के लिए ३६.५% formaldehyde समाधान के 20 µ एल जोड़ें और धीरे से स्थगित, और 22 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: यह कदम paramecia को गिनती के लिए अनुमति देने के लिए मारता है ।
    7. पिपेट और रिकॉर्ड का उपयोग कर वास्तविक कुल मात्रा का आकलन करें । paramecia निलंबन 1:1 v/v ०.४% trypan ब्लू समाधान के साथ पतला ।
    8. डेड paramecia/mL की संख्या गिनने के लिए किसी कक्ष काउंटर या hemocytometer का उपयोग करें ।
      नोट: पूर्व निर्धारण कदम की वजह से, अधिकांश paramecia इस बिंदु पर मर जाएगा, लेकिन यह संख्या सह-मशीन प्रयोग के लिए लाइव paramecia की संख्या को प्रतिबिंबित । लेखक महत्वपूर्ण paramecia मौत बैक्टीरियल सह-मशीन के कारण नहीं मिला है, तो यह एक कारक के रूप में यहां अवहेलना की जा सकती है ।
  3. Paramecia और zebrafish लार्वा की सह-मशीन ।
    1. paramecia की एकाग्रता की गणना:
      Equation 11
      Equation 12
      नोट: यह गणना चरण 3.2.5 से ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में paramecia की एकाग्रता देता है ।
    2. 3 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 2 x 105 paramecia/एमएल की एकाग्रता के लिए आवश्यक धोया paramecia की मात्रा की गणना ।
      नोट: paramecia की एकाग्रता वांछित बैक्टीरियल खुराक, जो अनुकूलन के अधीन है के आधार पर समायोजित किया जा सकता है ।
    3. Anesthetize zebrafish १०० mM Tris pH ८.० में tricaine जोड़कर १०० mg/L. के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 zebrafish एक अच्छी तरह से प्लेट की एक कुल मात्रा में ताजा E3 के 3 मिलीलीटर के उचित एकाग्रता युक्त paramecia (चरण में परिकलित 3.3.2). यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे अच्छी तरह से प्राप्तकर्ता में संज्ञाहरण से उबरने, तरल पदार्थ की एक न्यूनतम मात्रा में लार्वा हस्तांतरण करने के लिए ।
    4. शिकार के लिए इष्टतम बिजली की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए, दिन प्रकाश शर्तों के तहत एक प्रतिदिन मशीन में 2 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    5. धो zebrafish एक नए अच्छी तरह से ताजा १०० मिलीग्राम से युक्त 3 मिलीलीटर युक्त में मछली के हस्तांतरण से कम 5 बार और tricaine हर बार ।
      नोट: वॉशिंग स्टेप के दौरान tricaine को चूकना न देने का प्रयास न करें । संज्ञाहरण के बिना मोबाइल लार्वा स्थानांतरित पशु को नुकसान और संकट का खतरा बढ़ जाता है ।
    6. वैकल्पिक रूप से, 1% कम के 3 मिलीलीटर में zebrafish embedding द्वारा इमेजिंग के लिए zebrafish तैयार-पिघल agarose एक काले-दीवारों 6-अच्छी तरह से थाली में: कम पिघल agarose 1xE3 में किया जाता है और एक माइक्रोवेव में गरम । एक बार पिघला हुआ, १६० मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए tricaine जोड़ें । स्थिति एक stereomicroscope के तहत मछली, एक काटा जेल लोड टिप का उपयोग कर, यकीन है कि सिर छोड़ दिया है और पूंछ पर सही है (चित्रा 3) । सेट करने के लिए agarose के लिए 5 मिनट के लिए रुको, तो इमेजिंग के लिए १६० मिलीग्राम/एमएल tricaine युक्त 1x E3 के साथ एम्बेडेड मछली ओवरले ।
  4. शिकार दर निर्धारित करते हैं ।
    नोट: शिकार की दर निर्धारित करने के लिए कोई पृथक प्रयोग की आवश्यकता नहीं है । बल्कि, यह चरण 3.3.4 के दौरान किया जा सकता है, जैसा कि नीचे वर्णित है ।
    1. चरण 3.3.4 के दौरान, देखें एक stereomicroscope पर शिकार zebrafish और शिकार कब्जा के वीडियो फुटेज पर कब्जा ।
    2. वीडियो फुटेज स्कोर । शिकार पर कब्जा शिकार की ओर zebrafish के हड़ताली द्वारा विशेषता है । एक शिकार पर कब्जा घटना के रूप में प्रत्येक हड़ताल गिनती, हालांकि यह केवल एक सन्निकटन है ( चर्चादेखें) ।
    3. कई वीडियो क्लिप्स से प्रति घंटे शिकार पर कब्जा घटनाओं की औसत संख्या की गणना, प्रत्येक एक अलग zebrafish लार्वा का प्रतिनिधित्व (चित्रा 2) ।

Representative Results

Paramecium caudatum आसानी से internalizes भंडारण रिक्तिकाएं में बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला है । intracellular बैक्टीरियल घनत्व सह संस्कृति में बैक्टीरिया और paramecia के घनत्व पर निर्भर करता है, साथ ही जीवाणु प्रजातियों का इस्तेमाल किया । समय के साथ-साथ रिक्तिकाएं acidify और बैक्टीरियल क्षरण मग्न हो जाता है । क्षरण की दर का इस्तेमाल सभी उपभेदों के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना है । रोगजनक ई. कोलाईके लिए, प्रारंभिक जीवाणु घनत्व है ७९० बैक्टीरिया/paramecium, और बैक्टीरिया लगभग २.३ घंटे के एक आधे जीवन के साथ नीचा दिखा रहे हैं (चित्रा 1).

Figure 1
चित्रा 1: paramecia में बैक्टीरियल आधा जीवन का निर्धारण । (क) संक्रामक ई. कोलाईके साथ सह के 2 एच के बाद, पी caudatum धोया और बैक्टीरिया के बिना मध्यम करने के लिए हस्तांतरित किया गया था । संकेत दिया समय बिंदुओं पर, व्यवहार्य ई. कोलाई कोशिकाओं की संख्या चुनिंदा आगार पर चढ़ाना कमजोर पड़ने से निर्धारित किया गया । परिणाम का अर्थ है ± मानक त्रुटि का मतलब है (SEM; n = 3) । (ख) आंतरिक बैक्टीरिया ले जाने paramecium की ठेठ छवि, चमकदार क्षेत्र (द्वि), फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया (बीि), और विलय चैनल (Biii) के साथ । स्केल बार = 20 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इसके अलावा, zebrafish शिकार दर, कि है, दर जिस पर zebrafish internalize बैक्टीरिया-सह-मशीन पर paramecia भरी हुई, अध्ययन किया गया था । लार्वा zebrafish शिकार और 5 dpf20से जीना शिकार पर कब्जा करने के लिए शुरू, हालांकि यह पाया गया था कि, जब 30 डिग्री सेल्सियस पर उठाया, लार्वा विकास त्वरित और जानवरों 4 dpf से शिकार व्यवहार प्रदर्शन. शिकार एक विशेषता हड़ताली20 व्यवहार (चित्रा 2a) के साथ है, और शिकार दर के निर्धारण धारणा है कि प्रत्येक हड़ताल एक paramecium के internalization की ओर जाता है पर आधारित है, हालांकि यह केवल एक माना जा सकता है सन्निकटन ( चर्चादेखें). शिकार zebrafish लार्वा के स्पेसिफिकेशंस वर्णित टिप्पणियों के आधार पर, paramecia की दर लगभग १,५३९ प्रति एच (चित्रा बी) है ।

Figure 2
चित्रा 2: zebrafish शिकार दर का निर्धारण । (क) अभी भी एक शिकार वीडियो से छवियां, एक zebrafish लार्वा (5 dpf) फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया ले जाने paramecia पर शिकार दिखा । [सेकंड में समय] । तीर हड़ताली के दौरान आंदोलन के मुख्य धुरी इंगित करता है । (ख) शिकार की ठहराव दर (प्रति घंटे paramecia सेवन), n = 10 पूर्ण 2 एच जोखिम समय पर लिया वीडियो पर आधारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

paramecia के internalization के बाद, zebrafish कुशलता से अग्रांत्र में शिकार को नीचा, पाचन तंत्र में संक्रामक जीवाणुओं को रिहा । के रूप में यहां वर्णित है, paramecia गिरावट जल्दी आय, और मुक्त बैक्टीरिया शिकार के 30 मिनट के भीतर आंत्र पथ में पाया जा सकता है । नि: शुल्क बैक्टीरिया तो अग्रांत्र से मध्य और पीछे आंत के लिए कदम है, जहां वे शिकार (3 चित्रा) की शुरुआत के बाद लगभग 1-2 ज का पता लगाया है । आंत में बैक्टीरियल हठ प्रजातियों और खुराक लेकिन कई दिनों के लिए ई. कोलाई और एस entericaके मामले में अनेक ज से पर्वतमाला पर निर्भर करता है । एस enterica आंतों की श्लेष्मा झिल्ली में मुख्य रूप से कुछ उपकला आक्रमण (चित्रा 3 डी) के साथ, उपकला में न्यूट्रोफिल की घुसपैठ के लिए अग्रणी (चित्र3 सी).

Figure 3
चित्रा 3: बैक्टीरिया के साथ zebrafish के औपनिवेशीकरण । 5 dpf पर Zebrafish (एक) या mCherry व्यक्त (ख) ई. कोलाई या (सी) एस entericaके साथ बृहदांत्र छोड़ दिया गया । संक्रमण के प्रयोगों जंगली प्रकार में प्रदर्शन किया जा सकता है (ए और बी) मछली या ट्रांसजेनिक लाइनों (जैसे, रेखा टीजी (MPO:: EGFP) मैं११४ हरी फ्लोरोसेंट न्यूट्रोफिल (सी) में दिखाया एक्सप्रेस । गुदा खोलने एक तीर से चिह्नित है । (घ) साल्मोनेला enterica संक्रमण से संक्रमित पूरे-माउंट एंबेडेड लार्वा से आंतों के खंड का उच्च आवर्धन । (Di) Blue = Hoechst अंकन नाभिक, (दिी) बैंगनी = phalloidin अंकन F-actin, (Diii) लाल = साल्मोनेला, (Div) विलय । स्केल बार = 5 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
फिल्म 1: शिकार कब्जा के वीडियो फुटेज । इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित बुनियादी प्रोटोकॉल रोगजनक ई. कोलाईके लिए अनुकूलित किया गया है, और साल्मोनेला enterica और Vibrio हैजासहित अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है । कुछ प्रजातियों कि स्नान विसर्जन के बाद zebrafish आंत उपनिवेश नहीं है के लिए, कुछ साल्मोनेला enterica उपभेदों और कुछ anaerobes सहित, भोजन जनित संक्रमण के रूप में यहां वर्णित सफलतापूर्वक औपनिवेशीकरण स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । microgavage, जो भी लार्वा आंत्र पथ में उच्च बैक्टीरियल बोझ स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है की तुलना में, भोजन जनित संक्रमण तकनीकी रूप से कम चुनौतीपूर्ण है और कम विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । हालांकि, महत्वपूर्ण मापदंडों जीवाणु प्रजातियों और उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस तरह के कारकों जीवाणु और बैक्टीरिया के लिए paramecium घनत्व शामिल-paramecium सह संस्कृति कदम: अगर paramecia के भीतर बैक्टीरियल संख्या कम कर रहे हैं, इस सह संस्कृति कदम में जीवाणु घनत्व में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है । कुछ जीवाणु प्रजातियों paramecium मेजबान को नुकसान का कारण हो सकता है, और यह सूक्ष्म द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल में एक अंय महत्वपूर्ण कारक zebrafish द्वारा शिकार कब्जा है । शिकार के रूप में यहां वर्णित दर इस धारणा है कि हर शिकार एक paramecium की घूस में हड़ताल के परिणाम पर कब्जा पर आधारित है । उच्च घनत्व उच्च शिकार दर सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में paramecia प्रति मछली का उपयोग किया जाता है । हालांकि, शिकार कब्जा प्रणाली में paramecia के घनत्व पर निर्भर है, और बहुत paramecium संस्कृतियों में पतला, शिकार दर के रूप में कम हो सकता है के रूप में 13-15 paramecia प्रति घंटा21,22। एक सीमा है कि शिकार पर कब्जा दरों में भी दृढ़ता से प्रकाश व्यवस्था की स्थिति पर निर्भर है और अंधेरे में, कब्जा दरों ८०% प्रकाश शर्तों21 की तुलना में कम कर रहे है और यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जब प्रयोग की स्थापना । अगर शिकार के लिए जोखिम बार औपनिवेशीकरण का अनुकूलन करने के लिए विस्तार किया जाना है, विचार करने के लिए मल के माध्यम से बैक्टीरिया को माध्यमिक जोखिम के लिए दिया जाना है । शर्तों के तहत ऊपर वर्णित-2 शिकार जोखिम के ज-यह जोखिम नगण्य है, जीवाणुओं के आंत समय बीतने के बाद से अधिक 1 ज और वाहन में बैक्टीरिया की एकाग्रता है बहुत मल की तुलना में अधिक है । हालांकि, अगर शिकार जोखिम समय काफी बढ़ जाती है, यह एक महत्वपूर्ण कारक बन सकता है ।

उपयुक्त नियंत्रण इस प्रोटोकॉल में शामिल किया जाना चाहिए, जिसमें गैर-रोगजनक ई. कोलाई MG1655 युक्त paramecia के साथ zebrafish के बाद औपनिवेशीकरण की गई है । यदि एकाधिक बैक्टीरियल उपभेदों zebrafish मेजबान उपनिवेश करने की क्षमता के लिए तुलना कर रहे हैं, यह परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है कि उनके आधे paramecia भीतर जीवन तुलनीय है । बैक्टीरियल उत्परिवर्तनों, सेल दीवार अखंडता या एसिड संवेदन समझौता उन सहित, paramecia के भीतर बैक्टीरियल स्थिरता समझौता हो सकता है । ऐसे मामलों में, zebrafish खिला खुराक में अंतर के लिए खाते में समायोजित किया जाना है ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण और उसके परिणामों की जांच करने के लिए, ऊपर वर्णित के रूप में zebrafish के इमेजिंग बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण द्वारा सहित, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक zebrafish3से homogenate प्रति CFU निर्धारित करके, इस्तेमाल किया जा सकता है या संक्रमण से जुड़े रुग्णता और मृत्यु की जांच । आदर्श रूप में, बैक्टीरियल दृश्य के लिए, बैक्टीरियल प्रोटीन जैसे mCherry या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए । यह जीवाणु आबादी बढ़ने के दृश्य की अनुमति देगा । यदि बैक्टीरियल तनाव आनुवंशिक रूप से नहीं है या गैर फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग अंय कारणों के लिए precluded है, बैक्टीरिया ऐसे एफएम 4 के रूप में एक फ्लोरोसेंट डाई, के साथ दाग हो सकता है 64FX, सह से पहले paramecia के साथ संस्कृति । जब प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, paramecia के साथ सह संस्कृति डाई की चमक कम नहीं करता है और दाग बैक्टीरिया zebrafish आंत में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं । हालांकि, डाई समय के साथ पतला हो जाएगा महत्वपूर्ण जीवाणु प्रसार zebrafish मेजबान के भीतर घटित होना चाहिए । या तो मामले में, लाल-फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया हरे-फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया पर बेहतर कर रहे हैं, के बाद से ऊतक autofluorescence लाल चैनल की तुलना में हरे रंग में उच्च हो सकता है ।

यह पाया गया है कि इस प्रोटोकॉल एरोबिक और microaerophilic बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह जीवाणुओं और कवक प्रजातियों के खिलाने के लिए अनुकूल करने के लिए संभव हो सकता है, हालांकि इस परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता रहता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम महत्वपूर्ण पढ़ने और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Krachler समूह के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । यह काम एक यूटी सिस्टंस स्टार पुरस्कार, BBSRC, और NIH (R01AI132354) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paramecium caudatum, live Carolina 131554 no not store growing cultures below room temperature
0.4% Trypan Blue Solution  Sigma T8154-20ML liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma 276855-100ML store in a solvent safety cabinet
Escherichia coli, MG1655 ATCC ATCC 700926 can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain
FM 4-64FX stain Thermo Fisher F34653 aliquot and store frozen
Formaldehyde Sigma F8775-4X25ML
LB Broth Sigma L3397-1KG
Phosphate buffered saline tablets Thermo Fisher 18912014
Tetracycline Sigma 87128-25G toxic, irritant
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma E10521-10G
Triton X-100 Sigma X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4% Sigma 93595-50ML
UltraPure Low Melting Point Agarose Thermo Fisher 16520050
hemocytometer or cell counter any
stereomicroscope any
table-top centrifuge
microwave
rotator wheel
heated shaking incubator
aquatics facilities
breeding tanks

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ Paramecia Paramecium caudatum zebrafish ढाणियो rerio खाद्य जनित संक्रमण प्रवेश रोगजनकों
Zebrafish लार्वा में भोजन जनित संक्रमण के लिए वाहन के रूप में प्रोटोजोआ <em>Paramecium caudatum</em> का प्रयोग
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Flores, E., Thompson, L.,… More

Flores, E., Thompson, L., Sirisaengtaksin, N., Nguyen, A. T., Ballard, A., Krachler, A. M. Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (143), e58949, doi:10.3791/58949 (2019).

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