Summary
أصبحت الزرد (دانيو rerio) نموذج حيوانات الفقارية المستخدمة على نطاق واسع للاستعمار الميكروبي والمرضية. ويصف هذا البروتوكول استخدام بروتوزوا caudatum براميسيوم كوسيلة للعدوى المنقولة عن طريق الأغذية في اليرقات الزرد. كوداتوم P. الزاجرة البكتيريا بسهولة والحصول على تناول الزرد اليرقات من خلال سلوك الضحية الطبيعية.
Abstract
نظراً لشفافيتها والصوبه الوراثية، وسهولة الصيانة، أصبحت الزرد (دانيو rerio) نموذج الفقارية المستخدمة على نطاق واسع للأمراض المعدية. وبطبيعة الحال تفترس اليرقات الزرد بروتوزوا اونيسلولر caudatum براميسيوم. ويصف هذا البروتوكول باستخدام كاوداتوم P. كوسيلة للعدوى المنقولة عن طريق الأغذية في الزرد اليرقات. كوداتوم P. استيعاب مجموعة واسعة من البكتيريا والخلايا البكتيرية تظل قابلة للاستمرار لعدة ساعات. ثم تفترس الزرد P. caudatumوهو الإفراج عن الحمولة البكتيرية في المعي عند الهضم السيارة براميسيوم والبكتيريا استعمار الأمعاء. البروتوكول يتضمن وصفاً مفصلاً لصيانة باراميسيا، تحميل مع البكتيريا، تحديد تدهور البكتيرية والجرعة، وكذلك العدوى من الزرد بالتغذية مع باراميسيا. وميزة استخدام هذا الأسلوب من العدوى المنقولة عن طريق الأغذية هو أنه عن كثب يحاكي طريقة العدوى في الأمراض التي تصيب البشر، ويؤدي إلى استعمار أكثر قوة بالمقارنة مع البروتوكولات الغمر، ويتيح دراسة طائفة واسعة من العوامل الممرضة. يمكن استخدام العدوى المنقولة عن طريق الأغذية في النموذج الزرد للتحقيق في التعبير الجيني البكتيرية داخل المضيف، والتفاعلات المضيف الممرض، والسمات المميزة للقدرة الإمراضية بما في ذلك عبء البكتيرية والتعريب ونشرها والاعتلال.
Introduction
حصة الزرد شكلياً ووظيفيا حفظت الميزات مع الثدييات، بما في ذلك الأنساب جرانولوسيتيك (مثلاً، العَدلات) والوحيدات/بلعم-مثل الخلايا والمستقبلات الشبيهة بعدد القتلى، السيتوكينات الموالية التحريضية والببتيدات المضادة للميكروبات1 . الأمعاء في الزرد تماما توضع في 6 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية)، ويظهر حفظ الخصائص المورفولوجية والوظيفية مع الجهاز الهضمي الثدييات، مثل تنظيم النسخي مصانة في الخلايا الظهارية المعوية 2-وهذا يجعل من الزرد نموذجا رائعا لاستعمار الجراثيم المعوية والمرضية. ودرست مجموعة واسعة من الجراثيم المعوية في النموذج الزرد، بما في ذلك enterohemorrhagic الإشريكيّة القولونية3،4، الكوليرا5،6من انتيريكا السالمونيلا، الزرد الحجمية7،8، ودور البروبيوتيك في حصانة المعوية9. هي ميزة النموذج الزرد هو المستعمر بالعديد من الميكروبات دون تعطيل الحجمية الذاتية، مما يسمح التحقيق في سلوك الميكروبية في سياق المختلطة السكان الميكروبية3، 6. حاليا، معظم النماذج الزرد الاستعمار المعدية المعوية، والمرض تعتمد على الإدارة للميكروبات بغمر حمام، حيث هي المحتضنة الزرد في تعليق بكتيرية لمقدار معين من الوقت10. ومع ذلك، هذا يجعل من الصعب تحديد الجرعة الدقيقة من البكتيريا التي تديرها، ويؤدي إلى استعمار محدودة مع بعض الميكروبات، لا سيما مع البكتيريا غير ممرضة. بدلاً من ذلك، تعليق بكتيرية ويدار بالصيد عن طريق الفم تزقيمية مدتها11، ولكن هذا من الناحية الفنية صعبة ومحدودة لليرقات كبار السن والأسماك الكبار.
ويصف هذا البروتوكول استخدام بروتوزوا اونيسلولر caudatum براميسيوم كوسيلة لإيصال المنقولة عن طريق الأغذية من الميكروبات إلى الجهاز الهضمي ليرقات الزرد. هي سهلة ورخيصة للحفاظ على باراميسيا وقادرون على تغذية في مجموعة متنوعة واسعة من الجراثيم، بما في ذلك الطحالب والفطريات، والبكتيريا، وأنها تستوعب من خلال13،،من12أخدود شفوي عضو14. بمجرد استيعابه، البكتيريا وتعقد في فاكوليس، التي أسيديفي في نهاية المطاف، ومحتويات المتدهورة على مدى زمني لعدة ساعات15. الزرد اليرقات التقاط باراميسيا كفريسة الطبيعية قريبا بعد الفقس، حوالي 3-4 إدارة الشرطة الاتحادية تبعاً لدرجة الحرارة16، ويستغرق منهم بكفاءة عالية. عملية التقاط فريسة يأخذ في المتوسط 1.2 s من الكشف للقبض على17، ويتم بسرعة هضمها باراميسيا تم التقاطها في المعي الزرد، أن تطلق البكتيريا قادرة على البقاء المدخلة في الأمعاء3. كنتيجة لذلك، يمكن استخدام باراميسيا كوسيلة سريعة وسهلة لتقديم جرعة عالية ومتسقة من البكتيريا في الجهاز الهضمي من الزرد. يمكن أما أن تتحول البكتيريا تم تسليمها للتعبير عن بروتين فلورية، مثل مشري كما هو موضح هنا، أو، في حالة البكتيريا وراثيا مستعصية على الحل، ويمكن أن تكون ملطخة مسبقاً مع صبغة فلورسنت للسماح للتصور داخل الجهاز الهضمي.
يصف هذا البروتوكول تقديم تنقلها الأغذية انتيروباثوجينيك كولاي (انتيروهيمورهاجيك كولاي [الإشريكيّة] وملتصقة الغازية كولاي [أيك]), وموفر انتيريكا السالمونيلا تيفيموريوم. الممرضة كولاي و تيفيموريوم س المرسلة عن طريق ال18،البراز طريق الفم19، ويمكن أن تكون مكتسبة عن طريق تلوث الأغذية، مثل اللحوم والخضروات ومنتجات الألبان. استخدام كوداتوم P. كوسيلة، كولاي و تيفيموريوم س. استعمار بنجاح اليرقات الزرد ضمن 30 – 60 دقيقة لاحتضان المشارك مع السيارة براميسيوم. يقع عبء البكتيرية تحقق قوية بما يكفي لتصور الاستعمار وتحديد العبء بطلاء هوموجيناتيس الأنسجة.
Protocol
الزرد الرعاية والتربية والتجارب الموضحة هنا هي وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وأقرتها "لجنة رعاية الحيوان المؤسسية" من مركز العلوم الصحية في جامعة تكساس، البروتوكول رقم في الائتلاف المناهض للحرب-16-0127.
1-النمو والحفاظ على باراميسيا
- الحصول على الثقافات الحية باراميسيا من مصادر مثل مركز الموارد الدولية الزرد (زيرك).
- من ثقافة حية متنامية، أضف 1 مل ثقافة باراميسيا، 1 مل ثقافة MG1655 كولاي (الكثافة البصرية OD600 1.0 – 2.0) حراكه في 1 x E3 (0.29 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 13 مغ/لتر بوكل، 44 مغ/لتر كاكل2, 81 مغ/لتر مجسو4 ، 0.48 غرام/لتر حبيس، درجة الحموضة 7.0، عقيمة)، و 8 مل 1 x E3 في قارورة زراعة الأنسجة 10 مل. دوامة طفيفة ومن ثم تخزين عند 22 درجة مئوية.
- للحفاظ على ثقافة، كل أسبوعين، ممر 1 مل ثقافة باراميسيا في قارورة زراعة الأنسجة 10 مل مع 9 مل من الطازجة المتوسطة x E3 1 التي تحتوي على 108 زيمبابوي/مل MG1655 كولاي حراكه في 1 x E3.
2-تحديد الجرعة البكتيرية التي تديرها إلى الزرد
-
تحديد العمر النصفي البكتيرية داخل براميسيوم
ملاحظة: أن نصف العمر للبكتيريا داخل باراميسيا يتحدد بطلاء المستردة صالحاً كولاي من براميسيوم، كما هو موضح أدناه.- عقب ح 2 حضانة البكتيريا (OD600 1.0) مع باراميسيا عند 22 درجة مئوية، الجمع بين باراميسيا وثقافة المشارك البكتيرية في أنبوب 50 مل مخروطية، أغسل باراميسيا مع 1 x E3، والعد عدد باراميسيا في المليلتر (كما هو موضح أدناه في الخطوات 3.2.7 و 3.2.8).
- وبعد إحصاء عدد باراميسيا، إزالة 50 ميليلتر باراميسيا وثقافة المشارك البكتيرية كل ساعة (على ح 6 بعد التعرض) وإضافة كل عينة في أنبوب جديد 1.5 مل.
- 950 مكان ميليلتر من السطح النطاق 1% (انظر الجدول للمواد) مخزنة في الفوسفات المحلول الملحي (PBS) في كل من أنابيب 1.5 مل ودوامه لمدة 1 دقيقة في باراميسيا. 01:10 إجراء تخفيف لكل عينة باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة كمخفف (أي 100 ميليلتر في ميليلتر 900).
- لوحة 100 ميليلتر من كل تمييع على لوحات الانتقائي (tet رطل متوسطة: تريبتوني 1 غرام/لتر، واستخراج الخميرة 0.5 غرام/لتر، 1 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 30 ميكروغرام/مل التتراسيكلين) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 16. عد في اليوم التالي، وسجل العدد المستعمرات البكتيرية على اللوحة (وحدات تشكيل مستعمرة، كفوس) عن طريق العد فقط مستعمرات فردية منعزلة ومتميزة. تحديد لوحة مع إضعاف الذي يعطي زيمبابوي 30 – 300.
- تحديد إضعاف عامل المستخدم. على سبيل المثال، إذا كان 1 ميليلتر من ثقافة البكتيرية مختلطة مع مل 99 من برنامج تلفزيوني العقيمة، هذا إضعاف 1: 100 (0.01). سوف يكون هذا الرقم عدد زيمبابوي في التخفيف. تنفيذ الحساب أدناه، لكل نقطة الوقت، لتحديد زيمبابوي في العينة الأصلية:
- حساب والرسم البياني عدد مجدية كولاي/براميسيوم المقابلة للساعات بعد التعرض باستخدام تركيز باراميسيا المحسوبة في الخطوة 3.3.1 وتحديد فترة نصف العمر داخل باراميسيا (الشكل 1).
- في زيمبابوي باستخدام رقم حسابها لكل نقطة الوقت، حساب والرسم البياني عدد مجدية كولاي كل براميسيوم على المحور الصادي مقابل الحضانة بعد ساعات على المحور س، استخدام تركيز باراميسيا المحسوبة في الخطوة 3.3.1. تحديد فترة نصف العمر داخل باراميسيا.
-
تحديد معدل الجرعات من نصف الحياة الجرثومية البكتيرية وتنهب.
ملاحظة: لتحديد الجرعة البكتيرية، فترة نصف العمر للبكتيريا داخل باراميسيا ومعدل الزرد على باراميسيا الضحية (راجع الخطوة 3، 4) يجب أن تؤخذ في الاعتبار.- استخدم الصيغة التالية لتحديد البكتيرية الاضمحلال داخل باراميسيا:
(1)
حيث ن0 هي الكمية الأولية للبكتيريا الواحدة باراميسيا بعد الاحتضان ح 2، Nt هي الكمية المتبقية بعد الزمن t، τ أن الوقت قد حان بعد الذي انخفض إلى النصف العدد من البكتيريا قادرة على البقاء، و k هو ثابت الانحلال. - من التجربة التدهور، تحديد k ثابت الانحلال استخدام نصف البكتيرية (أي الوقت انخفض إلى النصف بعد ذلك المبلغ من البكتيريا قادرة على البقاء/براميسيوم).
(2)
لتحديد فترة نصف العمر، المصطلح
و
(3)
أو
(4)
ملاحظة: استناداً إلى الشكل 1، نصف عمر كولاي في باراميسيا حوالي 2.3 ح. وهكذا، باستخدام الصيغة (4)، ومعدل الانحلال، ك، كولاي :
(5)
- تحديد معدل الانحلال (k) من تجربة نصف العمر للعثور على جرعة البكتيريا قادرة على البقاء (Nt) تناول اليرقات الزرد بعد وقت الضحية (t)، حيث (P) هو معدل الضحية أو عدد باراميسيا تآكلها الأسماك واحدة كل ساعة:
(6)
أو
(7)
ملاحظة: في الشكل 1، هو الكمية الأولية للبكتيريا الواحدة باراميسيا (N0) بعد حضانة ح 2 (t) 790 زيمبابوي. كل فيلم 1 و الشكل 2، هو معدل الضحية (ع) 1539. - باستخدام هذه القيم لتكون بديلاً في المعادلة (7)، وحساب الجرعة البكتيرية يستهلكها الزرد بعد حضانة ح 2 ك:
(8)
- استخدم الصيغة التالية لتحديد البكتيرية الاضمحلال داخل باراميسيا:
و
أو
أو
3-المركبات التي تنقلها الأغذية عدوى الزرد
- احتضان البكتيريا مع باراميسيا.
- إعداد ثقافة المشارك باراميسيا و MG1655 كولاي الليل قبل الإصابة. الجمع بين 8 مل الإعلام E3، 1 مل ثقافة باراميسيا الجارية، ومل 1 ثقافة MG1655 كولاي (OD600 = 1.0) حراكه في 1 x E3 في قوارير زراعة الأنسجة T25. احتضان قوارير في درجة حرارة الغرفة (RT) بين عشية وضحاها. لكل شرط المعاملة، إعداد قوارير اثنين من باراميسيا.
- تلقيح وسائط النمو البكتيرية (رطل: تريبتوني 1 غرام/لتر، استخراج الخميرة 0.5 غرام/لتر، 1 غرام/لتر كلوريد الصوديوم) مع العدوى بسلالة من البكتيريا، بانتقاء مستعمرة بكتيرية فردية من لوحة استخدام حلقة تطعيم عقيمة. احتضان ثقافة السائل عند 37 درجة مئوية وترك المصافحة في تناوب 110 في الدقيقة (لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها.
ملاحظة: معدات الحماية الشخصية (معطف مختبر وقفازات) ينبغي أن ترتديه ومرافق المستوى 2 السلامة الأحيائية ينبغي أن تستخدم عند التعامل مع العوامل المعدية. - في اليوم التالي، قياس OD600 الثقافة بين عشية وضحاها. حساب حجم الثقافة المطلوبة لتحقيق OD600 1 عند حراكه في 11 مل من وسائل الإعلام.
- حصاد حجم البكتيريا من الخطوة 3.1.2 عن طريق الطرد المركزي مبلغ 000 6 × ز لمدة 5 دقائق، وحجم واحد لكل قارورة من باراميسيا. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه البكتيرية في 1 مل الإعلام E3.
- بشكل اختياري، وصمة عار قبل البكتيريا بصبغة فلورسنت.
- أضف 1 ميليلتر من FM 4-64FX البكتيرية وصمة عار (5 ملغ/مل حل الأسهم). تغطية أنبوب مع إحباط لحماية من فوتوبليتشينج واحتضان الدورية أكثر من النهاية في RT لمدة 15 دقيقة.
- إزالة الصبغة الزائدة بالغسيل مع 1 x E3: بيليه البكتيريا عن طريق استخدام الطرد المركزي في 6,000 س ز ل 1.5 دقيقة، ثم ريسوسبيند بيليه في 1 مل الإعلام E3. كرر الخطوة يغسل مرتين.
- حصاد البكتيريا الملون عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 6,000 ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه البكتيرية في 1 مل الإعلام E3.
- أضف 1 مل المعلقات البكتيرية إلى كل من قوارير اثنين من باراميسيا الطازجة. تبني على RT ح 2.
ملاحظة: إذا كان يعمل مع البكتيريا الملون، احتضان في الظلام على RT ح 2.
- يغسل البكتيريا/باراميسيا ثقافة المشارك.
- دمج محتويات كلا قوارير الثقافة المشارك باراميسيا/البكتيريا في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز عند 15 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي تبريد مسبقاً قبل هذه الخطوة.
- إزالة حوالي 10 مل من المادة طافية E3 استخدام ماصة مصلية وإضافة حوالي 10 مل 1 جديدة x E3 للأنبوبة المخروطية.
ملاحظة: خلال جميع الخطوات الغسيل، من الضروري أن تكون سريعة جداً عند إزالة المادة طافية، كما ستبدأ باراميسيا للسباحة خارج بيليه. زيادة ونقصان وإزالة المادة طافية من أنبوب واحد في كل مرة لضمان معالجة سريعة بما يكفي في هذه الخطوة، وتجنب فقدان باراميسيا في المادة طافية. - ، وتدور عينات عن طريق استخدام الطرد المركزي في 300 غرام x عند 15 درجة مئوية لإزالة الحد الأدنى 5 حوالي 10 مل من المادة طافية E3 باستخدام ماصة مصلية إضافة حوالي 10 مل 1 جديدة x E3 للأنبوبة المخروطية. كرر هذه الخطوة مرتين.
- إزالة عينات من أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز عند 15 درجة مئوية للحد الأدنى 5 حوالي 10 مل من المادة طافية E3، مع الحرص على عدم عرقلة بيليه.
- ريسوسبيند بيليه إلى 10 مل المتبقية لوسائل الإعلام E3 ونقل 500 ميليلتر من التعليق في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة. بيليه 500 ميليلتر من باراميسيا التي سينتريفوجينج في 300 x ز لمدة 5 دقائق لعد عدد باراميسيا.
- إزالة 400 ميليلتر من E3 طافية من العينة 500 ميليلتر. إضافة 20 ميليلتر من 36.5% فورمالدهايد الحل إلى ميليلتر 100 المتبقية من باراميسيا وريسوسبيند برفق، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة يقتل باراميسيا للسماح للعد. - قياس الحجم الإجمالي الفعلي باستخدام ماصة وسجل. تمييع تعليق باراميسيا 1:1 v/v، مع حل تريبان الأزرق 0.4 في المائة.
- استخدام العداد الخلية أو هيموسيتوميتير لحساب عدد القتلى باراميسيا/مل.
ملاحظة: بسبب خطوة التثبيت المسبق، سوف تكون باراميسيا معظم القتلى في هذه المرحلة، ولكن هذا الرقم يعكس عدد باراميسيا يعيش تجربة الحضانة المشتركة. الكتاب لم نجد الموت باراميسيا كبيرة بسبب حضانة المشارك البكتيرية، وبهذا يمكن تجاهلها كعامل هنا.
- شارك احتضان اليرقات باراميسيا والزرد.
- حساب تركيز باراميسيا:
ملاحظة: يعطي هذا الحساب تركيز باراميسيا في أنبوب 50 مل المخروطية من الخطوة 3.2.5. - حساب حجم غسلها باراميسيا اللازمة لتركيز من 2 × 105 مليلتر باراميسيا بحجم نهائي في 3 مل E3.
ملاحظة: ويمكن تعديل تركيز باراميسيا استناداً إلى الجرعة المطلوبة البكتيرية، التي تخضع للتحسين. - تخدير الزرد بإضافة تريكيني في تريس 100 ملم pH 8.0 إلى تركيز نهائي من 100 الزرد نقل 10 مغ/لتر. في كل بئر من لوحة 6-جيدا إلى حجم إجمالي 3 مل من E3 الطازجة التي تحتوي على تركيز مناسب من باراميسيا (المحسوبة في الخطوة 3.3.2)-ضمان نقل اليرقات في كمية صغيرة من السائل، لضمان أنها التعافي من التخدير في البئر المتلقية.
- احتضان عند 30 درجة مئوية ح 2 في حاضنة الدافيء تحت ظروف ضوء النهار، لتأمين ظروف البرق الأمثل لتنهب.
- أغسل الزرد 5 مرات على الأقل بنقل الأسماك إلى جديدة تتضمن أيضا 3 مل من E3 الطازجة التي تحتوي على تريكايني 100 مغ/لتر في كل مرة.
ملاحظة: لا تحاول تجاهل تريكيني أثناء الخطوة الغسيل. نقل اليرقات المحمول دون تخدير يزيد خطر الضرر والشدة للحيوان. - اختيارياً، تعد الزرد لتصوير عن طريق تضمين الزرد في 3 مل من 1% ذوبان منخفضة [اغروس] في لوحة 6-بئر مسورة الأسود: ذوبان منخفضة [اغروس] هو يتألف في 1xE3 وتسخينها في ميكروويف. حالما منصهرة، إضافة تريكيني بتركيز 160 مغ/مل نهائي. موقف الأسماك تحت ستيريوميكروسكوبي، استخدام هلام المقطوعة تحميل تلميح، التأكد من الرأس على اليسار والذيل على الحق (الشكل 3). انتظر لمدة 5 دقائق ل [اغروس] لتعيين، ثم تراكب الأسماك المضمنة مع x E3 1 التي تحتوي على تريكيني 160 ملغ/مل للتصوير.
- حساب تركيز باراميسيا:
- تحديد معدل الضحية.
ملاحظة: تجربة منفصلة لا يحتاج إلى إعداد لتحديد معدل الضحية. بدلاً من ذلك، يمكن أن يتم ذلك خلال الخطوة 3.3.4، كما هو موضح أدناه.- خلال الخطوة 3.3.4، أعرض الزرد الضحية على شريط فيديو ستيريوميكروسكوبي والقبض على القبض على الفريسة.
- نقاط لقطات الفيديو. التقاط فريسة تتسم بضرب من الزرد نحو الفريسة. عد كل ضربة كفريسة واحدة التقاط الحدث، على الرغم من أن هذا فقط تقريبي (انظر المناقشة).
- حساب متوسط عدد فريسة التقاط الأحداث كل ساعة من مقاطع الفيديو متعددة، كل منها يمثل يرقة الزرد مختلفة (الشكل 2).
Representative Results
سهولة الزاجرة caudatum براميسيوم طائفة واسعة من البكتيريا في مخزن فاكوليس. كثافة داخل الخلايا البكتيرية يعتمد على الكثافة من البكتيريا وباراميسيا في ثقافة المشاركة، فضلا عن الأنواع البكتيرية المستخدمة. مع مرور الوقت، أسيديفي فاكوليس وتدهور البكتيرية تستتبعه. معدل تدهور قد يتحدد فردياً لجميع السلالات المستخدمة. كولايالمسببة للمرض هو كثافة البكتيرية الأولية البكتيريا 790/براميسيوم، والبكتيريا المتدهورة مع نصف عمر حوالي 2.3 ح (الشكل 1).
رقم 1: تحديد العمر النصفي البكتيرية في باراميسيا- (أ) ح 2 التالية الحضانة المشتركة مع المعدية كولاي, P. كوداتوم كان غسلها ونقل إلى متوسطة دون البكتيريا. في النقاط الزمنية المشار إليها، أرقام لصالحه كولاي تم تحديد الخلايا بتمييع الطلاء على أجار انتقائية. النتائج وسائل ± الخطأ المعياري للوسط (وزارة شؤون المرأة؛ n = 3). (ب) صورة نموذجية لتحمل براميسيوم استيعاب البكتيريا، مع حقل مشرق (Bi)، البكتيريا الفلورسنت (Bii)، ودمج القنوات (بيي). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
علاوة على ذلك، الزرد تنهب معدل، وهو المعدل الذي الزرد استيعاب باراميسيا محملة بالبكتيريا على الحضانة المشتركة، درس. بدء الزرد اليرقات لمطاردة والتقاط فريسة حية من إدارة الشرطة الاتحادية 520، على الرغم من أن قد وجد أن، عندما أثيرت عند 30 درجة مئوية، هو تسارع التنمية اليرقات والحيوانات عرض سلوك الضحية من 4 إدارة الشرطة الاتحادية. تنهب مصحوبا بخاصية ضرب السلوك20 (الشكل 2A)، وتحديد معدل الضحية يستند إلى الافتراض بأن كل ضربة يؤدي إلى استيعاب براميسيوم واحد، على الرغم من أن هذا يمكن فقط أن ينظر تقريب (انظر المناقشة). استناداً إلى الملاحظات التي وصف هذه الوثيقة لاصطياد اليرقات الزرد، هو معدل امتصاص باراميسيا 1,539 تقريبا كل ح (الشكل 2).
رقم 2: تحديد معدل الضحية الزرد. (أ) الصور الثابتة من فيديو الضحية، عرض الزرد اليرقات (5 إدارة الشرطة الاتحادية) تنهب باراميسيا تحمل البكتيريا الفلورسنت. مرة في [ثانية]. يشير السهم إلى المحور الرئيسي للحركة خلال الإضراب. (ب) التحديد الكمي لمعدل الضحية (المدخول باراميسيا ساعة)، استناداً إلى n = 10 أشرطة الفيديو التي اتخذت مع مرور الوقت التعرض الكامل ح 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وبعد استيعاب باراميسيا، يحط الزرد كفاءة الفريسة في المعي، الإفراج عن البكتيريا المعدية في الجهاز الهضمي. كما هو موضح هنا، تدهور باراميسيا العائدات بسرعة، ويمكن الكشف عن البكتيريا الحرة في الأمعاء في غضون 30 دقيقة من تنهب. مجاناً البكتيريا ثم الانتقال من المعي بالامعاء المتوسط والخلفي، حيث يتم الكشف عن حوالي 1 – 2 ح بعد بداية الضحية (الشكل 3). استمرار وجود البكتيريا في الأمعاء يعتمد على الأنواع والجرعات ولكن نطاقات من ح عدة لعدة أيام في حالة كولاي وس. انتيريكا. يموضع س. انتيريكا في المقام الأول ماكس المعوية، مع بعض غزو الظهارية (3D الشكل)، مما أدى إلى تسلل العَدلات في الظهارة (الشكل 3).
الشكل 3: استعمار الزرد مع البكتيريا. الزرد في إدارة الشرطة الاتحادية 5 ترك مصابة (A) أو استعمرت مع مشري معربا عن كولاي من (ب) أو (ج) س. انتيريكا. قد يتم تنفيذ تجارب العدوى في الأسماك البرية نوع (A و B) أو خطوط محوره وراثيا (مثلاً خط تيراغرام (MPO::EGFP) أنا114 معربا عن العَدلات الفلورية الخضراء المبين في (ج). افتتاح المستقيم يتسم سهم. (د) أعلى التكبير قسم المعوية من اليرقات مضمن جبل كل مصاب بعدوى السالمونيلا انتيريكا . الأزرق (Di) = هويشت وسم النوى، الأرجواني (دي) = فالويدين وسم واكتين، الأحمر (ديي) = السالمونيلا، دمج (Div). شريط المقياس = 5 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيلم 1: لقطات فيديو لالتقاط الفريسة. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Discussion
البروتوكول الأساسية الموصوفة هنا تم الأمثل للممرضة كولاي، وقد تم تكييف بنجاح للأنواع البكتيرية الأخرى، بما في ذلك انتيريكا السالمونيلا و الكوليرا. لبعض الأنواع التي لم تستعمر الأمعاء الزرد بعد غمر حمام، بما في ذلك بعض سلالات السالمونيلا انتيريكا وبعض اللاهوائيات، العدوى المنقولة عن طريق الأغذية كما هو موضح هنا يمكن بنجاح إنشاء الاستعمار. ميكروجافاجي، الذي يستخدم أيضا إنشاء ارتفاع أعباء البكتيرية في الأمعاء اليرقات، بالمقارنة مع العدوى المنقولة عن طريق الأغذية من الناحية التقنية أقل تحديا ويتطلب معدات متخصصة أقل. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل المعلمات حرجة للأنواع البكتيرية وسلالات لاستخدامها. وتشمل هذه العوامل البكتيرية وبراميسيوم الكثافة للخطوة ثقافة المشارك البكتيريا-براميسيوم: إذا كانت أرقام البكتيرية داخل باراميسيا منخفضة، هذا يمكن تحسينها من خلال زيادة كثافة البكتيرية في الخطوة ثقافة المشارك. بعض الأنواع البكتيرية قد يسبب الضرر للمضيف براميسيوم وينبغي تقييم هذا الفحص المجهري.
عامل مهم آخر في هذا البروتوكول استيلاء فريسة الزرد. ويستند على افتراض أن كل التقاط فريسة الإضراب النتائج في ابتلاع براميسيوم واحد معدل الضحية كما هو موضح هنا. وتستخدم كثافات عالية من باراميسيا كل الأسماك في البروتوكول لضمان ارتفاع معدلات الضحية. ومع ذلك، التقاط فريسة اعتماداً على كثافة باراميسيا في النظام، وفي الثقافات براميسيوم مخفف جداً، قد تكون الضحية معدلات منخفضة تصل إلى 13 – 15 باراميسيا كل ساعة21،22. حد هو أن معدلات التقاط الفريسة أيضا تعتمد بشدة على ظروف الإضاءة وفي الظلام، ومعدلات التقاط 80% أقل مما في ضوء الظروف21 ، وهذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند إعداد تجارب. إذا كان مرات التعرض فريسة لتوسيع نطاق لتحسين الاستعمار، قد النظر للتعرض الثانوي للبكتيريا عن طريق البراز. لا يكاد هذا التعرض الظروف المذكورة أعلاه – ح 2 من التعرض فريسة –، منذ وقت مرور القناة الهضمية من البكتيريا أكثر من 1 ح وتركيز البكتيريا في السيارة أعلى بكثير مما في البراز. ومع ذلك، إذا كان إلى حد كبير هو زيادة وقت التعرض فريسة، هذا قد تصبح عاملاً هاما.
ضوابط ملائمة ينبغي أن تدرج في هذا البروتوكول، بما في ذلك استعمار الزرد عقب التغذية مع باراميسيا المحتوية على غير ممرضة كولاي MG1655. إذا مقارنة السلالات البكتيرية متعددة لقدرتها على استعمار البلد المضيف الزرد، فمن المهم اختبار ما إذا كان نصف العمر بهم داخل باراميسيا قابل للمقارنة. الطفرات البكتيرية، بما في ذلك المساس بسلامة جدار الخلية أو حمض الاستشعار، قد يعرض للخطر الاستقرار البكتيرية داخل باراميسيا. في مثل هذه الحالات، والتغذية الزرد قد يتعين تعديلها لمراعاة الاختلافات في الجرعة.
يمكن استخدام البروتوكول هو موضح هنا للتحقيق الاستعمار الجرثومي ونتائجها، بما في ذلك التصوير الاستعمار الجرثومي من الزرد كما هو موضح أعلاه، فضلا عن تحديد زيمبابوي الواحدة الزرد من الأنسجة هوموجيناتي3، أو التحقيق المرتبطة بالإصابة بالأمراض والوفيات. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم السلالات البكتيرية معربا عن البروتينات الفلورية مثل مشري أو البروتين الأحمر نيون (RFP) للتصور البكتيرية،. سيسمح هذا التصور من تزايد السكان البكتيرية. إذا لم يكن وراثيا أصعب السلالة البكتيرية أو يمنع استخدام تعبير البروتينات الفلورية لأسباب أخرى، قد ملطخة البكتيريا بصبغة فلورسنت، مثل وزير الخارجية 4-64FX، السابقة الثقافة شارك مع باراميسيا. عند استخدام بروتوكول الموصوفة هنا، ثقافة المشارك مع باراميسيا عدم تقليل سطوع الصبغ والبكتيريا ملطخة مرئية بوضوح في الأمعاء الزرد. ومع ذلك، سوف المخفف الصبغة على مر الزمن ينبغي أن يحدث انتشار البكتيرية كبيرة داخل البلد المضيف الزرد. وفي كلتا الحالتين، الأحمر نيون البكتيريا الأفضل على البكتيريا الخضراء-فلوري، منذ أوتوفلوريسسينسي الأنسجة يمكن أن تكون أعلى في الأخضر في القناة الحمراء.
وقد وجد أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها للهوائي والأنواع البكتيرية ميكروايروفيليك. قد يكون من الممكن لتكييفه لتغذية الجراثيم والأنواع الفطرية، على الرغم من أن هذا لا يزال يمكن اختباره تجريبيا.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر أعضاء الفريق كراتشلير لقراءة نقدية وتعليقات على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل على جائزة "نجم نظم حزب التحرير"، في بسرك، والمعاهد الوطنية للصحة (R01AI132354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
