Summary
Zebrafish (Danio rerio) worden een veel gebruikte gewervelde diermodel voor microbiële kolonisatie en de pathogenese. Dit protocol beschrijft het gebruik van de protozoan Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infectie in zebrafish larven. P. caudatum gemakkelijk internaliseert bacteriën en krijgen overgenomen door larvale zebrafish via natuurlijke azen gedrag.
Abstract
Als gevolg van hun transparantie, genetische werkwillig en gemak van onderhoud geworden zebravissen (Danio rerio) een veel gebruikte gewervelde model voor besmettelijke ziekten. Larvale zebrafish prooi natuurlijk op de eencellige protozoan Paramecium caudatum. Dit protocol beschrijft het gebruik van P. caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infectie in larvale zebrafish. P. caudatum internaliseren een breed scala van bacteriën en bacteriële cellen levensvatbaar blijven gedurende enkele uren. Zebravis prooi vervolgens op P. caudatum, de bacteriële belasting is uitgebracht in de voordarm na vertering van de paramecium voertuig en de bacteriën koloniseren het darmkanaal. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van paramecia onderhoud, laden met bacteriën, bepaling van de bacteriële afbraak en dosis, evenals infectie van zebravis door het vervoederen van paramecia. Het voordeel van het gebruik van deze methode van voedsel overgedragen infectie is dat het nauw de wijze van besmetting waargenomen in ziekten bij de mens bootst, tot meer robuuste kolonisatie in vergelijking met onderdompeling protocollen leidt en de studie van een breed scala van ziekteverwekkers toelaat. Voedsel overgedragen infectie in de zebravis model kan worden gebruikt om te onderzoeken van bacteriële genexpressie binnen de host, gastheer-pathogeen interacties en kenmerken van de pathogeniteit waaronder bacteriële belasting, lokalisatie, verspreiding en morbiditeit.
Introduction
Zebravis aandeel morfologisch en functioneel geconserveerd functies met zoogdieren, met inbegrip van granulocyten lineages (bijvoorbeeld neutrofielen), monocyt/macrofaag-achtige cellen Toll-like receptoren, pro-inflammatoire cytokines en antimicrobiële peptiden1 . Het darmkanaal in zebrafish is volledig ontwikkeld op 6 dagen post bevruchting (dpf) en toont morfologische en functionele behoud met het zoogdieren maag-darmkanaal, zoals geconserveerde transcriptionele verordening in intestinale epitheliale cellen 2. Dit maakt zebrafish een uitstekend model voor intestinale microbiële kolonisatie en de pathogenese. Een breed scala aan darmen microben is onderzocht in de zebravis model, met inbegrip van de enterohemorrhagic Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, de zebravis microbiota7,8, en de rol van probiotica in intestinale immuniteit9. Een duidelijk voordeel van de zebravis model is dat het is gekoloniseerd door vele microben zonder het verstoren van de endogene microbiota, waarmee het onderzoek van microbiële gedrag in het kader van gemengde microbiële populaties3, 6. momenteel meeste zebrafish modellen van gastro-intestinale kolonisatie en ziekte vertrouwen op de administratie van microben door onderdompeling in Bad, waar Zebravissen zijn geïncubeerd in een bacteriële suspensie voor een specifieke hoeveelheid tijd10. Echter, dit maakt het moeilijk om de exacte hoeveelheid bacteriën toegediend, en leidt tot beperkte kolonisatie met sommige microben, met name bij niet-pathogene bacteriën. U kunt ook een bacteriële suspensie wordt toegediend om te vissen via mondelinge maagsonde11, maar dit is technisch uitdagende en beperkt tot de oudere larven en de volwassen vis.
Dit protocol beschrijft het gebruik van de eencellige protozoan Paramecium caudatum als een voertuig voor levering van microben voedsel overgedragen aan het maag-darmkanaal van zebravis larven. Paramecia zijn gemakkelijk en goedkoop te onderhouden en zijn geschikt voor het voeden met een grote verscheidenheid van microben, met inbegrip van algen, schimmels en bacteriën, die ze via een ciliated mondelinge groove12,13,14internaliseren. Eenmaal geïnternaliseerd, bacteriën worden gehouden in de vacuolen, zijn die uiteindelijk breng en inhoud gedegradeerd over een tijdsbestek van enkele uren15. Larvale zebrafish vangen de paramecia gegevens als natuurlijke prooi spoedig na het uitkomen, ongeveer 3-4 dpf afhankelijk van temperatuur16, en ze duren met een hoog rendement. Het proces voor het vangen van de prooi neemt gemiddelde 1.2 s van detectie te vangen van17, en gevangen paramecia zijn snel verteerd in de zebravis voordarm, zodat het darmkanaal3verinnerlijkte levensvatbare bacteriën vrijkomen. Dientengevolge, kan paramecia worden gebruikt als een snelle en eenvoudige methode om te leveren een hoge en constante dosis van bacteriën in het maag-darmkanaal van de zebravis. De geleverde bacteriën kunnen ofwel worden getransformeerd om uit te drukken een fluorescente proteïne, zoals mCherry, zoals hier wordt beschreven, of, in het geval van genetisch hardnekkige bacteriën, kunnen zij vooraf gekleurd met een fluorescente kleurstof toe visualisatie binnen de gastro-intestinale tractus.
Dit protocol beschrijft de levering van voedsel van enteropathogenic E. coli ( E. coli [EHEC] enterohemorrhagic en aanhangend invasieve E. coli [AIEC]), en Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Zowel de pathogene E. coli en S. typhimurium zijn verzonden via de faecale-orale route18,19, en kan worden verworven via besmet voedsel, zoals vlees, groenten en zuivel. P. caudatum als een voertuig gebruikt, koloniseren E. coli en S. typhimurium succesvol de zebravis larven binnen 30-60 min van co incubatie met de paramecium-voertuig. De bereikte bacteriële belasting is robuust genoeg om te visualiseren van kolonisatie en lasten door plating weefsel homogenates bepalen.
Protocol
Zebravis zorg-, fok- en experimenten die hier beschreven zijn in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en zijn goedgekeurd door de Commissie institutionele dierenwelzijn, van de University of Texas Health Science Center, protocol nummer AWC-16-0127.
1. groei en het onderhoud van Paramecia
- Verkrijgen live paramecia culturen uit bronnen zoals de zebravis International Resource Center (ZIRC).
- Uit een levende groeiende cultuur, voeg 1 mL van de paramecia cultuur, 1 mL van een cultuur MG1655 E. coli (optische dichtheid OD600 1.0-2.0) geresuspendeerde in 1 x E3 (0.29 g/L NaCl, KCl, 13 mg/L 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0,48 g/L HEPES, pH 7.0, steriele), en 8 mL van de 1 x E3 in een maatkolf van 10 mL weefselkweek. Swirl licht en sla bij 22 ° C.
- Als u wilt een cultuur te behouden, om de twee weken, passage 1 mL van de cultuur van een paramecia in een maatkolf van 10 mL weefselkweek met 9 mL vers 1 x E3 medium met 108 CFU/mL van E. coli MG1655 geresuspendeerde in 1 x E3.
2. bepaling van bacteriële dosis toegediend aan zebravis
-
Bacteriële half-life binnen Paramecium bepalen
Opmerking: De halfwaardetijd van bacteriën binnen paramecia wordt bepaald door de beplating levensvatbare E. coli verhaald paramecium, zoals hieronder beschreven.- Na een 2 uur incubatie van bacteriën (OD600 voor 1.0) met paramecia bij 22 ° C, de paramecia en co bacteriecultuur in een conische buis van 50 mL te combineren, wassen van de paramecia met 1 x E3, en tellen het aantal paramecia per milliliter (zoals hieronder beschreven in stappen 3.2.7 en 3.2.8).
- Na het tellen van het aantal paramecia, 50 µL van de paramecia en co bacteriecultuur elk uur (voor 6 h post-exposure) verwijderen en toevoegen van elk monster in een verse 1,5 mL-buis.
- Plaats 950 µL van 1% nonionic oppervlakteactieve stof (Zie Tabel van materialen) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in elk van de 1,5 mL buizen en vortex voor 1 min lyse van de paramecia. Uitvoeren van 1:10 verdunnen van elk monster met behulp van steriele PBS als een verdunningsmiddel (d.w.z. 100 µL in 900 µL).
- Plaat 100 µL van elke verdunning op selectieve platen (LB tet medium: 0,5 g/L gistextract, 1 g/L NaCl, 1 g/L trypton, 30 µg/mL tetracycline) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur. De volgende dag, tellen en registreren van het aantal bacteriële kolonies op de plaat (kolonie vormende eenheden, CFUs) door te tellen alleen de geïsoleerde en verschillende afzonderlijke kolonies. Het identificeren van een plaat met een verdunning die 30-300 kve geeft.
- Bepalen van de verdunning factor gebruikt. Bijvoorbeeld, als 1 µL van de bacteriële cultuur is gemengd met 99 mL steriele PBS, is dit een 1:100 (0,01) verdunning. Dit nummer wordt het aantal KVE in de verdunningstunnel. De berekening hieronder, voor elk punt van de tijd, om te bepalen van de CFU in de oorspronkelijke steekproef uitvoeren:
- Berekenen en grafiek van het aantal levensvatbare E.coli/paramecium overeenkomt met de uren post blootstelling met behulp van de paramecia-concentratie berekend in stap 3.3.1 en bepalen de halfwaardetijd binnen het paramecia (Figuur 1).
- Met behulp van de CFU nummer berekend voor elk punt van tijd, berekenen en grafiek van het aantal levensvatbare E. coli per paramecium op de y-as ten opzichte van de incubatie post uren op de x-as, met behulp van de paramecia-concentratie berekend in stap 3.3.1. De halfwaardetijd in de paramecia te bepalen.
-
Bepalen bacteriële doseren van bacteriële half-life en azen stem.
Opmerking: Om te bepalen van de bacteriële dosering, moet de halfwaardetijd van de bacteriën binnen de paramecia en de preying zebravis op paramecia (zie stap 3.4) rekening worden gehouden.- Gebruik de volgende formule om te bepalen van bacteriële verval binnen paramecia:
(1)
Waarbij N0 de eerste hoeveelheid bacteriën per paramecia na de 2 uur incubatie is, Nt is het resterende aantal na tijd t, τ is de tijd waarna het aantal levensvatbare bacteriën is gehalveerd en k de verval-constante. - Bepalen van de aantasting van het experiment, de constante k van verval met behulp van de bacteriële halfwaardetijd (dat wil zeggen, de tijd waarna het bedrag van levensvatbare bacteriën/paramecium gehalveerd).
(2)
Voor de bepaling van half-life, de term
en
(3)
of
(4)
Opmerking: Gebaseerd op Figuur 1, is de halfwaardetijd van E. coli in paramecia ongeveer 2.3 h. Dus, met behulp van formule (4), het verval rate, k, voor E. coli is:
(5)
- Bepalen van het verval tarief (k) uit het experiment half-life te vinden van de dosis van levensvatbare bacteriën (Nt) in beslag genomen door de larven van de zebravis na azen tijd (t), waar (P) is het preying tarief of het aantal paramecia opgegeten door één vis per uur:
(6)
of
(7)
Opmerking: Per Figuur 1is de oorspronkelijke hoeveelheid bacteriën per paramecia (N-0) na een een incubatieperiode van 2 h (t) 790 CFU. Per film 1 en Figuur 2bedraagt de preying (P) 1539. - Gebruik deze waarden te vervangen door in vergelijking (7), het berekenen van de bacteriële dosering die wordt verbruikt door een zebravis na een incubatieperiode van 2 h als:
(8)
- Gebruik de volgende formule om te bepalen van bacteriële verval binnen paramecia:
en
of
of
3. voedsel overgedragen infectie van de zebravis
- Incubeer bacteriën met Paramecia.
- Bereiden een co cultuur van paramecia en E. coli MG1655 de avond voorafgaand aan de infectie. Combineren van 8 mL E3 media, 1 mL van een cultuur van voortdurende paramecia en 1 mL van een cultuur van de MG1655 E. coli (OD600 = 1.0) geresuspendeerde in 1 x E3 in T25 weefselkweek kolven. Incubeer de kolven op kamertemperatuur (RT) 's nachts. Voor elke voorwaarde die behandeling, twee maatkolven van paramecia te bereiden.
- Inoculeer bacteriegroei media (LB: 1 g/L trypton, 0,5 g/L gistextract, 1 g/L NaCl) met besmettelijke spanning van bacteriën, door het plukken van een individuele bacteriële kolonie van een plaat met behulp van een steriele inoculatie lus. Incubeer de vloeibare cultuur bij 37 ° C en laat schudden bij 110 rotaties per minuut (rpm) 's nachts.
Opmerking: Persoonlijke beschermingsmiddelen (een laboratorium jas en handschoenen) moet worden gedragen en bioveiligheid niveau 2 voorzieningen moeten worden gebruikt bij de behandeling van infectieuze agentia. - Op de volgende dag, meet u de OD600 van de overnachting cultuur. Het volume van cultuur nodig om een OD600 1 wanneer in media 11 mL geresuspendeerde berekenen.
- Oogst de hoeveelheid bacteriën vanaf stap 3.1.2 via centrifugeren op 6.000 x g gedurende 5 minuten, één volume voor elke Erlenmeyer overgebracht van het paramecia. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 1 mL E3 media.
- Optioneel, vooraf vlek de bacteriën met een fluorescente kleurstof.
- Voeg 1 µL van FM 4-64FX bacteriële vlek (5 mg/mL stockoplossing). Dekken van buis met folie te beschermen tegen photobleaching en incubeer roterende over eind op RT gedurende 15 minuten.
- Het verwijderen van overtollige kleurstof door wassen met 1 x E3: Pellet bacteriën via centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 1,5 min en resuspendeer de pellet in 1 mL E3 media. Herhaalstap wassen twee keer.
- Oogst gebeitst bacteriën via centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 1 mL E3 media.
- 1 mL van de bacteriële schorsingen toevoegen aan elk van de twee maatkolven van verse paramecia. Incubeer bij RT gedurende 2 uur.
Opmerking: Als werken met gekleurd bacteriën, incubeer in het donker bij RT gedurende 2 uur.
- Wash bacteriën/paramecia co cultuur.
- De inhoud van beide kolven van paramecia/bacteriën co cultuur in een conische buis van 50 mL te combineren. Centrifugeer steekproeven bij 300 x g bij 15 ° C voor 10 min. Zorg ervoor dat de centrifuge vooraf gekoelde voorafgaand aan deze stap.
- Verwijderen van ongeveer 10 mL van het supernatans van de E3 met behulp van een precisiepipet serologische en voeg ongeveer 10 mL vers 1 x E3 aan de conische buis.
Opmerking: Tijdens alle stappen van de wasbeurt is het essentieel om zeer snel bij het verwijderen van de bovendrijvende substantie, zoals de paramecia beginnen zal om te zwemmen uit de pellet. Spin en bovendrijvende vloeistof verwijderen uit een buis tegelijk om snel genoeg behandeling bij deze stap, en voorkomen dat het verlies van paramecia in het supernatant. - Spin monsters via centrifugeren bij 300 x g bij 15 ° C voor 5 min. verwijderen ongeveer 10 mL van het supernatans van de E3 met behulp van een precisiepipet serologische, en voeg ongeveer 10 mL vers 1 x E3 aan de conische buis. Herhaal deze stap tweemaal.
- Centrifugeer steekproeven bij 300 x g bij 15 ° C gedurende 5 min. verwijderen ongeveer 10 mL van het supernatans dat E3, niet te verstoren de pellet verzorgen.
- Resuspendeer de pellet in de overblijvende 10 mL van E3 media en breng 500 µL van de schorsing in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis. Pellet de 500 µL van paramecia door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 min om het aantal paramecia te tellen.
- 400 µL van het supernatant E3 uit het monster 500 µL verwijderen. 20 µL van 36,5% formaldehyde-oplossing toevoegen aan de resterende 100 µL paramecia zachtjes resuspendeer en incubeer gedurende 5 min bij 22 ° C.
Opmerking: Deze stap doodt de paramecia toe om te tellen. - Het meten van feitelijke totale volume met behulp van het pipet en record. Verdun de paramecia schorsing 1:1 v/v met 0,4% trypan blauwe oplossing.
- Een cel teller of hemocytometer gebruiken om te tellen van het aantal dode paramecia/mL.
Opmerking: Vanwege de voorafgaande fixatie stap, zal de meeste paramecia dood op dit punt, maar dit nummer weerspiegelen het aantal levende paramecia voor de co incubatie-experiment. De auteurs hebben niet gevonden significante paramecia overlijden ten gevolge van bacteriële co incubatie, zodat dit kan worden genegeerd als een factor is hier.
- Samen Paramecia en zebrafish larven uit te broeden.
- Bereken de concentratie van paramecia:
Opmerking: Deze berekening geeft de concentratie van paramecia in de conische tube van 50 mL uit stap 3.2.5. - Bereken het volume van de gewassen paramecia nodig voor een concentratie van 2 x 10,5 paramecia/mL in een eindvolume van 3 mL E3.
Opmerking: De concentratie van paramecia kan worden aangepast op basis van de gewenste bacteriële dosering, die onderworpen aan de optimalisatie is. - Zebravis anesthetize door toevoeging van tricaïne in 100 mM Tris pH 8,0 tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg/L. overdracht 10 zebrafish in elk putje van de plaat van een 6-well in een totaal volume van 3 mL verse E3 met de juiste concentratie van paramecia (berekend in stap 3.3.2). Zorg ervoor dat overdracht van de larven in een minimale hoeveelheid vloeistof, zodat ze herstellen van verdoving in de ontvangende put.
- Incubeer bij 30 ° C gedurende 2 uur in een diurnale incubator onder daglicht omstandigheden, om te zorgen voor optimale bliksem voorwaarden voor azen.
- Zebravis minstens 5 keer wassen door de overdracht van vis in een nieuwe goed met 3 mL verse E3 met 100 mg/L tricaïne elke keer.
Opmerking: Probeer niet de tricaïne tijdens het wassen stap weglaten. Overdracht van mobiele larven zonder verdoving, verhoogt het risico van schade en leed aan het dier. - Optioneel, voorbereiden zebrafish beeldvorming door inbedding zebrafish in 3 mL 1% laag-smelt agarose in een zwart-ommuurde 6-well plaat: Low-smelt agarose is aangelengd met 1xE3 en verwarmd in een magnetron. Zodra gesmolten, tricaïne aan een eindconcentratie van 160 mg/mL toevoegen. Standpunt vis onder een stereomicroscoop, met behulp van een geknipte gel laden tip, ervoor te zorgen dat het hoofd aan de linker- en de staart is is aan de rechterkant (Figuur 3). Wacht 5 minuten voor de agarose om in te stellen, dan de ingesloten vis met 1 x E3 met 160 mg/mL tricaïne voor imaging-overlay.
- Bereken de concentratie van paramecia:
- De preying tarief bepalen.
Opmerking: Geen aparte experiment moet worden ingesteld om te bepalen van de preying tarief. Integendeel, dit kan gebeuren tijdens stap 3.3.4, zoals hieronder beschreven.- Tijdens stap 3.3.4, zebravis azen op een stereomicroscoop en vangen videobeelden van het vangen van de prooi te bekijken.
- Score van de videobeelden. Vangen van de prooi wordt gekenmerkt door het slaan van zebravis richting de prooi. Elke staking tellen als een prooi vangen gebeurtenis, hoewel dit slechts een benadering is (Zie discussie).
- Bereken het gemiddelde aantal prooi vangen gebeurtenissen per uur van meerdere videoclips, elk vertegenwoordigt een verschillende zebrafish larve (Figuur 2).
Representative Results
Paramecium caudatum internaliseert gemakkelijk een groot aantal bacteriën in opslag vacuolen. De intracellulaire bacteriële dichtheid is afhankelijk van de dichtheid van bacteriën en paramecia in de co cultuur, evenals de bacteriesoorten gebruikt. Na verloop van tijd de vacuolen breng en bacteriële afbraak ontstaat. Het tempo van de degradatie moet individueel worden vastgesteld voor alle stammen gebruikt. Voor de pathogene E. coli, is de eerste bacteriële dichtheid 790 bacteriën /paramecium, en bacteriën zijn gedegradeerd met een halfwaardetijd van ongeveer 2.3 h (Figuur 1).
Figuur 1: bepaling van bacteriële halfwaardetijd in paramecia. (A) volgende 2 h van co incubatie met besmettelijke E. coli, P. caudatum werd gewassen en overgebracht naar medium zonder bacteriën. Op de aangegeven tijd punten, nummers van levensvatbare E. coli cellen werden bepaald door verdunning plating op selectieve agar. Resultaten zijn middelen ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM; n = 3). (B) typische beeld van de paramecium uitvoering geïnternaliseerd bacteriën, met heldere veld (Bi), fluorescent bacteriën (Bii), en samengevoegd kanalen (Biii). Schaal bar = 20 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Further, de zebravis azen tarief, dat wil zeggen, het tempo waarin zebrafish internaliseren bacteriën-geladen paramecia op co incubatie, werd bestudeerd. Larvale zebrafish beginnen te jagen en vangen van levende prooien van 5 dpf20, hoewel werd geconstateerd dat, wanneer aan de orde gesteld bij 30 ° C, larvale ontwikkeling wordt versneld en dieren azen gedrag van 4 dpf weergeeft. Azen gaat vergezeld van een karakteristiek opvallend gedrag20 (figuur 2A), en de bepaling van het preying tarief is gebaseerd op de veronderstelling dat elke staking tot toerekening van één paramecium leidt, hoewel dit kan alleen worden beschouwd een onderlinge aanpassing (Zie discussie). Op basis van de hierin beschreven opmerkingen van azen zebrafish larven, is het tarief van paramecia opname ongeveer 1539 per h (figuur 2B).
Figuur 2: bepaling van de zebravis azen tarief. (A) stilstaande beelden uit een preying video, toont een zebravis larven (5 dpf) azen op paramecia dragen van fluorescerende bacteriën. Tijd in [seconds]. Pijl geeft aan dat de hoofdas van beweging tijdens het opvallend. (B) kwantificering van azen tarief (paramecia inname per uur), op basis van n = 10 video's overgenomen van de volledige 2 h blootstellingstijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Na de internalisering van de paramecia degradeert de zebravis efficiënt de prooi in de voordarm, vrijgeven van besmettelijke bacteriën in het spijsverteringsstelsel. Zoals hierin beschreven, paramecia aantasting verloopt snel en gratis bacteriën kunnen worden opgespoord in het darmkanaal binnen 30 minuten van azen. Vrij van bacteriën dan verplaatsen van de voordarm naar de mid- en posterieure darm, waar ze worden gedetecteerd ongeveer 1 – 2 uur na het begin van Azen (Figuur 3). Bacteriële persistentie in de darm is afhankelijk van de soorten en dosis maar bereiken van verschillende h tot meerdere dagen in het geval van E. coli en S. enterica. S. enterica lokaliseert voornamelijk in de intestinale mucosae, met sommige epitheliale invasie (figuur 3D), wat leidt tot infiltratie van neutrofielen in het epitheel (Figuur 3 c).
Figuur 3: kolonisatie van zebravis met bacteriën. Zebravis op 5 dpf werden verlaten van niet geïnfecteerde (A) of gekoloniseerd met mCherry uitdrukken (B) E. coli of (C) S. enterica. Infectie experimenten kunnen worden uitgevoerd in wild type (A en B) vis of transgene regels (bijvoorbeeld de regel GS (MPO::EGFP) ik114 uiting van groen fluorescent neutrofielen in (C) weergegeven. De rectale opening wordt gekenmerkt door een pijl. (D) hogere vergroting van intestinale sectie uit ingesloten larven geheel-mount besmet met Salmonella enterica infectie. Blauw (Di) = Hoechst markering kernen, (Dii) paars = phalloidin F-actine, (terugmatch) rode markering = Salmonella (Div) samenvoegen. Schaal bar = 5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: Video footage van de prooi vangen. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
De hier beschreven basisprotocol is geoptimaliseerd voor pathogene E. coli, en is met succes aangepast voor andere bacteriële soorten, met inbegrip van Salmonella enterica en Vibrio cholerae. Voor sommige soorten die niet de darm van de zebravis na onderdompeling in Bad koloniseren doen, met inbegrip van sommige stammen van Salmonella enterica en sommige sporenvormende anaerobe bacteriën, kan voedsel overgedragen infectie zoals hier beschreven worden gebruikt met succes om kolonisatie. In vergelijking met microgavage, die ook wordt gebruikt om hoge bacteriële lasten in het larvale darmkanaal, voedsel overgedragen infectie is technisch minder uitdagend en vereist minder gespecialiseerde apparatuur. Echter, moeten kritische parameters worden geoptimaliseerd voor de bacteriële soorten en stammen worden gebruikt. Dergelijke factoren omvatten bacteriële en paramecium dichtheid voor de bacteriën-paramecium co cultuur stap: als bacteriële nummers binnen paramecia laag zijn, dit kan worden verbeterd door het verhogen van de bacteriële dichtheid in de co cultuur stap. Sommige bacteriële soorten kan schade veroorzaken aan de paramecium-host, en dit moet worden beoordeeld door microscopie.
Een andere belangrijke factor in dit protocol is prooi vangen door zebrafish. De preying tarief is zoals hier beschreven gebaseerd op de veronderstelling dat elke prooi vangen resultaten staking in de inname van één paramecium. Hoge dichtheid van paramecia per vis worden gebruikt in het protocol om azen hoge. Echter prooi vangen is afhankelijk van de dichtheid van paramecia in het systeem, en in zeer verdunde paramecium culturen, wellicht azen tarieven zo laag als 13 – 15 paramecia per uur21,22. Een beperking is dat prooi vangen tarieven is ook sterk afhankelijk van de verlichting van de voorwaarden en in het donker, inneming tarieven zijn 80% lager dan in lichtomstandigheden21 en dit moeten rekening worden gehouden bij het opzetten van experimenten. Als belichtingstijden ten prooi worden uitgebreid moeten tot het optimaliseren van de kolonisatie, moet overweging worden gegeven aan secundaire blootstelling aan bacteriën via ontlasting. Onder de voorwaarden beschreven hierboven – 2 h van prooi blootstelling – is deze blootstelling verwaarloosbaar, aangezien darm passage tijd van bacteriën meer dan 1 h is en de concentratie van bacteriën in het voertuig veel hoger dan in de ontlasting is. Echter, als prooi belichtingstijd wordt aanzienlijk verhoogd, kan dit een belangrijke factor geworden.
Passende controles moeten worden opgenomen in dit protocol, met inbegrip van kolonisatie van zebravis na voeden met paramecia met niet-pathogene E. coli MG1655. Als meerdere bacteriestammen worden vergeleken om hun vermogen om het koloniseren van de zebravis host, is het belangrijk om te testen of hun halfwaardetijd binnen paramecia vergelijkbaar is. Bacteriële mutaties, met inbegrip van die afbreuk te doen aan de integriteit van de celwand of zure sensing, kunnen bacteriële stabiliteit binnen paramecia in gevaar brengen. In dergelijke gevallen heeft zebrafish voeding aangepast worden aan de account voor de verschillen in dosering.
Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt voor het onderzoeken van bacteriële kolonisatie en de gevolgen daarvan, met inbegrip van door bacteriële kolonisatie van zebravis imaging zoals hierboven beschreven, alsmede door kve per zebrafish van weefsel homogenaat3, vast te stellen of onderzoek naar infectie-geassocieerde morbiditeit en mortaliteit. In het ideale geval voor bacteriële visualisatie, moeten bacteriestammen uiting van fluorescente proteïnen zoals mCherry of rode fluorescente proteïne (RFP) worden gebruikt. Hierdoor zal de visualisatie van de groeiende bacteriële bevolking. Als de bacteriële stam niet genetisch hanteerbare is of het gebruik van fluorescerend eiwit expressie is uitgesloten om andere redenen, kunnen bacteriën worden gekleurd met een fluorescente kleurstof, zoals FM 4-64FX, voorafgaand aan samen met de paramecia cultuur. Wanneer u het protocol beschreven hier, mede cultuur met paramecia geen invloed heeft op de helderheid van de kleurstof en gebeitst bacteriën zijn duidelijk zichtbaar in de zebravis darm. Echter zal de kleurstof worden verdund na verloop van tijd belangrijke bacteriële proliferatie plaatsvindt binnen de zebravis host. In beide gevallen zijn de rood-fluorescerende bacteriën beter over groen-fluorescerende bacteriën, aangezien weefsel autofluorescence hoger in het groen dan in het rode kanaal kan zijn.
Het is gebleken dat dit protocol kan worden aangepast voor aërobe en microaerophilic bacteriesoorten. Het mogelijk aan te passen voor het voederen van sporen en schimmels soorten, hoewel dit nog experimenteel worden getest.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken leden van de groep van de Krachler voor kritische lezing en opmerkingen op het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een UT systemen STAR award, de BBSRC en de NIH (R01AI132354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
