Summary
Zebrafisch (Danio Rerio) immer eine weit verbreitete vertebrate Tiermodell für mikrobielle Besiedlung und Pathogenese. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Protozoen Paramecium Caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektion im Zebrafischlarven. P. Caudatum leicht internalisiert Bakterien und bekommen von Larven Zebrafisch durch natürlichen Jagd Verhalten aufgenommen.
Abstract
Aufgrund ihrer Transparenz, genetische Lenkbarkeit und Mühelosigkeit der Wartung Zebrafisch (Danio Rerio) verbreitete vertebrate Model für Infektionskrankheiten geworden. Larval Zebrafisch Beute natürlich auf die einzelligen Protozoen Paramecium Caudatum. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von p. Caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektion im Larvenstadium Zebrafisch. P. Caudatum verinnerlichen ein breites Spektrum von Bakterien und bakterielle Zellen bleiben für mehrere Stunden lebensfähig. Zebrafisch Beute dann auf p. Caudatum, die bakterielle Belastung ist in der Foregut bei der Verdauung des Fahrzeugs Paramecium freigegeben, und die Bakterien besiedeln den Darm-Trakt. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Pantoffeltierchen Wartung, Belastung mit Bakterien, Bestimmung von bakteriellen Abbau und Dosis sowie Zebrafisch-Infektion durch die Fütterung mit Pantoffeltierchen. Der Vorteil der Verwendung dieser Methode der lebensmittelbedingte Infektion ist, dass es eng den Modus der Infektion beobachtet in der menschlichen Krankheit imitiert, zu robuster Kolonisation im Vergleich zum Eintauchen Protokolle führt und die Untersuchung einer Vielzahl von Krankheitserregern ermöglicht. Lebensmittelbedingte Infektionen im Zebrafisch-Modell kann verwendet werden, um bakterielle Genexpression im Wirt, Wirt-Pathogen Interaktionen und Markenzeichen der Pathogenität einschließlich bakterielle Belastung, Lokalisierung, Verbreitung und Morbidität zu untersuchen.
Introduction
Zebrafisch Anteil morphologisch und funktionell konserviert mit Säugetieren, einschließlich granulocytic Linien (z. B. Neutrophile), Monocyte/Makrophagen-artige Zellen, Toll-Like-Rezeptoren, Pro-inflammatorischen Zytokinen und antimikrobielle Peptide1 . Die Darm-Trakt im Zebrafisch ist an 6 Tagen Post Düngung (Dpf) ausgereift und zeigt morphologische und funktionelle Erhaltung mit Säugetieren Magen-Darm-Trakt, wie erhaltene transcriptional Regelung in intestinalen Epithelzellen 2. dadurch Zebrafisch ein hervorragendes Modell für intestinale mikrobielle Besiedlung und Pathogenese. Eine Vielzahl von magensaftresistenten Mikroben wurde im Zebrafisch-Modell, einschließlich Enterohemorrhagic Escherichia coli3, Vibrio Cholerae4,5, Salmonella Enterica6, untersucht die Zebrafisch Mikrobiota7,8, und die Rolle der Probiotika intestinale Immunität9. Ein Vorteil des Zebrafisch-Modells ist, dass es von vielen Mikroben besiedelt ist, ohne Unterbrechung der endogenen Mikrobiota, wodurch die Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens im Rahmen des gemischten mikrobiellen Populationen3, 6., die meisten Zebrafisch-Modelle von Gastro-intestinale Kolonisation und Krankheit setzen derzeit auf die Verwaltung von Mikroben durch Bad eintauchen, wo Zebrafisch sind in einer Bakteriensuspension für eine gewisse Zeit10inkubiert. Aber dies macht es schwierig zu bestimmen, die genaue Dosis von Bakterien verabreicht, und führt zu begrenzte Besiedlung mit einige Mikroben, besonders mit nicht-pathogenen Bakterien. Alternativ ist eine Bakteriensuspension verabreicht, um über orale Magensonde11Fische, aber dies ist technisch anspruchsvoll und beschränkt sich auf ältere Larven und adulten Fische.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von einzelligen Protozoen Paramecium Caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Lieferung von Mikroben mit dem Magen-Darm-Trakt von Zebrafischlarven. Pantoffeltierchen sind einfach und billig zu pflegen und sind in der Lage der Fütterung auf eine Vielzahl von Mikroben, einschließlich Algen, Pilze und Bakterien, die sie durch eine ciliated mündliche Nut12,13,14verinnerlichen. Einmal verinnerlicht, Bakterien sind in Vakuolen, statt, werden die schließlich ansäuern und Inhalte über einen Zeitraum von mehreren Stunden15abgebaut. Larval Zebrafisch erfassen Pantoffeltierchen als natürliche Beute bald nach dem Schlupf ca. 3 – 4 Dpf je nach Temperatur16, und nehmen Sie sie mit hohem Wirkungsgrad. Beutefang dauert auf Durchschnitt 1,2 s von der Erkennung,17zu erfassen, und erfasste Pantoffeltierchen in der Zebrafisch Foregut schnell verdaut werden, so dass verinnerlichte lebensfähige Bakterien in den Darm-Trakt3freigesetzt werden. Infolgedessen können Pantoffeltierchen als eine schnelle und einfache Methode verwendet werden, um eine hohe und gleichbleibende Dosis von Bakterien in den Magen-Darm-Trakt Zebrafisch zu liefern. Die gelieferten Bakterien können entweder ein fluoreszierendes Protein, wie mCherry zum Ausdruck bringen, wie hier beschrieben umgewandelt werden, bzw. bei genetisch hartnäckigen Bakterien, sie können vorher gebeizt mit einem Fluoreszenzfarbstoff ermöglicht Visualisierung innerhalb der Magen-Darm-Trakt.
Dieses Protokoll beschreibt die lebensmittelbedingten Lieferung von enteropathogenic E. Coli (Enterohemorrhagic E. Coli [EHEC] und anhaftende invasiven E. Coli [AIEC]), und Salmonella Enterica SSP Typhimurium. Pathogenen E. Coli und S. Typhimurium kann sind übertragene über den fäkal-oralen Weg18,19, und erworbene über kontaminierte Lebensmittel wie Fleisch, Gemüse und Milchprodukte. Mit p. Caudatum als Vehikel, besiedeln E. Coli und S. Typhimurium erfolgreich die Zebrafischlarven innerhalb von 30 – 60 min Co Inkubation mit dem Paramecium Fahrzeug. Die erzielten bakterielle Belastung ist robust genug, um die Besiedlung zu visualisieren und Belastung durch Ausplattieren Gewebe Homogenates bestimmen.
Protocol
Zebrafisch-Pflege, Zucht und Experimente, die hier beschrieben sind gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von institutionellen Animal Welfare Committee von der University of Texas Health Science Center, Protokoll genehmigt worden Nummer AWC-16-0127.
1. Wachstum und Erhalt von Pantoffeltierchen
- Erhalten Sie live Pantoffeltierchen Kulturen aus Quellen wie Zebrafisch International Resource Center (ZIRC).
- Aus einer live wachsenden Kultur hinzufügen 1 mL der Pantoffeltierchen Kultur, 1 mL einer E. Coli MG1655 Kultur (optische Dichte OD600 1.0-2.0) Nukleinsäuretablette in 1 x E3 (0,29 g/L NaCl, 13 mg/L KCl, 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0,48 g/L HEPES, pH 7,0, steril), und 8 mL 1 x E3 in einer Gewebekultur Flasche 10 mL. Leicht schwenken und dann speichern bei 22 ° C.
- Um eine Kultur zu pflegen, alle zwei Wochen, passage 1 mL einer Pantoffeltierchen Kultur in einem 10 mL Gewebekultur Kolben mit 9 mL frisches 1 x E3 Medium mit 108 KBE/mL der E. Coli MG1655 1 Nukleinsäuretablette x E3.
2. Bestimmung der bakteriellen Dosis verabreicht, Zebrafisch
-
Bakterielle Halbwertszeit in Paramecium zu bestimmen
Hinweis: Die Halbwertszeit von Bakterien innerhalb von Pantoffeltierchen richtet sich nach Auflage Paramecium, lebensfähige Escherichia Coli erholt, wie unten beschrieben.- Nach einer 2 h Inkubation von Bakterien (OD600 1.0) mit Pantoffeltierchen bei 22 ° C, zu kombinieren, die Pantoffeltierchen und Co Bakterienkultur in ein 50 mL konische Röhrchen, waschen die Pantoffeltierchen mit 1 x E3 und Count die Anzahl der Pantoffeltierchen pro Milliliter (wie unten beschrieben 3.2.7 und 3.2.8).
- Nach dem zählen der Pantoffeltierchen, 50 µL der Pantoffeltierchen und Co Bakterienkultur stündlich (für 6 h nach Exposition) und fügen Sie jede Probe in einer frischen 1,5 mL-Tube.
- Platz 950 µL 1 % nichtionische Tenside (siehe Tabelle der Materialien) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einzelnen 1,5 mL Tuben und Wirbel für 1 min um das Pantoffeltierchen lysieren. Durchführen von 01:10 Verdünnungen von jeder Probe mit sterilen PBS als ein Verdünnungsmittel (d. h. 100 µL in 900 µL).
- Platte 100 µL jeder Verdünnung auf selektive Teller (LB Tet Medium: 1 g/L Tryptone, Hefeextrakt 0,5 g/L, 1 g/L NaCl, 30 µg/mL Tetracyclin) und Inkubation bei 37 ° C 16 h. Am nächsten Tag zählen Sie und notieren Sie die Anzahl der Bakterienkolonien auf dem Teller (Kolonie bildende Einheiten KBE) zählen nur die isolierte und verschiedenen einzelnen Kolonien. Identifizieren Sie einen Teller mit einer Verdünnung, die 30 – 300 KBE gibt.
- Bestimmen die Verdünnung Faktor verwendet. Zum Beispiel, wenn 1 µL die Bakterienkultur mit 99 mL sterile PBS gemischt wird, ist dies eine Verdünnung von 1: 100 (0,01). Diese Zahl wird die Anzahl der KBE in der Verdünnung sein. Führen Sie die Berechnung unten, für jeden Zeitpunkt die KBE in der ursprünglichen Probe zu bestimmen:
- Berechnen und graph die Anzahl der lebensfähigen E.Coli/Paramecium entspricht den Stunden nach Belichtung mit der Pantoffeltierchen-Konzentration in Schritt 3.3.1 berechnet und bestimmen die Halbwertszeit innerhalb der Pantoffeltierchen (Abbildung 1).
- Mit Hilfe der KBE berechnet für jeden Zeitpunkt berechnen und graph die Anzahl der lebensfähigen E. Coli pro Paramecium auf der y-Achse im Vergleich zu den Stunden Post Inkubation auf der x-Achse mit der Pantoffeltierchen-Konzentration in Schritt 3.3.1 berechnet. Bestimmen Sie die Halbwertszeit innerhalb der Pantoffeltierchen.
-
Bestimmen Sie, dass bakterielle Dosierung von bakteriellen Halbwertszeit und Jagd bewerten.
Hinweis: Um die bakterielle Dosierung zu bestimmen, die Halbwertszeit der Bakterien in das Pantoffeltierchen und die Jagd bei Zebrafisch auf Pantoffeltierchen müssen (siehe Punkt 3.4) berücksichtigt werden.- Verwenden Sie die folgende Formel, um bakteriellen Zerfall innerhalb Pantoffeltierchen ermitteln:
(1)
Wo N0 die Ausgangsmenge von Bakterien pro Pantoffeltierchen nach 2 h Inkubation, Nt ist die Restmenge nach der Zeit t, τ ist die Zeit, nach der die Anzahl der lebensfähigen Bakterien halbiert hat, und k ist die konstante Zerfall. - Aus dem Abbau Experiment bestimmen die Verfall Konstante k mit der bakteriellen Halbwertszeit (d. h. die Zeit danach hat sich die Menge an lebensfähigen Bakterien/Paramecium halbiert).
(2)
Für die Bestimmung der Halbwertszeit der Begriff
und
(3)
oder
(4)
Hinweis: Anhand der Abbildung 1, ist die Halbwertszeit von E. Coli im Pantoffeltierchen ca. 2,3 h. Somit ist die Verwendung von Formel (4), die Zerfallsrate, k, für E. Coli :
(5)
- Bestimmen Sie die Zerfallsrate (k) von Half-Life-Experiment, die Dosis von lebensfähigen Bakterien (Nt) aufgegriffen von Zebrafischlarven finden nach Jagd Zeit (t), wo (P) ist die Jagd Rate oder die Anzahl der Pantoffeltierchen gegessen durch einen Fisch pro Stunde:
(6)
oder
(7)
Hinweis: Pro Abbildung 1ist die anfängliche Menge Bakterien pro Pantoffeltierchen (N0) nach einer Inkubationszeit von 2 h (t) 790 KBE. Pro Film 1 und Abbildung 2ist die Jagd (P) 1539. - Anhand dieser Werte zu ersetzen in Gleichung (7), berechnen die bakterielle Dosierung durch eine nach einer Inkubationszeit von 2 h als Zebrafisch verbraucht:
(8)
- Verwenden Sie die folgende Formel, um bakteriellen Zerfall innerhalb Pantoffeltierchen ermitteln:
und
oder
oder
(3) lebensmittelbedingte Infektion der Zebrafisch
- Inkubieren Sie Bakterien mit Pantoffeltierchen.
- Bereiten Sie ein Kokulturen Pantoffeltierchen und E. Coli MG1655 die Nacht vor der Infektion. E3 Media 8 mL, 1 mL einer laufenden Pantoffeltierchen Kultur und 1 mL einer E. Coli MG1655 Kultur zu kombinieren (OD600 = 1,0) Nukleinsäuretablette in 1 x E3 in T25 Gewebe Kulturflaschen. Inkubieren Sie die Flaschen bei Raumtemperatur (RT) über Nacht. Bereiten Sie für jede Behandlung Bedingung zwei Fläschchen von Pantoffeltierchen.
- Bakterienwachstum Medien zu impfen (LB: 1 g/L Tryptone 0,5 g/L Hefeextrakt, 1 g/L NaCl) mit infektiösen Bakterienstamm, durch eine einzelne bakterielle Kolonie von einer Platte abnehmen mithilfe einer sterilen Inokulation Schleife. Die Flüssigkultur bei 37 ° C inkubieren und schütteln bei 110 Umdrehungen pro Minute (u/min) über Nacht verlassen.
Hinweis: Persönlicher Schutzausrüstung (ein Laborkittel und Handschuhen) sollte getragen werden und Biosafety Level 2 Einrichtungen sollten beim Umgang mit infektiöser Erregern verwendet werden. - Am nächsten Tag messen Sie die OD600 der Übernacht-Kultur. Berechnen Sie das Volumen der Kultur verpflichtet, ein OD600 1 Wenn in 11 mL Medien Nukleinsäuretablette zu erreichen.
- Das Volumen der Bakterien aus Schritt 3.1.2 per Zentrifugation bei 6.000 x g für 5 min, ein Volume für jede Flasche von Pantoffeltierchen zu ernten. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in 1 mL der E3 Medien.
- Optional, Pre-Fleck die Bakterien mit einem Fluoreszenzfarbstoff.
- Fügen Sie 1 µL FM 4-64FX bakteriellen Fleck (5 mg/mL Stammlösung). Decken Sie mit Folie zum Schutz vor Immunofluoreszenz und rotierenden über durchgängige bei RT für 15 min inkubieren ab.
- Entfernen Sie überschüssige Farbstoff durch Waschen mit 1 x E3: Pellet-Bakterien durch Zentrifugation bei 6.000 X g für 1,5 min, dann Aufschwemmen Pellet in 1 mL der E3 Medien. Wiederholen Sie Waschschritt zwei Mal.
- Gefärbten Bakterien durch Zentrifugation bei 6.000 X g für 5 min. verwerfen den Überstand zu ernten und Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in 1 mL der E3 Medien.
- Fügen Sie 1 mL der bakteriellen Suspensionen zu jedem der zwei Flaschen frischen Pantoffeltierchen. 2 h bei RT inkubieren.
Hinweis: Arbeiten mit gefärbten Bakterien im Dunkeln für 2 h bei RT inkubieren.
- Waschen Bakterien/Pantoffeltierchen Kokultur.
- Kombinieren Sie den Inhalt der beiden Fläschchen Pantoffeltierchen/Bakterienkultur Co in ein 50 mL konische Röhrchen. Zentrifuge Proben bei 300 X g bei 15 ° C für 10 min. stellen sicher, dass die Zentrifuge vorgekühlte vor diesem Schritt.
- Ca. 10 mL von der E3 überstand mit einer serologischen Pipette zu entfernen und fügen Sie ca. 10 mL frisches 1 x E3 mit dem konischen Rohr.
Hinweis: Während alle waschen Schritte gilt es, sehr schnell sein, wenn den Überstand entfernen wie die Pantoffeltierchen aus Pellets schwimmen beginnen werden. Spin und überstand aus einem Rohr zu entfernen, zu einem Zeitpunkt zu schnell genug Abwicklung bei diesem Schritt zu gewährleisten, und vermeiden Sie den Verlust von Pantoffeltierchen im Überstand. - Spin-Proben durch Zentrifugation bei 300 X g bei 15 ° C für 5 min. ca. 10 mL von der E3 überstand mit einer serologischen Pipette entfernen, und fügen Sie ca. 10 mL frisch 1 x E3 mit dem konischen Rohr. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Zentrifuge Proben bei 300 X g bei 15 ° C für 5 min. entfernt ca. 10 mL der E3 überstand, kümmert sich nicht um die Pellets zu stören.
- Aufschwemmen Sie Pellet in den restlichen 10 mL E3 Media und übertragen Sie 500 µL der Suspension zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Pellet-500 µL Pantoffeltierchen durch Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min um die Anzahl der Pantoffeltierchen.
- 400 µL überstand E3 von 500 µL Probe zu entfernen. Die restlichen 100 µL Pantoffeltierchen 20 µL 36,5 % Formaldehyd-Lösung hinzu und Aufschwemmen Sie sanft und inkubieren Sie für 5 min bei 22 ° C.
Hinweis: Dieser Schritt tötet die Pantoffeltierchen zu zählen. - Tatsächliche Gesamtvolumen mit Hilfe der Pipette und Datensatz zu messen. Verdünnen Sie das Pantoffeltierchen Aufhängung 1:1 V/V mit 0,4 % Trypan blau Lösung.
- Verwenden Sie eine Zelle Zähler oder Hemocytometer, um die Anzahl der Toten Pantoffeltierchen/mL.
Hinweis: Aufgrund der vorherigen Fixierung Schritt die meisten Pantoffeltierchen werden an dieser Stelle tot sein, aber diese Zahl reflektieren die Anzahl der live Pantoffeltierchen für das Co Inkubation Experiment. Die Autoren habe erhebliche Pantoffeltierchen Tod durch bakterielle Co Inkubation nicht gefunden, so dass dies als ein Faktor hier vernachlässigt werden kann.
- Co inkubieren Sie Pantoffeltierchen und Zebrafisch-Larven.
- Berechnen Sie die Konzentration der Pantoffeltierchen:
Hinweis: Diese Berechnung gibt die Konzentration der Pantoffeltierchen in der 50 mL konische Röhre aus Schritt 3.2.5. - Berechnen Sie das Volumen der gewaschenen Pantoffeltierchen bei einer Konzentration von 2 x 105 Pantoffeltierchen/mL in einem Endvolumen von 3 mL E3 erforderlich.
Hinweis: Die Konzentration von Pantoffeltierchen kann basierend auf die gewünschte bakterielle Dosierung eingestellt werden, die Optimierung unterliegt. - Zebrafisch zu betäuben, indem man Tricaine in 100 mM Tris pH 8.0, eine Endkonzentration von 100 mg/L. Übertragung 10 Zebrafisch in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in einem Gesamtvolumen von 3 mL frische E3 mit der entsprechenden Konzentration von Pantoffeltierchen (gerechnet in Schritt 3.3.2). Achten Sie darauf, Larven in eine minimale Menge an Flüssigkeit, um sicherzustellen, sie erholen sich von Anästhesie in der Empfänger gut zu übertragen.
- Inkubation bei 30 ° C für 2 h in einem tagaktive Inkubator unter Tageslicht Bedingungen, um optimale Lichtverhältnisse für die Jagd zu gewährleisten.
- Waschen Sie Zebrafisch mindestens 5 Mal von Fisch in eine neue gut mit 3 mL frische E3 mit 100 mg/L Tricaine jedesmal zu übertragen.
Hinweis: Versuchen Sie nicht, die Tricaine während der Reinigung Schritt weglassen. Übertragung von mobilen Larven ohne Narkose, erhöht das Risiko von Schäden und Stress für das Tier. - Optional, Vorbereiten der Zebrafisch Bildgebung durch das Einbetten von Zebrafisch in 3 mL 1 % Low-Melt Agarose in einer schwarz-von Mauern umgebene 6-Well-Platte: Low-Melt Agarose ist in 1xE3 gebildet und in der Mikrowelle erhitzt. Einmal geschmolzen, fügen Sie Tricaine hinzu, eine Endkonzentration von 160 mg/mL. Stellung Fische unter einem Stereomikroskop mit einer beschnittenen Gel laden Tipp, um sicherzustellen, dass der Kopf auf der linken Seite und das Heck ist ist auf der rechten Seite (Abbildung 3). Warten Sie 5 Minuten für die Agarose einstellen, dann überlagern Sie den eingebetteten Fisch mit 1 x E3 mit 160 mg/mL Tricaine für die Bildgebung.
- Berechnen Sie die Konzentration der Pantoffeltierchen:
- Die Jagd Geschwindigkeit bestimmt.
Hinweis: Kein separates Experiment muss eingerichtet werden, dass die Jagd Rate bestimmen. Vielmehr kann bei Schritt 3.3.4, dies wie im folgenden beschrieben.- Während Schritt 3.3.4 zeigen Sie Jagd Zebrafisch auf ein Stereomikroskop und Capture video-Aufnahmen von den Beutefang an.
- Das Videomaterial der Gäste. Beutefang zeichnet sich durch markante der Zebrafisch in Richtung der Beute. Jeder Schlag als eine Beute Capture Event zählen, obwohl dies nur eine Näherung ist (siehe Diskussion).
- Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Beute erfassen Ereignisse pro Stunde aus mehrere video-Clips, jeweils eine unterschiedliche Zebrafisch-Larve (Abbildung 2).
Representative Results
Paramecium Caudatum Explikation leicht ein breites Spektrum von Bakterien in Lagerung Vakuolen. Die intrazelluläre bakterielle Dichte hängt die Dichte von Bakterien und Pantoffeltierchen in der Kokultur sowie der bakteriellen Spezies verwendet. Im Laufe der Zeit die Vakuolen ansäuern und bakteriellen Abbau erfolgt. Die Rate der Zerstörung hat für alle Stämme verwendet individuell bestimmt werden. Für pathogene E. Coli, ist die bakterielle Anfangsdichte 790 Bakterien /Parameciumund Bakterien werden mit einer Halbwertszeit von etwa 2,3 h (Abbildung 1) abgebaut.
Abbildung 1: Bestimmung der bakteriellen Halbwertszeit im Pantoffeltierchen. (A) folgende 2 h Co Inkubation mit infektiösen E. Coli, p. Caudatum gewaschen und auf Medium ohne Bakterien übertragen. Zu den angegebenen Zeitpunkten Zahlen lebensfähige Escherichia Coli Zellen durch Verdünnung-Beschichtung auf selektive Agar bestimmt waren. Ergebnisse sind Mittel ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM; n = 3). (B) typische Bild von Paramecium tragen Bakterien mit Hellfeld (Bi), fluoreszierenden Bakterien (Bii), verinnerlicht und Kanäle (Biii) zusammengeführt. Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Darüber hinaus der Zebrabärbling Jagd Preis, das heißt, die Rate, mit welcher Zebrafisch verinnerlichen Bakterien beladenen Pantoffeltierchen auf Co Inkubation, wurde untersucht. Larven Zebrafisch beginnen zu jagen und lebende Beute von 5 Dpf20, zu erfassen, obwohl es wurde festgestellt, dass, wenn bei 30 ° C angehoben, Larvalentwicklung beschleunigt wird und Tiere Jagd Verhalten von 4 Dpf zeigen. Jagd ist durch eine charakteristische auffällig Verhalten20 (Abbildung 2A) begleitet, und die Bestimmung der Jagd Rate basiert auf der Annahme, der jeder Schlag zur Internalisierung von einem Paramecium führt, obwohl dies nur angesehen werden kann eine Annäherung (siehe Diskussion). Aufgrund der hierin beschriebenen Beobachtungen der Jagd Zebrafischlarven, ist die Rate der Pantoffeltierchen Aufnahme ca. 1.539 pro h (Abb. 2 b).
Abbildung 2: Ermittlung der Zebrafisch Jagd Preis. (A) Standbilder aus einem Jagd-Video, zeigt ein Zebrafisch Larven (5 Dpf) Jagd auf Pantoffeltierchen mit fluoreszierenden Bakterien. Zeit in [Sekunden]. Pfeil zeigt die Hauptachse der Bewegung während auffällig. (B) Quantifizierung der Jagd-Rate (Pantoffeltierchen Aufnahme pro Stunde), basierend auf n = 10 Videos die vollen 2 h Einwirkzeit übernommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Nach Internalisierung von Pantoffeltierchen verschlechtert sich der Zebrabärbling effizient die Beute in der Foregut, Freisetzung von infektiöse Bakterien in das Verdauungssystem. Wie hierin beschrieben, Pantoffeltierchen Abbau geht schnell, und freie Bakterien im Darm-Trakt innerhalb von 30 Minuten Jagd detektiert werden. Frei von Bakterien dann bewegen aus der Foregut in den mittleren und hinteren Darm, wo sie nachgewiesen sind ca. 1 – 2 h nach Beginn der Jagd (Abbildung 3). Bakteriellen Persistenz im Darm richtet sich nach Art und Dosis aber reicht von mehreren h bis zu mehreren Tagen bei E. Coli und S. Enterica. S. Enterica lokalisiert in erster Linie in den Darm Schleimhäute, mit einigen epithelialen Invasion (Abbildung 3D), führt zur Infiltration von neutrophilen Granulozyten in das Epithel (Abbildung 3).
Abbildung 3: Besiedlung mit Bakterien Zebrafisch. Zebrafisch auf 5 Dpf waren links nicht infizierten (A) oder mit mCherry zum Ausdruck zu bringen (B) E. Coli oder (C) S. Entericakolonisiert. Infektions-Experimente in Wildtyp (A und B) Fisch oder transgenen Linien durchgeführt werden (z. B. die Zeile Tg (MPO::EGFP) ich114 mit dem Ausdruck grüner fluoreszierender Neutrophils in (C) gezeigt. Die rektale Öffnung ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. (D) höhere Vergrößerung des Darm-Abschnitt von ganz-Mount eingebetteten Larven mit Salmonella Enterica Infektion infiziert. (Di) blau = Hoechst Kerne, (Dii) lila Markierung = Phalloidin Kennzeichnung F-Aktin, (Diii) rot = Salmonellen (Div) zusammenführen. Maßstabsleiste = 5 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Movie 1: Video-Aufnahmen von den Beutefang. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.
Discussion
Das grundlegende Protokoll hier beschriebenen auf pathogenen E. Colioptimiert und wurde erfolgreich angepasst für andere Bakterienarten, einschließlich Salmonella Enterica und Vibrio Cholerae. Für einige Arten, die nicht nach Bad eintauchen, einschließlich einige Salmonella Enterica Stämme und einige Anaerobier Zebrafisch Darm besiedeln kann lebensmittelbedingte Infektion wie hier beschrieben verwendet werden, Kolonialisierung erfolgreich zu etablieren. Im Vergleich zu Microgavage, die auch verwendet, um hohe bakterielle Belastungen im Larvenstadium Darmtrakt zu etablieren, lebensmittelbedingte Infektion ist technisch weniger anspruchsvoll und erfordert weniger spezialisierte Geräte. Jedoch sollten kritische Parameter für die bakterielle Arten und Stämme zu verwendenden optimiert werden. Zu diesen Faktoren gehören Bakterien- und Paramecium Dichte für die Bakterien-Paramecium Kokultur Schritt: Wenn bakterielle Zahlen innerhalb von Pantoffeltierchen niedrig sind, könnte dies durch Erhöhung der bakterielle Dichte in der Kokultur Schritt verbessert werden. Einige Bakterienarten beschädigen das Paramecium Host, und dies sollte von Mikroskopie bewertet werden.
Ein weiterer wichtiger Faktor in diesem Protokoll ist Beutefang von Zebrafisch. Die Jagd Rate wie hier beschrieben auf der Annahme basiert, dass jede Beutefang Ergebnisse in der Einnahme von einem Paramecium Streik. Hohe Dichten von Pantoffeltierchen pro Fisch werden im Protokoll zur hohen Jagd Preise sorgen. Jedoch Beutefang ist abhängig von der Dichte der Pantoffeltierchen im System, und in sehr verdünnter Paramecium Kulturen, möglicherweise Jagd Preise so niedrig wie Pantoffeltierchen 13-15 pro Stunde21,22. Eine Einschränkung ist, dass Beute Datenerfassungsraten sind auch stark abhängig von Lichtverhältnissen und in der Dunkelheit, Datenerfassungsraten sind 80 % niedriger als bei Lichtverhältnissen21 und dies sollte beim Einrichten von Experimenten berücksichtigt werden. Wenn Belichtungszeiten um Beute erweitert werden, um die Besiedlung zu optimieren, hat Betrachtung gegeben zu sekundäre Exposition gegenüber Bakterien durch Kot. Unter den Bedingungen beschriebenen – 2 h der Beute Exposition – ist diese Ausstellung zu vernachlässigen, da Darm Passage von Bakterien mehr als 1 h ist und die Konzentration von Bakterien im Fahrzeug viel höher als im Kot ist. Wenn Beute Belichtungszeit deutlich erhöht wird, kann jedoch ein wichtiger Faktor geworden.
Angemessene Kontrollen sollten in diesem Protokoll einschließlich der Besiedlung der Zebrafisch nach Fütterung mit Pantoffeltierchen, enthält nicht-pathogenen E. Coli enthalten MG1655. Wenn mehrere Bakterienstämme für ihre Fähigkeit, den Zebrafisch-Host zu kolonisieren verglichen werden, ist es wichtig zu prüfen, ob ihre Halbwertszeit im Pantoffeltierchen vergleichbar ist. Bakterielle Mutationen, Kompromisse bei der Zellwand Integrität oder Acid sensing, einschließlich können bakterielle Stabilität innerhalb Pantoffeltierchen beeinträchtigen. In solchen Fällen hat die Zebrafisch Fütterung entfallen die Unterschiede in der Dosierung angepasst werden.
Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um bakterielle Besiedlung und seine Folgen, namentlich durch bildgebende bakteriellen Besiedelung der Zebrafisch, wie oben beschrieben, sowie die Bestimmung KBE pro Zebrafisch von Gewebe Homogenat3, zu untersuchen oder Infektion-assoziierten Morbidität und Mortalität untersucht. Im Idealfall sollte für bakterielle Visualisierung Bakterienstämme, die mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine wie mCherry oder rot fluoreszierenden Proteins (RFP) verwendet werden. Dies ermöglicht die Visualisierung der wachsenden Bakterienpopulationen. Wenn der Bakterienstamm nicht genetisch gefügig ist oder die Verwendung von fluoreszierenden Protein-Expression ist aus anderen Gründen ausgeschlossen, können Bakterien mit einem fluoreszierenden Farbstoff, wie FM 4-64FX, vor der Zusammenarbeit mit Pantoffeltierchen Kultur gefärbt. Bei dem beschriebenen Protokoll hier Kokultur mit Pantoffeltierchen verringert nicht die Helligkeit des Farbstoffs und gefärbte Bakterien sind deutlich sichtbar im Zebrafisch Darm. Der Farbstoff wird jedoch im Laufe der Zeit verdünnt werden, bedeutende bakterielle Vermehrung innerhalb des Zebrafisch-Hosts auftreten sollte. In beiden Fällen sind rot fluoreszierenden Bakterien über grün-fluoreszierende Bakterien, vorzuziehen, da Gewebe Autofluoreszenz im grünen als im roten Kanal höher sein kann.
Es hat sich herausgestellt, dass dieses Protokoll für angepasst werden kann aerobe und mikroaerophil Bakterienarten. Es sind möglicherweise Anpassung für die Fütterung von Sporen und Pilzarten, obwohl dies noch zu experimentell getestet werden.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten Mitglieder des Arbeitskreises Krachler für kritisches Lesen und Kommentare auf das Manuskript zu danken. Diese Arbeit wurde von einem UT-Systeme STAR-Award, die BBSRC und NIH (R01AI132354) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
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