Summary
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın olarak kullanılan omurgalı hayvan için bir model mikrobiyal kolonizasyon ve Patogenez hale gelmektedir. Bu iletişim kuralı protozoon Terliksi Hayvan caudatum gıda kaynaklı hastalık içinde zebra balığı larva için bir araç olarak açıklar. P. caudatum kolayca bakteri içselleştirmesi ve doğal preying davranış ile larva zebra balığı tarafından alınan.
Abstract
Onların şeffaflık, genetik tractability ve bakım kolaylığı nedeniyle bulaşıcı hastalıklar için yaygın olarak kullanılan bir omurgalı model zebra balığı (Danio rerio) haline geldi. Larva zebra balığı doğal olarak tek hücreli protozoon Terliksi Hayvan caudatumav. Bu iletişim kuralı P. caudatum gıda kaynaklı hastalık içinde larva zebra balığı için bir araç olarak açıklar. P. caudatum içselleştirmesi çok çeşitli bakteri ve bakteri hücreleri birkaç saat için geçerli kalır. Zebra balığı sonra av P. caudatumüzerinde bakteriyel yük sindirim Terliksi Hayvan aracın üzerine foregut olarak yayınlandı ve bağırsak bakteri kolonize. Protokol paramecia ile besleyerek paramecia bakım, bakteriyel bozulma ve doz belirlenmesi, hem de zebra balığı bir enfeksiyon bakteri ile yükleme ayrıntılı bir açıklamasını içerir. Gıda kaynaklı hastalık bu yöntemi kullanmanın avantajı bu yakından insan hastalığında gözlenen enfeksiyon mod taklit eder, daha sağlam kolonizasyon daldırma protokollere göre yol açar ve patojenler geniş bir çalışma sağlar olmasıdır. Gıda kaynaklı hastalık zebra balığı modeli içinde bakteri gen ekspresyonu ana bilgisayar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve bakteri yükü, yerelleştirme, yayma ve morbidite gibi Antibakterial işaretlerinden içinde araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Zebra balığı paylaşım morfolojik ve fonksiyonel olarak korunmuş memeliler, granülositik soy (örneğin, nötrofiller), monosit/makrofaj-benzeri hücreler, Toll benzeri reseptörler, pro-inflamatuar sitokinlerin ve antimikrobiyal peptidler1 gibi özelliklerle . Bağırsak içinde zebra balığı tam 6 gün sonrası döllenme (dpf) gelişmiş ve transkripsiyon Yönetmelikte korunmuş: Bağırsak epitel hücreleri gibi memeli gastrointestinal sistem morfolojik ve fonksiyonel tasarrufuyla gösterir 2. Bu bağırsak mikrobiyal kolonizasyon ve Escherichia türleri için mükemmel bir model zebra balığı yapar. Enterik mikroplar çeşitli dahil olmak üzere enterohemorrhagic Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, zebra balığı modelinde incelenmiştir zebra balığı microbiota7,8ve Probiyotikler bağırsak dokunulmazlık9rolü. Bu mikrobiyal davranış incelenmesi karışık mikrobiyal nüfus3, bağlamında sağlar endojen microbiota aksatmadan birçok mikroplar tarafından kolonize zebra balığı modeli ayrı bir avantaj olduğunu 6. Şu anda, gastrointestinal kolonizasyon ve hastalık çoğu zebra balığı modelleri banyo daldırma, nerede zebra balığı inkübe saat10belirli bir miktarda bakteriyel bir süspansiyon tarafından mikroplar yönetim üzerinde güveniyor. Ancak, bu bakteri yönetilen tam doz belirlemek zordur ve özellikle sigara patojen bakteriler ile bazı mikroplar ile sınırlı kolonizasyon yol açar. Alternatif olarak, bakteriyel bir süspansiyon via oral gavaj11balık için yönetilen, ama teknik olarak zor ve büyük larva ve yetişkin balık sınırlı bu.
Bu iletişim kuralı tek hücreli protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gastrointestinal sistem için mikroplar besin kaynaklı teslim için bir araç olarak açıklar. Paramecia korumak ucuz ve kolay ve mikroplar, algler, mantar ve bakteriler, onlar bir siliyer sözlü groove12,13,14içselleştirmesi dahil olmak üzere çok çeşitli beslenirler yeteneğine sahiptirler. İçselleştirilmiş, bakteri içinde boşluklar, tutulur bir kez hangi sonunda acidify ve içindekiler bozulmuş bir zaman dilimi içinde birkaç saat15. Larva zebra balığı paramecia doğal av olarak yakında tarama sonra yaklaşık 3-4 dpf sıcaklık16tarihinde bağlı olarak yakalamak ve onları ile yüksek verim alır. 17yakalamak için av yakalama işlemi ortalama 1.2 s algılama dan alır ve içselleştirilmiş canlı bakteri bağırsak3yayımlanan öyle ki yakalanan paramecia zebra balığı foregut hızlı sindirilir. Sonuç olarak, paramecia hızlı ve kolay bir yöntem bakteri yüksek ve tutarlı bir doz zebra balığı gastrointestinal sistem teslim etmek için kullanılabilir. Teslim edilen bakteriler de burada açıklandığı gibi mCherry floresan bir protein ifade dönüştürülebilir veya genetik olarak dirençli bakteri olması durumunda ön görselleştirme içinde izin vermek için bir floresan boya lekeli olabilir gastrointestinal sistem.
Bu iletişim kuralı enteropathogenic E. coli gıda kaynaklı teslimini açıklar (enterohemorrhagic E. coli [EHEC] ve yapışık invaziv E. coli [AIEC]) ve Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Patojenik E. coli ve S. typhimurium iletilen yolu ile fekal-oral yol18,19ve kontamine alınan yolu ile gıda, et, sebze ve süt gibi olabilir. P. caudatum bir araç olarak kullanarak, E. coli ve S. typhimurium , amip araç ile ortak kuluçka 30-60 dakika içinde zebra balığı larva başarıyla kolonize. Elde bakteriyel kolonizasyon görselleştirmek ve doku homogenates kaplama tarafından yükünü belirlemek için sağlam yüktür.
Protocol
Zebra balığı bakımı, üreme ve burada açıklanan deneyler uygun olarak bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu vardır ve kurumsal hayvan refahı Komitesi tarafından Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi, protokol onaylandı AWC-16-0127 numara.
1. büyüme ve Paramecia bakımından
- Canlı paramecia kültürler zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi (ZIRC) gibi kaynaklardan elde edilir.
- Bir canlı büyüyen kültür, paramecia kültür, E. coli MG1655 Kültür (optik yoğunluk OD600 1.0-2.0) 1 1'de resuspended mL 1 mL ekleyin x E3 (0,29 g/M NaCl, 13 mg/L KCl, 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0,48 g/L HEPES, pH 7,0, steril) ve 8 mL 1 x E3 10 mL doku kültürü şişesi içine. Hafifçe girdap ve 22 ° C'de depolayın
- Bir kültür korumak için her iki haftada bir, bir 10 mL doku kültürü şişesi ile 9 mL taze 1 x E3 orta 10 içeren içine 1 mL paramecia kültür geçiş8 CFU/mL 1'resuspended E. coli MG1655 x E3.
2. bakteriyel doz zebra balığı için yönetilen tespiti
-
Terliksi Hayvan içinde bakteri half-life belirlemek
Not: Aşağıda açıklandığı gibi half-life bakteri paramecia içinde uygun E. coli amip, kurtarılan kaplama tarafından belirlenir.- Paramecia ve bakteriyel ortak kültürün bir 50 mL konik tüp içine 2 h kuluçka bakteri (OD600 1.0) paramecia 22 ° c ile birleştirmek, paramecia 1 x E3 ve sayısı ile yıkama paramecia (aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi mililitre başına sayısı 3.2.7 ve 3.2.8).
- Paramecia sayılması sonra paramecia ve bakteriyel ortak kültür her saat (için 6 h sonrası pozlama) 50 µL kaldırın ve her örnek bir taze 1,5 mL tüp içine ekleyin.
- Yer 950 µL % 1 Nonyonik yüzey aktif, ( Tablo malzemelerigörmek) fosfat içinde serum fizyolojik (PBS) çözüm her 1,5 mL tüpler ve 1dk paramecia koşullar için girdap içine arabelleğe alınmış. 1:10 gerçekleştirmek bir eritici (yani, 900 µL içinde 100 µL) olarak steril PBS kullanarak her örneğinin dilutions.
- Her seyreltme seçici plakalar üzerine 100 µL plaka (LB tet Orta: 1 g/L tryptone, 30 µg/mL tetrasiklin 0.5 g/L maya ekstresi, 1 g/M NaCl) ve 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya. Ertesi gün, say ve sadece izole ve farklı bireysel kolonileri sayarak bakteri kolonileri tabak (koloni oluşturan birimler, CFUs) kaydedin. Bir tabak 30-300 CFU verir bir seyreltme ile tanımlayın.
- Seyreltme belirlemek kullanılan çarpan. Bakteri kültürü 1 µL 99 mL steril PBS ile karıştırılır, örneğin, 1: 100 (0.01) seyreltme bu. Bu numara CFU sayısını seyreltme olacaktır. Aşağıda, hesaplama orijinal örnekteki CFU belirlemek için her zaman noktasının gerçekleştirin:
- Hesaplamak ve uygun E. colisayısı grafik/saat için karşılık gelen amip 3.3.1. adımda hesaplanan paramecia konsantrasyon kullanarak çekim sonrası ve yarı ömrü içinde paramecia (Şekil 1) belirlemek.
- CFU kullanarak hesaplamak numarası her zaman noktası için hesaplanan ve 3.3.1. adımda hesaplanan paramecia konsantrasyon kullanarak uygun E. coli karşı saat sonrası kuluçka x ekseni, y ekseni üzerinde Terliksi Hayvan başına sayısı grafiğini çizer. Half-life paramecia içinde belirlemek.
-
Bakteriyel bakteriyel half-life dozaj ve yırtıcı oranı belirler.
Not: Bakteriyel dozu belirlemek için paramecia içindeki bakterileri yarılanma ömrü ve zebra balığı paramecia üzerinde preying oranı (bkz. Adım 3.4) var dikkate alınması.- Paramecia içinde bakteri çürüme belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
(1)
N0 2 h kuluçka sonra bakteri paramecia başına ilk miktarı nerede, Nt zaman t sonra kalan miktar ise, τ sonra canlı bakteri sayısını yarıya zaman ise k çürümesine sabit. - Bakteriyel half-life kullanarak çürümesine sabit k bozulması deneyden belirlemek (yani, saat sonra canlı bakteri/Terliksi Hayvan miktarını yarıya).
(2)
Half-life, tespiti için dönem
ve
(3)
veya
(4)
Not: Şekil 1' de, E. coli half-life paramecia içinde yaklaşık 2.3 h uyarlanmıştır. Böylece, formülü (4), çürüme oranı, k, E. coli için kullanmaktır:
(5)
- Canlı bakteri (Nt) zebra balığı larva tarafından alınan doz bulmak için half-life deneme çürüme hızı (k) belirlemek preying oranı kadar veya saatte bir balık tarafından yemiş paramecia nerede (P) sonra preying zaman (t):
(6)
veya
(7)
Not: Şekil 1başına, 790 CFU bakteri paramecia (N0) 2 h kuluçka (t) sonra başına başlangıç miktarıdır. Film 1 ve Şekil 2preying (P) 1539 oranıdır. - Bu değerleri kullanarak denklemi içine (7), ikame olarak 2 h kuluçka takip bir zebra balığı tarafından tüketilen bakteriyel dozaj hesaplamak için:
(8)
- Paramecia içinde bakteri çürüme belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
ve
veya
veya
3. gıda kaynaklı enfeksiyon zebra balığı
- Parameciaile bakteri kuluçkaya.
- Paramecia ve E. coli MG1655 ortak bir kültür gecesi öncesinde enfeksiyon hazırlayın. E3 medya 8 mL, 1 mL bir devam eden paramecia kültür ve bir E. coli MG1655 kültürünün 1 mL (OD600 = 1.0) 1'resuspended x E3 T25 doku kültürü şişeler içinde. Şişeler, oda sıcaklığında (RT) gecede kuluçkaya. Her tedavi koşul için paramecia iki şişe hazırlayın.
- Bakteriyel büyüme medya aşılamak (LB: 1 g/L tryptone, 0.5 g/L maya ekstresi, 1 g/M NaCl) bakteri enfeksiyöz gerilme ile bir tabak bireysel bir bakteriyel koloni seçerek bir steril aşılama döngü kullanarak. 37 ° C'de sıvı kültür kuluçkaya ve dakikada (devir/dakika) gecede 110 rotasyonlar, sallayarak bırakın.
Not: Kişisel koruyucu donanım (bir laboratuvar kat ve eldiven) giyilmelidir ve biyogüvenlik seviye 2 imkanları enfeksiyöz ajanlar işlerken kullanılmalıdır. - Ertesi gün, gecede kültür OD600 ölçmek. Ne zaman medya 11 mL resuspended 1 OD600 ulaşmak için gereken kültür hacmi hesaplamak.
- Paramecia adımında 3.1.2 Santrifüjü 6.000 x g 5 min için her şişeyi için bir birim, üzerinden bakterilerden hacmi hasat. Süpernatant atın ve bakteriyel Pelet E3 medya 1 mL resuspend.
- İsteğe bağlı olarak, önceden bakteri floresan bir boya ile leke.
- FM 4-64FX bakteriyel leke (5 mg/mL stok çözelti) 1 µL ekleyin. Tüp photobleaching korumak ve dönen bitti sıra RT, 15dk için kuluçkaya folyo ile kapak.
- 1 ile yıkayarak aşırı boya kaldırmak x E3: cips bakteri ile Santrifüjü 6.000 x g 1.5 dakika, sonra Pelet E3 medya 1 mL resuspend. Yıkama adımları iki kez yineleyin.
- Lekeli bakteri ile Santrifüjü 6.000 x g 5 dk. atmak için de süpernatant hasat ve bakteriyel Pelet E3 medya 1 mL resuspend.
- Bakteriyel süspansiyonlar 1 mL her taze paramecia iki şişe ekleyin. RT 2s için kuluçkaya.
Not: Eğer lekeli bakteri ile çalışma, 2 h, RT karanlıkta kuluçkaya.
- Yıkama bakteri/paramecia ortak kültür.
- Her iki şişe paramecia/bakteri ortak kültür 50 mL konik tüp içine içeriklerini birleştirebilirler. 300 x g 10 dakika süreyle 15 ° C'de, santrifüj örnekleri santrifüje önce bu adımı önceden soğutulmuş olduğundan emin olun.
- Yaklaşık 10 mL serolojik pipet kullanarak E3 süpernatant kaldırmak ve yaklaşık 10 mL taze 1 eklemek için konik tüp x E3.
Not: Tüm yıkama adımları sırasında paramecia Pelet dışarı yüzmeyi başlayacak gibi süpernatant, kaldırırken çok hızlı olmak esastır. Spin ve bu aşamada yeterince hızlı işleme emin olmak için bir zamandaki bir tüp süpernatant kaldırın ve paramecia içinde süpernatant kaybı olmaması. - 5 dk. kaldırmak için yaklaşık 10 mL serolojik pipet kullanarak E3 süpernatant örnekleri üzerinden Santrifüjü 300 x g 15 ° c de spin ve yaklaşık 10 mL taze 1 eklemek için konik tüp x E3. Bu iki kez tekrarlayın.
- Santrifüj örnekleri, 300 x g 5 dakika süreyle 15 ° C'de yaklaşık 10 mL Pelet bozmaya değil dikkat çekici E3 süpernatant, kaldırın.
- Pelet E3 medya kalan 10 mL resuspend ve süspansiyon 500 µL yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Paramecia 500 µL 300 x g paramecia saymak 5 min için de centrifuging tarafından cips.
- E3 süpernatant 400 µL 500 µL örneğinden kaldırmak. Paramecia kalan 100 µL için 20 µL %36,5 formaldehit çözüm ekleyin ve hafifçe resuspend ve 22 ° C'de 5 min için kuluçkaya
Not: Bu adımı sayım için izin vermek için paramecia öldürür. - Pipet ve kaydı kullanarak gerçek toplam hacim ölçmek. Paramecia süspansiyon 1:1 v/v %0,4 trypan mavi çözüm ile sulandırmak.
- Bir hücre sayaç veya hemasitometre ölü paramecia/mL saymak için kullanın.
Not: Önceki fiksasyon adım, çoğu paramecia bu noktada ölmüş olacak, ancak bu numarasını yansıtacak yardımcı kuluçka deneme için canlı paramecia sayısı. Yazarlar önemli paramecia ölüm nedeniyle bakteri Co kuluçka, bulamadı, bu yüzden bu bir faktör olarak göz ardı.
- Paramecia ve zebra balığı larva Co kuluçkaya.
- Paramecia konsantrasyonu hesaplayın:
Not: Bu hesaplama paramecia konsantrasyonu 50 mL konik Tüp 3.2.5 adımından verir. - 2 x 105 paramecia/mL E3 3 mL nihai bir birimdeki bir konsantrasyon için gerekli yıkanmış paramecia hacmi hesaplamak.
Not: Paramecia konsantrasyonu optimizasyonu tabi istenen bakteriyel dozajı göre ayarlanabilir. - 6-şey plaka 3 mL taze E3 (adımda hesaplanan paramecia uygun konsantrasyonu içeren toplam hacmi içine her kuyuya 100 mM Tris pH değeri 100 mg/l Transfer 10 zebra balığı içinde 8.0 son konsantrasyonu tricaine ekleyerek zebra balığı anestezi 3.3.2). sıvı onlar yeniden elde etmek--dan alıcı iyi anestezi emin olmak için en az bir miktarda larva transfer etmek için emin olun.
- 30 ° c 2 h yırtıcı için en uygun yıldırımdan koşullar emin olmak için gün-ışık koşulları altında diurnal kuluçka için kuluçkaya.
- Zebra balığı balık bir yeni de içeren 3 100 mg/L tricaine her zaman içeren mL taze E3 transfer ederek en az 5 kez yıkayın.
Not: Tricaine çamaşır adımı sırasında atlamak çalışmayın. Anestezi olmadan telefon larva transfer hayvan için sıkıntı ve zarar riskini artırır. - İsteğe bağlı olarak, zebra balığı 3 mL % 1 düşük-melt özel bir siyah duvarlı 6-şey plaka zebra balığı gömerek görüntüleme için hazırlamak: düşük-melt özel 1xE3 içinde oluşan ve bir mikrodalga fırında ısıtılan. Erimiş bir kez, tricaine 160 mg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Sağda (Şekil 3) pozisyon balıktır uç, baş sola ve kuyruk üzerinde olduğundan emin yükleme kırpılmış bir jel kullanarak bir stereomicroscope altında. Özel ayarlamak 5 dakika bekleyin, sonra 1 x E3 içeren 160 mg/mL tricaine görüntüleme için katıştırılmış balıkla yerleşimi.
- Paramecia konsantrasyonu hesaplayın:
- Preying oranı belirler.
Not: Hiçbir ayrı deney preying hızını belirlemek için ayarlanmış olması gerekir. Bunun yerine, bu adımı sırasında 3.3.4, aşağıda açıklandığı gibi yapılabilir.- 3.3.4 adımı sırasında preying zebra balığı bir stereomicroscope ve yakalama video görüntüleri av yakalama üzerinde görüntüleyin.
- Video görüntüleri puan. Av yakalama zebra balığı av doğru çarpıcı tarafından karakterizedir. Bu sadece bir yaklaşım olmakla birlikte her grev bir av yakalama olay saymak ( konuyabakın).
- Av yakalama olay üzerinden birden çok video klipleri, saatte ortalama sayısı her bir farklı zebra balığı larva (Şekil 2) temsil eden hesaplayın.
Representative Results
Terliksi Hayvan caudatum kolayca depolama boşluklar çok çeşitli bakteri içselleştirmesi. Hücre içi bakteri yoğunluğu bakteri ve paramecia ortak kültür, hem de kullanılan bakteriyel türler yoğunlukları bağlıdır. Zaman içinde boşluklara acidify ve bakteriyel bozulma ensues. Kullanılan tüm suşları için tek tek tespit edilecek bozulma oranına sahip. Patojenik E. coliiçin ilk bakteri yoğunluğu 790 bakteri olduğunu /Terliksi Hayvanve bakteri yaklaşık 2.3 h (Şekil 1) bir yarı ömrü ile bozulmuş.
Şekil 1: paramecia bakteriyel half-life belirlenmesi. (A) aşağıdaki 2 h, Co kuluçka bulaşıcı E. coli, P. caudatum ile yıkanmış ve orta bakteri olmadan transfer oldu. Belirtilen süre noktalarda numaraları uygun E. coli hücreleri üzerine seçici agar seyreltme kaplama tarafından belirlendi. -Den sonuçlanmak are anlamına gelir ortalama ± standart hatası (SEM; n = 3). (B) tipik görüntü Terliksi Hayvan taşıyan parlak alan (bı), floresan bakteri (bıı) ile bakteri içselleştirilmiş ve kanalları (Bill) birleştirilir. Ölçek çubuğu 20 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ayrıca, oranı, yırtıcı zebra balığı, zebra balığı hangi oranda bakteri dolu paramecia Co kuluçka üzerine içselleştirmesi, incelenmiştir. Larva zebra balığı başlatmak avlayıp canlı av--dan 5 dpf20, yakalamak her ne kadar 30 ° C'de kaldırdı, larva geliştirme hızlandırılır ve hayvanlar preying 4 dpf davranışından görüntülemek bulundu. Davranış20 (Şekil 2A) çarpıcı bir özelliklerine göre yırtıcı eşlik etti ve bu sadece kabul edilebilir, ancak preying oranı tayini her grev bir amip, içselleştirilmesi için yol varsayımı temel alır bir yaklaşım ( konuyabakın). Zebra balığı larva yırtıcı, burada açıklanan gözlem dayalı, paramecia alımı yaklaşık 1,539 h (Şekil 2B) başına oranıdır.
Şekil 2: zebra balığı preying oranı tayini. (A)bir zebra balığı paramecia floresan bakteri taşıyan Yırtıcı larva (5 dpf) gösterilen bir preying Videodan hareketsiz görüntüler. Süre [saniye]. Ok çarpıcı sırasında ana ekseni hareketinin gösterir. Preying hızı (saatte paramecia alımı), (B) miktar dayalı n 10 videoları tam 2 h pozlama zaman içinde alınan =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Paramecia içselleştirilmesi, zebra balığı verimli bulaşıcı bakteri sindirim sistemi serbest foregut, avını alçaltır. Burada açıklandığı gibi paramecia bozulması hızlı bir şekilde devam eder ve ücretsiz bakterilerin bağırsak içinde yırtıcı 30 dakika içinde tespit edilebilir. Ücretsiz bakteri sonra foregut orta ve posterior bağırsak için nerede algılanır taşımak yaklaşık 1-2 h sonra preying (Şekil 3) başında. Bağırsak bakteri sebat bağlı türler ve doz ama aralıkları durumunda E. coli ve S. entericabirkaç gün için birkaç saat. Nötrofil infiltrasyonu epitel (Şekil 3 c) önde gelen bazı epitel işgali (şekil 3D) ile bağırsak mucosae başta S. enterica yerelleştirir.
Şekil 3: zebra balığı bakteri ile kolonizasyon. 5 dpf, zebra balığı bulaşmamış (A) yaptı veya (B) E. coli ya da (C) S. entericaifade mCherry ile kolonize. Enfeksiyon deneyler vahşi türü (A ve B) balık veya transgenik satırları gerçekleştirilen (örneğin, satır Tg (MPO::EGFP) ben (C) gösterilen yeşil flüoresan nötrofil ifade114 . Rektal açılış bir okla işaretlenmiştir. (D) bütün Dağı katıştırılmış larva Salmonella enterica enfeksiyon ile enfekte bağırsak bölümünden daha yüksek büyütme. (Di) Mavi çekirdeği, (dıı) mor işaretleme Höchst = F-aktin, (DIII) kırmızı işaretleme phalloidin = Salmonella, (Div) birleştirme =. Ölçek çubuğu 5 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: av yakalama Video görüntülerini. Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Burada açıklanan temel Protokolü patojenik E. coliiçin optimize edilmiş ve Salmonella enterica ve Vibrio choleraedahil olmak üzere diğer bakteriyel türler için başarılı bir şekilde adapte edilmiş. Banyo daldırma, bazı Salmonella enterica suşları ve bazı anaerop dahil olmak üzere aşağıdaki zebra balığı gut kolonize değil bazı türler için gıda kaynaklı hastalık burada açıklandığı şekilde başarıyla kolonizasyon kurmak için kullanılabilir. Ayrıca yüksek bakteri yükünü larva bağırsak kurmak için kullanılan microgavage için karşılaştırıldığında gıda kaynaklı hastalık zorlu Teknik olarak daha az ve daha az özel ekipman gerektirir. Ancak, kritik parametreleri bakteri ve kullanılmak üzere suşları için optimize edilmelidir. Bakteri Terliksi Hayvan ortak kültür adım için bakteri ve Terliksi Hayvan yoğunluğu gibi faktörler: bakteriyel numaraları paramecia içinde düşük olması halinde, bu ortak kültür adımda bakteri yoğunluğu artırarak geliştirilebilir. Bazı bakteri türleri amip ana bilgisayara zarar verebilir ve bu mikroskobu tarafından değerlendirildi.
Bu iletişim kuralı bir başka önemli faktör av yakalama tarafından zebra balığı var. Preying oranı burada açıklandığı gibi her av yakalama bir Terliksi Hayvan yenmesi içinde sonuçları strike varsayım temel alır. Paramecia balık başına yüksek yoğunlukları protokolünde yüksek preying oranları sağlamak için kullanılır. Ancak, av yakalama sistemde paramecia yoğunluğu üzerinde bağlıdır ve çok seyreltik Terliksi Hayvan kültürlerde preying gore 13-15 paramecia başına saat21,22olarak düşük olabilir. Bir kısıtlamadır av yakalama oranları da kuvvetle koşullar aydınlatma ve karanlıkta bağlıdır, yakalama oranları % 80 ışık koşullarında21 ve bu hesaba deneyler ayarlarken alınması gereken daha düşük vardır. Av için pozlama süreleri kolonizasyon optimize etmek için açılacak varsa, ikincil bakteri dışkı yoluyla maruz için verilecek göz önünde bulundurmaz. -Av maruz kalma 2 h-açıklanan koşullar altında bu poz gut geçiş zaman bakterilerin daha 1 h ve aracın bakteri konsantrasyonu çok dışkısı daha yüksek, ihmal edilebilir düzeydedir. Av çekim hızı önemli ölçüde arttırılırsa, ancak, bu önemli bir faktör olabilir.
Uygun denetimleri içinde sigara patojenik E. coli içeren paramecia ile besleme takip zebra balığı kolonizasyon dahil olmak üzere bu protokolü dahil MG1655. Birden çok bakteri suşları yeteneklerini zebra balığı ana bilgisayar kolonize için karşılaştırılır, onların half-life paramecia içinde benzer olup olmadığını sınamak önemlidir. Bakteriyel mutasyonlar, hücre duvarı bütünlüğü veya asit algılama, ödün de dahil olmak üzere paramecia içinde bakteri istikrarı tehlikeye atabilir. Bu gibi durumlarda, zebra balığı besleme hesabına dozaj farklılıkları için ayarlanması gerekir.
Burada açıklanan protokolü bakteriyel kolonizasyon ve yukarıda açıklandığı gibi zebra balığı bakteriyel kolonizasyon Imaging yanı sıra doku homogenate3, zebra balığı başına CFU belirlemek de dahil olmak üzere sonuçları, araştırmak için kullanılabilir veya enfeksiyon ilişkili morbidite ve mortalite araştırıyor. İdeal olarak, bakteriyel görselleştirme için bakteri suşları mCherry gibi floresan proteinler veya kırmızı floresan protein (RFP) ifade kullanılmalıdır. Bu bakteriyel nüfus büyüyen görselleştirme sağlar. Bakteriyel suşu genetik olarak uysal değil veya floresan protein ifade kullanımını başka nedenlerle durdurulmasını emretti, bakteri gibi FM 4-64FX, floresan bir boya ile rahip paramecia ile ortak kültür lekeli. Burada açıklanan protokolü kullanılırken, paramecia ile ortak kültür boya parlaklık azalmaz ve lekeli bakteri zebra balığı bağırsaklarda açıkça görülebilir. Ancak, boya önemli bakteri proliferasyonu zebra balığı ana bilgisayar içinde gerçekleşmesi gereken zaman içinde seyreltilmiş. Doku autofluorescence yeşil kırmızı kanal daha yüksek olabilir bu yana her iki durumda da, kırmızı-floresan bakteri yeşil-floresan bakteriler tercih edilir.
Bu iletişim kuralı için adapte edilebilir bulunmuştur aerobik ve da mikroaerofilik bakteriyel türler. Her ne kadar bu deneysel test edilecek kalır Sporlar ve mantar türleri, besleme için uyum sağlamak mümkün olabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Eleştirel okuma ve yorum için Krachler grubunun üyeleri el yazması teşekkür etmek istiyorum. Bu eser bir UT sistemleri yıldız ödülü, BBSRC ve NIH (R01AI132354) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
