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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Merkel Cell Polyomavirus Infection et détection

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à infecter primaire fibroblastes dermiques humains avec MCPyV. Le protocole prévoit l’isolement des fibroblastes dermiques, préparation des virions MCPyV, infection par le virus, immunofluorescence souillant et fluorescence hybridation in situ. Ce protocole peut être étendu pour la caractérisation des interactions hôte-MCPyV et découvrir d’autres types de cellules susceptible d’être infectés par MCPyV.

Abstract

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection peut mener à carcinome de cellules de Merkel (MCC), une forme très agressive de cancer de la peau. Des études mécanistes pour enquêter pleinement sur MCPyV la biologie moléculaire et mécanismes oncogènes ont été entravés par un manque de modèles de culture de cellules adéquates. Nous décrivons ici une série de protocoles d’effectuer et de détecter l’infection des cellules de peau humaine primaire MCPyV. Les protocoles décrivent l’isolement des fibroblastes dermiques humains, préparation des recombinants MCPyV virions et détection de l’infection par le virus par immunofluorescence (IF) et la réaction en chaîne in situe hybridation de l’ADN (HCR), qui est un très sensible fluorescence en approche de situ hybridation (poisson). Les protocoles dans les présentes peuvent être adaptés par les chercheurs intéressés à identifier d’autres types de cellules ou lignées de cellules qui prennent en charge de l’infection MCPyV. L’approche décrite de poisson pourrait également être adapté pour détecter de faibles niveaux d’ADN viral présent dans la peau d’humaine infectée.

Introduction

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) est un virus à ADN double brin petit qui a été associé à un cancer de la peau rare mais agressif, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Le taux de mortalité du MCC, environ 33 %, dépasse celle du mélanome3,4. MCPyV possède un génome circulaire de ~ 5 kb1,5 , coupée en deux par une région régulatrice non codantes (RRRNC) en début et fin de codage régions1. Le RRRNC contient l’origine virale de la réplication (Ori) et promoteurs bidirectionnel pour transcription virale6,7. La région début encode les protéines de l’antigène tumoral grand T (LT), petit T (sT), 57kT, alternative LT ORF (ALTO), ainsi qu’une autorégulation miRNA1,8,9,10. La région fin encode les protéines de la capside VP1 et VP211,12,13. LT et sT sont les protéines de MCPyV mieux étudiés et auraient dû être divulgués à l’appui de la réplication de l’ADN virale et tumorigenèse induite par le MCPyV5. L’intégration clonale de MCPyV ADN dans le génome hôte, qui a été observée chez 80 % de CCM, est probablement un facteur causal pour séropositifs au virus de tumeur développement14,15.

L’incidence de la MCC a triplé sur les dernières vingt années16. Infection asymptomatique de MCPyV est également répandue dans la population générale17,18,19. Avec le nombre croissant de diagnostic de la CMC et la forte prévalence de l’infection à MCPyV, il est nécessaire d’améliorer notre compréhension du virus et son potentiel oncogène. Cependant, beaucoup d’aspects de la biologie de la MCPyV et mécanismes oncogènes demeure mal compris20. C’est en grande partie parce que les MCPyV se reproduit mal dans cellulaires établies lignes11,12,21,22,23 et, jusqu'à tout récemment, la peau des cellules capables de supporter MCPyV l’infection n’avait pas été découvert22. Des études mécanistes pour enquêter pleinement sur MCPyV et son interaction avec les cellules hôtes ont été entravés par l’absence de système de culture cellulaire pour propager le virus5.

Nous avons découvert que les fibroblastes dermiques humains primaires (HDFs) isolement d’infection de prépuce humains néonatale soutien robuste MCPyV les deux in vitro et ex vivo24. De cette étude, nous avons créé le premier modèle d’infection de culture cellulaire pour MCPyV24. S’appuyant sur ce système modèle, nous avons montré que l’induction de gènes de matrix métalloprotéinases (MMP) par la voie et autres facteurs de croissance de signalisation WNT/β-caténine stimule l’infection MCPyV. En outre, nous avons constaté que le MEK approuvé par la FDA antagoniste trametinib inhibe efficacement MCPyV infection5,25. De ces études, nous avons aussi établi un ensemble de protocoles pour l’isolement des fibroblastes dermiques humains24,25, préparation des virions de MCPyV11,12, effectuant une infection MCPyV sur fibroblastes dermiques humains 24 , 25 et détecter les protéines MCPyV par IF coloration26. En outre, nous avons adapté l’in situ ADN hybridation réaction en chaîne (HCR) technologie27 pour développer une technique de poissons très sensible (HCR-DNA FISH) pour la détection des MCPyV ADN dans les cellules infectées de la peau humaine. Ces nouvelles méthodes seront utiles pour étudier le cycle infectieux de MCPyV ainsi que la réponse cellulaire à l’infection MCPyV. Les cellules de réservoir hôte naturel qui maintiennent l’infection MCPyV et les cellules qui donnent lieu à des tumeurs MCC demeurent inconnues. Les techniques que nous décrivons dans ce manuscrit pourraient être appliquées afin d’examiner les différents types de cellules humaines d’identifier aussi bien les cellules du réservoir et l’origine des tumeurs MCC. Nos méthodes établies, comme le HCR-ADN poisson, pourraient aussi servir à la détection d’autres virus de tumeur d’ADN et la caractérisation des interactions cellule hôte.

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Protocol

Prépuces néonatales humains proviennent de Penn Skin Disease Research Center. Fibroblastes humains adultes proviennent de peau normale au rebut après la chirurgie. Tous les protocoles ont été approuvés par l’Université de Pennsylvanie Institutional Review Board.

1. isolement des fibroblastes dermiques humains

  1. Utilisez une paire de ciseaux pour couper les tissus gras et sous-cutanée de prépuce néonatal humain et couper l’échantillon de peau en demis ou quarts.
  2. Incuber le tissu dans 5 mL d’a 10 mg/mL II dans du PBS additionné d’antibiotiques-antimycosiques à 4 ° C la nuit.
  3. Dans un récipient stérile de 10 cm, soigneusement séparer l’épiderme les couches dermiques avec une pincette de microdissection.
  4. Transfert du tissu cutané qui en résulte dans un tube conique 15 mL contenant 5 mL de collagénase de 2 mg/mL de type IV dans un milieu sans FBS additionné d’antibiotiques-antimycosiques.
  5. Incuber les échantillons à 37 ° C en 5 % CO2 pendant 4 à 6 h avec agitation périodique suivant jusqu'à ce qu’à quelques agrégats tissulaire macroscopique.
  6. Libérer des cellules individuelles du derme par pipetage vigoureusement et descendre (trituration) dix fois avec une pipette de 10 mL.
  7. Centrifuger à 180 g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  8. Plaque des cellules dissociées dans le milieu DMEM additionné de sérum de veau foetal de 10 %, 1 % des acides aminés non essentiels et 1 % L-glutamine à 37 ° C à 5 % de CO2.

2. recombinant MCPyV préparation de virion

  1. Digest 50 µg de plasmide de pR17b (porteur du génome MCPyV) avec 250 U de BamHI-HF dans un volume de 200 µL (4 h à 37 ° C) pour séparer le génome viral de l’épine dorsale du vecteur (Figure 2).
  2. Ajouter 1200 µL de tampon PB (additionné de 10 µL de 3 M NaAc, pH 5,2) dans l’ADN digéré et purifier sur 2 colonnes miniprep à centrifuger (capacité de l’ADN de 20 µg). Éluer le plasmide digéré pR17b de chaque colonne avec 200 µL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, EDTA 1 mM).
  3. Préparer la réaction de ligature dans un tube à centrifuger 50 mL. Ajouter 400 µL de l’ADN de plasmide purifié de l’étape 2.2, 8,6 mL de tampon de ligase x T4 1.05 et 6 µL de ligase forte concentration T4. Incuber à 16 ° C durant la nuit.
  4. Ajouter 45 mL de tampon PB (additionné de 10 µL de 3 M NaAc, pH 5,2) à la ligature et utiliser une tubulure de vide pour charger à travers 2 colonnes miniprep à centrifuger. Éluer chaque colonne avec 50 µL de tampon TE. S’attendre à un rendement d’environ 30 µg d’ADN.
  5. En fin d’après-midi/soirée, semences 6 x 106 293TT28 cellules dans un 10 cm plat contenant milieu DMEM avec 10 % de sérum de veau foetal, 1 % des acides aminés non essentiels et 1 % L-glutamine sans hygromycine B.
  6. Le lendemain matin, faire en sorte que les cellules sont environ 50 % confluentes. Transfecter avec 66 µL de réactif de transfection (1,1 µL/cm2), 12 µg de MCPyV re-ligaturé isoler l’ADN de R17b de l’étape 2.4, 8,4 µg de ST expression plasmide pMtB et 9,6 µg de LT expression plasmide pADL *29.
  7. Lorsque les cellules transfectées sont presque confluentes, le lendemain, trypsinize les cellules et les transférer sur un plat de 15 cm pour la poursuite de l’expansion.
  8. Éventuellement prendre un petit nombre de cellules 293TT à expansion et effectuer si une coloration pour MCPyV LT (CM2B4) et VP1 (MCV VP1 lapin30) afin de déterminer l’efficacité de transfection. À ce stade, nucléaire signal LT peut-être être visible mais VP1 expression probablement ne sera pas détectable.
  9. Quand le plat 15 cm devient presque anastomosé (habituellement 5-6 jours après la transfection initiale), les cellules de transfert en trois plats de 15 cm. Récolter les cellules de la vaisselle de 15 cm quand ils deviennent presque confluentes et suivent le protocole de récolte des virus ci-dessous.
    Remarque : Effectuez éventuellement contrôle de la qualité si, comme décrit à l’étape 2.8. La plupart des cellules doit être MCPyV LT et VP1 positifs à ce stade.
  10. Pour récolter le virus, trypsinize cellules, tournent à 180 x g pendant 5 min à RT et éliminer le surnageant. Ajouter un volume de granulés cellulaire du SPD-Mg (SPD avec 9,5 mM MgCl2 et 1 x antibiotique-antimycosiques). Ajoutez ensuite le sulfate d’ammonium 25 mM (d’une solution mère de 1 M pH 9) puis 0,5 % X-100 Triton (d’une solution stock de 10 %), 0,1 % Benzonase et 0,1 % d’une DNase ATP-dépendante. Bien mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant la nuit.
  11. Incuber le mélange pendant 15 minutes sur la glace, puis ajouter 0,17 volume de 5 M de NaCl. Mélanger et laisser incuber sur glace pour un autre 15 min. Spin pendant 10 min à 12 000 x g dans une centrifugeuse de 4 ° C. Si le liquide surnageant n’est pas clair, délicatement inverser le tube et répétez l’étape de rotation. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  12. Resuspendre le culot à l’aide d’un seul volume de SPD additionné de 0,8 M de NaCl et un essorage à nouveau, comme indiqué au point 2.11.
  13. Combiner les surnageants de l’étape 2.11 et 2.12 et faites tourner une fois de plus comme indiqué au point 2.11.
  14. Verser des gradients d’iodixanol dans des tubes de polyallomère à paroi fine 5 mL par sous-jacente (27 %, puis 33 %, puis 39 %) ~0.7 étapes de mL à l’aide d’une seringue de 3 mL muni d’une longue aiguille ou une pipette p1000.
  15. Charge de 3 mL de surnageant clarifié contenant le virus sur le gradient iodixanol préparés.
  16. Tournez pendant 3,5 h à 234 000 x g et 16 ° C dans un rotor SW55ti. Définir l’accélération et décélération à ralentir.
  17. Après ultracentrifugation, recueillir 12 fractions dans les tubes de mastic (chaque fraction est ~ 400 µL).
  18. Analyser les fractions pour la présence du virus en ADN double brin réactif et/ou Western blot pour VP1 (MCV VP1 lapin30). Poule des fractions dégradées avec crête dsDNA et/ou contenu VP1 et caractériser le stock par PCR quantitative pour calculer l' équivalent du génome viral31. Magasin stock virion MCPyV à-80 ° C.

3. infection

  1. Maintenir des fibroblastes dermiques humains primaires en DMEM avec sérum de veau foetal de 10 %, 1 % des acides aminés non essentiels et 1 % L-glutamine. En arrivant à confluence, diviser fibroblastes 1:4 sans rotation vers le bas.
    Remarque : Pour une plus grande efficacité d’infection MCPyV, utiliser des fibroblastes primaires entre 5 et 12 qui se divisent activement au moment de l’électrodéposition de passages.
  2. Pour infecter des fibroblastes dermiques humains, aspirer le milieu et laver les cellules avec le SPD.
  3. Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA au plat et incuber à 37 ° C pendant 5-10 min.
  4. Vérifier au microscope pour s’assurer que les cellules sont à venir sur le plat.
  5. Ajouter 10 mL de milieu DMEM/F12 contenant 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF et 3 µM CHIR99021, qui stimulent l’infection MCPyV24, au plat et transvaser la solution de cellules dans un tube de 15 mL.
  6. Tournez en bas les cellules à 180 x g pendant 2 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un milieu DMEM/F12 contenant 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF et 3µM CHIR99021 à 2-4 x 104 cellules / mL.
  7. Graines de 200 µL de la suspension cellulaire additionnée de 1 mg/mL collagénase de type IV dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Décongeler le stock virion MCPyV sur la glace. Ajouter 109 équivalents de génome viral des virions MCPyV (calculée en étape 2.18) par 1 µL d’iodixanol pour chaque cellules de 2 500 à 5000 infectées.   Appuyez doucement sur le côté de la plaque et placer la plaque dans l’incubateur.
  8. Après incubation à 37 ° C en 5 % CO2 pendant 48 à 72 heures, ajouter 20 % FBS dans chaque puits.
  9. Permettre l’infection de procéder à 37 ° C en 5 % CO2 pendant les 72-96 h.

4. immunofluorescence

  1. Difficulté des cellules obtenues à l’étape 3.9 avec 3 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 min.
  2. Laver les cellules avec du PBS.
  3. Incuber les cellules dans un tampon bloquant/perméabilisation (0,5 % X-100 Triton, 3 % de BSA dans du PBS filtrés par l’intermédiaire de 0,22 µm filtre) à ta pendant 1 h.
  4. Incuber les cellules avec les anticorps primaires suivantes : anticorps monoclonal anti-MCPyV LT (CM2B4) de la souris (1 : 1000) et anticorps de VP1 polyclonaux anti-MCPyV de lapin (1 : 2000), à la droite pendant 3 h.
  5. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
  6. Incuber les cellules avec l’anticorps secondaires : Fluor 594 chèvre anti-souris IgG (1 : 1000) et de Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (1/500) à la droite pendant 1 h.
  7. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
  8. Contre-coloration les cellules avec 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate).
  9. Lamelles de Mont sur verre glisse et analyser à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé.

5. In situ ADN-HCR

NOTE : Cette technique requiert que les cellules être ensemencé sur lamelles couvre-objet. À cette fin, les conditions d’infection décrites ci-dessus (étape 3) peuvent être transposées au format plaque 24 puits.

  1. Difficulté des cellules cultivées sur des lamelles couvre-objet avec 4 % PFA dans du PBS pour 10 min. Lavez les lamelles deux fois avec du PBS, puis traiter avec éthanol à 70 % pour permeabilize les cellules à 4 ° C durant la nuit.
    Remarque : Les échantillons fixes peuvent rester dans cet état pendant plusieurs jours.
  2. Hybrider les échantillons en remplaçant l’éthanol avec tampon d’hybridation de sonde et en incubant pendant 60 min à température ambiante.
  3. Diluer les sondes (1 µM) (tableau 1) dans l’hybridation de la sonde solution tampon à dilution 1/500 30 min avant la fin de l’étape de pré hybridation et incuber à 45 ° C.
  4. À la fin de l’incubation, distribuer ~ 10 μL de la mélange de sonde dilué par lamelle sur lames de microscope. Place les lamelles, cellule-vers le bas, sur leurs gouttelettes respectifs de sonde d’hybridation se mélangent. Sceller les bords et dos les lamelles pour les diapositives avec une libérale quantité de ciment de caoutchouc.
  5. Faire chauffer les diapositives avec sondes ajoutés à 94 ° C pendant 3 min en définissant les diapositives sur le côté plat d’un bloc chauffant. Transférer les lames à une chambre humidifiée et incuber à 45 ° C durant la nuit. Pour faire une simple chambre humidifiée, Humectez un peu d’essuie-tout stérile avec dH2O et le placer dans le fond d’un récipient en plastique qui scelle avec un joint en caoutchouc.
    Remarque : Le ciment de caoutchouc de chauffage peut brièvement bubble. Cependant, assurez-vous que le joint ne se brise pas.
  6. Avec précaution, décollez le ciment de caoutchouc avec une pince et placez le couvre-objet cellule-côté dos dans des puits d’une plaque 24 puits. Laver les lamelles couvre-objet avec tampon de lavage sonde à ta trois fois.
  7. Incuber le couvre-objet dans le tampon d’amplification (200 µL en plaques 24 puits) à ta 30-60 min.
  8. Pendant ce temps, recuire chacune des deux épingles à cheveux oligonucléotide marqué reconnaissant les sondes (tableau 1) dans des tubes distincts de PCR par chauffage à 94 ° C pendant 90 s et refroidissement à RT pendant 30 min, tout en protégeant de la lumière. Mélanger les deux épingles à cheveux dans le tampon d’amplification, chacun à une dilution de 01:50.
  9. Rendre une surface pour la réaction d’amplification en étirant le film de paraffine sur la face ouverte d’un couvercle de plaque 24 puits. Pipetter gouttes de 50-100 µL du mélange tampon en épingle à cheveux/amplification sur le film de paraffine pour chaque lamelle couvre-objet. Forceps permet de retirer délicatement les lamelles de la solution de pré-amplification. Sécher la lamelle couvre-objet en touchant le bord d’une lingette jetable poreux et placez le côté cellule sur la goutte de l’amplification.
  10. Placez le couvercle de plaque tenant les lamelles dans une chambre humidifiée et incuber une nuit à ta dans l’obscurité.
  11. Retournez les lamelles à puits une fois de plus. Incuber les échantillons avec 5 x SSCT [5 x chlorure de sodium citrate de sodium (SSC) 0,1 % Tween 20 filtré par un filtre de 0,22 µm] contenant 0,5 µg/mL DAPI pendant 1 h à température ambiante. laver les échantillons deux fois avec 5 x SSCT à température ambiante.
  12. Monter les lamelles sur lames de microscope. Analyser les cellules et les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé l’image.

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Representative Results

Le protocole décrit dans ce manuscrit a permis l’isolement d’une population presque homogène du HDFs (Figure 1). Tel que démontré par immunofluorescence, presque 100 % des cellules dermiques humains isolés utilisant les conditions décrites dans le présent protocole ont été positivement colorées pour les marqueurs des fibroblastes dermiques, vimentine et collagène j’ai24, mais négatif pour l’homme marqueur de kératinocytes de prépuce K14 (Figure 1). La figure 2 montre le processus de génération des virions de MCPyV à l’aide de recombinaison MCPyV génome et un échantillon de virion après concentration ultracentrifugeuse. Après visualisation de la bande des virions MCPyV concentrée dans le noyau du gradient (symbolisée par une flèche sur la Figure 2B), 500 fractions µL ont été recueillies et MCPyV qPCR a été réalisée afin d’identifier les fractions de pic. Un exemple des données analyse qPCR est illustré à la Figure 2C. Dans certaines autres expériences, les échantillons ont été analysés avec Western Blot à l’aide d’un anticorps VLP lapin-anti-MCPyV (la Figure 1). La figure 3 montre les images colorées par immunofluorescence de HDFs infectés par MCPyV. Pour quantifier manuellement les cellules positives, nous avons compté au moins trois points de vue au hasard d’environ 300 cellules. Nous considérons que les cellules qui sont LT positive, VP1 positif, ou LT et VP1 positifs positifs pour l’infection MCPyV. Dans les expériences illustrés à la Figure 3, plus de 30 % des cellules sont LT positif et plus de 10 % sont VP1 positive. Les génomes MCPyV reproduits dans les cellules infectées ont été détectés par le HCR-DNA FISH (Figure 4A) et le poisson Immunofluorescent-HCR-ADN (Figure 4B). Alors que le HCR-DNA FISH dévoile la localisation de l’ADN de MCPyV présents dans l’usine de réplication (foyers) en Figure 4A, les méthodes Immunofluorescent-HCR-DNA FISH permet la détection simultanée de MCPyV ADN et protéine co localisation de LT à la réplication des centres (Figure 4B). Les images du poisson par immunofluorescence-HCR-ADN ont démontré que cette technique pourrait être utilisée pour révéler la co-localisation d’ADN viral et la protéine virale associée.

Figure 1
Figure 1 . Des fibroblastes dermiques humains isolés de prépuce humain néonatale. Les cellules dermiques humaines cultivées dans un milieu DMEM/F12 additionné de 10 % de BF ont été colorées en utilisant des anticorps contre la vimentine, collagène I, ou la kératine 14 (K14). Les cellules ont été également eosine au DAPI. Bar, 50 µm. Ce chiffre est une adaptation de S2 Figure de Liu et al., 201624. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Production du virion de MCPyV à l’aide de génome viral recombinant. Carte plasmidique (A) A des pR17b (plasmide de génome de MCPyV). (B) une image représentative d’un échantillon de virion MCPyV récoltées et purifié sur un dégradé. Flèche indique la bande des virions MCPyV concentrée dans le noyau du dégradé. (C), la copie du génome viral nombre dans chaque fraction dégradée a été quantifiée à l’aide de qPCR. Principales fractions de gradients (nombres, comptant à partir de la partie supérieure de la pente, sont indiqués au bas du graphique). Barres d’erreur représentent écart-type de la moyenne (S.E.M.) des trois répétitions techniques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Fibroblastes dermiques humains support robuste infection, transcription et la réplication MCPyV. Des fibroblastes dermiques isolées de la peau humaine ont été traités avec des virions MCPyV en DMEM F12 moyen contenant collagénase, CHIR99021, EGF et bFGF IV pendant deux jours. Après le changement de milieu DMEM/F12 frais contenant 20 % FBS pendant trois jours, les cellules étaient immuno-coloration utilisant les anticorps indiquées et eosine au DAPI. Bon nombre de cellules non seulement ont fortement exprimé LT et VP1, mais montrent aussi des foyers de réplique MCPyV robustes. Ce chiffre est une adaptation de la Figure 3 de Liu et al., 201624. Balance bar, 50 m. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Détection des MCPyV dans les cellules infectées en utilisant des techniques de poisson. (A) les cellules dermiques humains cultivés en DMEM/F12 contenant EGF, bFGF, CHIR99021 et collagénase de type IV ont été traités avec MCPyV pendant 2 jours. Après avoir changé pour frais DMEM/F12 contenant FBS pour 3 jours de plus, les cellules ont été soumis à l’analyse ADN-HCR poisson. Les cellules ont été également eosine au DAPI. (B) des cellules dermiques humains cultivés en moyenne contenant EGF, bFGF, et CHIR99021 ont été soit non traitée (Mock) ou traités (infecté) avec MCPyV comme décrit au pointA. Les cellules ont été soumises à l’immuno-FISH à l’aide de LT sondes d’ADN anticorps et MCPyV spécifiques avant contre-coloration au DAPI. HPV 16 sondes ont été utilisées comme contrôle négatif. Echelle, 10 m. Ce chiffre est une adaptation de la Figure 4 de Liu et al., 201624. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Nom de la sonde Séquences
Sonde de MCPyV 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonde de HPV 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonde HPV 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonde HPV 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonde de VPH 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonde HPV 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tableau 1 : Sondes utilisées dans l’étude.

Supplemental Figure 1
Supplémentaire Figure 1. Dépistage des fractions gradients Iodixanol pour MCPyV VP1. Cellules infectées par le MCPyV ont été lysées et soumis à Iodixanol fractionnement dégradé. Base des fractions dégradées (numéros, en partant du bas de la pente dans cette expérience, sont indiqués dans la partie supérieure de la figure) ont été soumises à analyse par Western blot pour détecter VP1. 10 échantillons µL de chacune des fractions ont été ajustées sur 1 x teinture de charge avec une concentration finale de 5 % de 2-mercaptoéthanol et brièvement chauffées à 65 ° C. Les échantillons ont été séparés sur un gel de bis-Tris de 4 à 12 % et effacés sur nitrocellulose. Western Blot a été réalisée dans un mélange TBST avec de lait sec, à l’aide d’un lapin-anti-MCPyV VLP antisérum dilué 1 : 5000. L’antisérum est disponible sur demande. Le standard de 50 kDa (qui migre de la même façon à la 47 kDa MCPyV VP1 monomère) est marquée d’un astérisque. L’image montrée, réduction de l’échantillon était incomplète et disulfure-linked VP1 multimères sont apparents. Utilisation du dithiothréitol ou des températures plus élevées de dénaturation peut entraîner une réduction plus complète à l’espèce de monomère VP1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les méthodes décrites ci-dessus, y compris l’isolement des fibroblastes dermiques de tissus de la peau humaine, la préparation des virions de MCPyV recombinantes, l’infection de cellules cultivées, immunofluorescence et une méthode sensible de poisson adapté de la technologie HCR, qui devrait permettre aux chercheurs d’analyser MCPyV infection27. Une des étapes plus critiques pour atteindre MCPyV infection in vitro est la production de préparations de haut-titre virion. Utilisant le protocole pour la préparation des recombinantes virions MCPyV décrit ici, nous réaliser des titres viraux de 1012 génome copies / mL de solvant11,idoxanol12. Ces haut-titre MCPyV préparations nous a permis d’identifier HDFs comme le type de cellule primaire peau jusque qui semble confirmer l’infection MCPyV complet du cycle24.

Isolement des fibroblastes dermiques humains frais en utilisant le protocole décrit dans ce manuscrit, nous a permis de contrôler la qualité des cellules utilisées dans les infections MCPyV expérimenter et assurer la cohérence des résultats de cellules isolées de différents échantillons de patients. Tous les fibroblastes dermiques humains isolés de peau néonatale devraient être évalués pour la présence d’ADN de MCPyV de qPCR pour s’assurer de l’absence d’infection à MCPyV avant le traitement avec des virions MCPyV recombinantes. Afin d’obtenir l’efficacité maximale des infection MCPyV, il est essentiel d’utiliser des fibroblastes dermiques humains prélevés fraîchement néonatale prépuce humain que les fibroblastes de passage supérieurs support efficacité d’infection MCPyV inférieure. En outre, lorsque isolée en parallèle à partir d’échantillons de peau adultes, fibroblastes provenant d’échantillons de peau néonatale appuyé beaucoup plus élevé d’efficacité d’infection MCPyV24. Nous n’avons jamais testé toutes les cellules disponibles dans le commerce pour une infection MCPyV. Cependant, nous voyons sans raison particulière que commercialement isolé fibroblastes devrait être inférieure autre que si elles sont un passage supérieur au point de congélation.

Nous avons aussi utilisé le protocole décrit ici pour isoler des fibroblastes dermiques provenant d’autres animaux. Par exemple, nous avons utilisé le protocole d’isoler avec succès des fibroblastes dermiques de souris (Mus musculus), rat (Rattus norvegicus), arbre musaraigne (Tupaia Belangeri) et rhésus macaque (Macaca mulatta)25. Comme observé dans les cellules humaines, fibroblastes isolés de jeunes chimpanzés a permis l’infection MCPyV beaucoup plus efficace par rapport aux animaux plus âgés25.

Par rapport aux traditionnels poissons, HCR-DNA FISH est un simple, mais une méthode très sensible pour la détection des génomes viraux24,27. Centres de MCPyV de réplication peuvent être facilement détectés dans les noyaux des cellules infectées comme hautement spécifiques foyers ponctuées, avec peu ou aucun signal de fond détecté dans les mêmes échantillons traités avec un VPH sonde spécifique (Figure 4)24. À l’avenir, l’approche pourrait donc être envisagée pour détecter l’ADN de MCPyV de faible abondance présents dans la peau de l’homme infectée. Il pourrait également être adapté pour surveiller d’autres virus à ADN. Lorsqu’il est combiné avec l’immunofluorescence, l’immuno-FISH fournit une méthode puissante pour détecter simultanément l’ADN viral et protéine codée virale ou protéines de l’hôte actuels dans les mêmes cellules (Figure 4). Pour obtenir les meilleurs résultats en utilisant les protocoles décrits ici, il est préférable d’utiliser des échantillons fraîchement fixes pour immunofluorescence et l’analyse de l’ADN-HCR poisson. Pour l’analyse de l’ADN-HCR poisson, les sondes et l’amplificateur devraient être stockés à-80 ° C dans de petites parties aliquotes pour éviter le gel et le dégel répétés.

À l’aide de la culture de cellules HDF et protocole d’infection MCPyV, nous avons exploré les conditions de croissance des cellules supportant mieux entrée MCPyV, transcription et la réplication en HDFs. Nous avons découvert que le traitement de HDFs présentant des facteurs de croissance, tels que l’EGF, bFGF et stimulation de la voie de signalisation WNT nettement favorisent l’infection MCPyV. Profil d’expression génique révèle que, lors de la stimulation avec ces facteurs de croissance et l’activation de la voie de signalisation WNT, plusieurs gènes de la famille de matrix métalloprotéinases (MMP), y compris MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 et 13, ont été vigoureusement induites. Parce que ces enzymes MMP sont capables de dégrader les protéines de la matrice extracellulaire, nous raisonnons qu’ils peuvent stimuler MCPyV infection en perturbant la matrice extracellulaire des cellules hôtes. En effet, un membre de la famille MMP, traitant HDFs avec collagénase de type IV, robustement stimule MCPyV infection (Figure 3)24. Nous avons également projeté un éventail de composés, y compris plusieurs inhibiteurs de kinase approuvé par la FDA, pour un effet inhibiteur sur l’infection MCPyV. Nous avons découvert que trametinib, un inhibiteur de la MEK1 et MEK2, inhibe fortement MCPyV infection24. D’autres peuvent utiliser ou modifier ce système d’infection comme une plate-forme de découverte de médicaments inhibiteurs de la MCPyV qui réduisent le MCPyV de la charge virale chez les patients immunodéprimés.

En résumé, ces protocoles pour la réalisation très efficace MCPyV infection fournissent une plate-forme pour élucider le mal compris MCPyV cycle infectieux et mécanismes oncogènes induite par le MCPyV dans le contexte de l’infection virale. Cet ensemble de protocoles pourrait être appliqué dans de futures études pour explorer les autres types de cellules humaines MCPyV-permissif et les cellules d’origine du MCC, dans quel accessoire MCPyV infection pourrait conduire au développement de la tumeur.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiens à remercier le Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) et Dr M. Celeste Simon (Université de Pennsylvanie) pour la fourniture de réactifs et support technique. Nous remercions également les membres de nos laboratoires de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) subventions (R01CA187718, R01CA148768 et R01CA142723), la subvention d’appui NCI Cancer Center (NCI P30 CA016520) et le prix Penn CFAR (P30 Ia 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

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Immunologie et Infection numéro 144 Merkel cell polyomavirus isolement fibroblastes dermiques infection collagénase IV CHIR99021 immunofluorescence fluorescence in situ hybridation réaction en chaîne in situe hybridation de l’ADN transcription réplication
Merkel Cell Polyomavirus Infection et détection
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