Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cellule di Merkel Polyomavirus infezione e rilevamento

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per infettare primario fibroblasti cutanei umani con MCPyV. Il protocollo include isolamento dei fibroblasti cutanei, preparazione di virioni di MCPyV, l'infezione del virus, colorazione di immunofluorescenza e fluorescenza l'ibridazione in situ. Questo protocollo può essere esteso per la caratterizzazione di interazioni MCPyV-ospite e scoprire altri tipi di cellule infettabili da MCPyV.

Abstract

Merkel cella polyomavirus (MCPyV) infezione può portare a carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), una forma altamente aggressiva di cancro della pelle. Gli studi meccanicistici completamente studiare biologia molecolare MCPyV e meccanismi oncogenici sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli della coltura cellulare adeguata. Qui, descriviamo una serie di protocolli per l'esecuzione e la rilevazione dell'infezione di MCPyV delle cellule epiteliali umane primarie. I protocolli descrivono l'isolamento dei fibroblasti cutanei umani, preparazione dei virions MCPyV ricombinante e la rilevazione dell'infezione del virus di colorazione di immunofluorescenza (IF) e reazione a catena del DNA-ibridazione in situ (HCR), che è un altamente sensibile fluorescenza in situ approccio di ibridazione (pesce). I protocolli di questo documento possono essere adattati dai ricercatori interessati per identificare altri tipi di cellule o linee cellulari che supportano MCPyV infezione. L'approccio descritto di pesce può anche essere adattato per rilevare i bassi livelli di DNA virale presente nella pelle umana infetta.

Introduction

Polyomavirus delle cellule di Merkel (MCPyV) è un piccolo, double-stranded virus a DNA che è stato associato con un tumore di pelle raro ma aggressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Il tasso di mortalità di MCC, circa il 33%, superiore a quella del melanoma3,4. MCPyV ha un genoma circolare di ~ 5 kb1,5 , diviso in due da una regione regolatrice non codificanti (NCRR) in precoce e tardiva codifica regioni1. Il NCRR contiene l'origine virale della replica (Ori) e promotori di bidirezionale per trascrizione virale6,7. La regione precoce codifica proteine antigene tumore chiamati grande T (LT), piccolo T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), come pure un autoregulatory miRNA1,8,9,10. La regione tarda codifica per le proteine del capside VP1 e VP211,12,13. LT e sT sono le proteine di MCPyV meglio studiate e sono stati indicati per sostenere la replicazione del DNA virale e tumorigenesis indotto MCPyV5. Integrazione clonale di MCPyV DNA nel genoma ospite, che è stato osservato in fino a 80% di MCCs, è probabilmente un fattore causale per tumore virus-positivo sviluppo14,15.

L'incidenza di MCC è triplicato sopra i venti anni ultimi16. MCPyV l'infezione asintomatica è diffuso nella popolazione generale17,18,19. Con il crescente numero di diagnosi MCC e l'alta prevalenza dell'infezione di MCPyV, c'è la necessità di migliorare la nostra comprensione del virus e la sua potenziale oncogeno. Tuttavia, molti aspetti della biologia di MCPyV e meccanismi oncogenici rimangono capita male20. Questo è in gran parte perché MCPyV replica scarsamente cellulari stabilizzate linee11,12,21,22,23 e, fino a poco tempo, in grado di supportare MCPyV le cellule della pelle infezione non era stati individuati22. Gli studi meccanicistici per investigare completamente MCPyV e la sua interazione con cellule dell'ospite sono stati ostacolati dalla mancanza di sistema di coltura cellulare per propagare il virus5.

Abbiamo scoperto che fibroblasti cutanei umani primari (HDFs) isolato da infezione di prepuzio umano neonatale supporto robusto MCPyV entrambi in vitro ed ex vivo24. Da questo studio, abbiamo stabilito il primo modello di infezione di coltura cellulare per MCPyV24. Sulla base di questo sistema di modello, abbiamo mostrato che l'induzione di geni metalloproteasi (MMP) matrice di WNT/β-catenin signaling pathway e altri fattori di crescita stimola l'infezione MCPyV. Inoltre, abbiamo trovato che la nuova antagonista MEK approvato dalla FDA inibisce efficacemente l'infezione MCPyV5,25. Da questi studi, abbiamo anche stabilito una serie di protocolli per l'isolamento di fibroblasti cutanei umani24,25, preparando MCPyV virioni11,12, eseguendo MCPyV infezione su fibroblasti cutanei umani 24 , rilevazione MCPyV proteine di IF colorazione26e 25 . Inoltre, ci siamo adattati in situ del DNA ibridazione reazione a catena (HCR) tecnologia27 per sviluppare una tecnica altamente sensibile di pesce (pesce HCR-DNA) per la rilevazione del DNA di MCPyV in cellule epiteliali umane infettate. Questi nuovi metodi sarà utili per lo studio del ciclo infettivo di MCPyV, come pure la risposta cellulare all'infezione MCPyV. Le cellule di serbatoio ospite naturale che mantengono l'infezione MCPyV e le cellule che danno origine a tumori MCC rimangono sconosciute. Le tecniche che descriviamo in questo manoscritto potrebbero essere applicate per esaminare vari tipi di cellule umane di identificare sia le cellule del serbatoio e l'origine dei tumori MCC. I nostri metodi consolidati, come il pesce HCR-DNA, potrebbero essere impiegati anche nel rilevamento di altri virus oncogeni a DNA e la caratterizzazione delle interazioni delle cellule ospite.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prepuzi neonatale umane sono stati ottenuti da Penn pelle malattia Research Center. Fibroblasti umani adulti sono stati ottenuti da pelle normale scartata dopo la chirurgia. Tutti i protocolli sono stati approvati dall'Università della Pennsylvania Institutional Review Board.

1. isolamento dei fibroblasti cutanei umani

  1. Utilizzare un paio di forbici per tagliare il grasso e del tessuto sottocutaneo dal prepuzio umano neonatale e tagliare il campione di pelle in metà o in quarti.
  2. Incubare il tessuto in 5 mL di dispase 10mg/mL II in PBS completati con antibiotico antimicotico a 4 ° C durante la notte.
  3. In un piatto sterile 10cm, separare con cura l'epidermide dagli strati cutanei mediante microdissezione forcipe.
  4. Trasferimento il tessuto cutaneo risultante in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di collagenasi di 2 mg/mL tipo IV in FBS-libero supplementato con antibiotico antimicotico.
  5. Incubare il campione a 37 ° C in 5% CO2 per 4-6 h con agitazione periodica fino a quando rimangono solo pochi aggregati macroscopici del tessuto.
  6. Rilasciare singole cellule dal derma pipettando su e giù (triturazione) vigorosamente dieci volte con una pipetta da 10 mL.
  7. Centrifugare a 180 x g per 5 min e scartare il surnatante.
  8. Piastra le cellule dissociate in medium DMEM completate con 10% siero fetale del vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina a 37 ° C in 5% CO2.

2. preparazione di virion ricombinante MCPyV

  1. Digest 50 µ g di plasmide pR17b (che trasportano MCPyV genoma) con 250 U di BamHI-HF in un volume di 200 µ l (4 h a 37 ° C) per separare il genoma virale dalla spina dorsale vettoriale (Figura 2).
  2. Aggiungere 1200 µ l di tampone PB (supplementato con 10 µ l di 3 M Pierantonio, pH 5.2) al DNA digerito e purificare oltre 2 colonne di spin miniprep (capacità del DNA di 20 µ g). Eluire il plasmide pR17b digeriti da ogni colonna con 200 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
  3. Preparare la reazione di legatura in una provetta da centrifuga 50 mL. Aggiungere 400 µ l di DNA plasmidico purificato dal passaggio 2.2, 8,6 mL di tampone di ligasi x T4 1.05 e 6 µ l della ligasi di alta concentrazione di T4. Incubare a 16 ° C durante la notte.
  4. Aggiungere 45 mL di tampone PB (supplementato con 10 µ l di 3 M Pierantonio, pH 5.2) per la legatura e utilizzare un collettore ad aspirazione per caricare attraverso 2 colonne di spin miniprep. Eluire ogni colonna con 50 µ l di buffer di TE. Aspettatevi una resa di circa 30 µ g di DNA.
  5. Nel tardo pomeriggio/sera, cellule di seme 6 x 106 293TT28 in 10 cm piatto contenente DMEM supplementato con 10% siero fetale di vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina senza igromicina B.
  6. La mattina successiva, assicurarsi che le celle sono circa il 50% confluenti. Transfect utilizzando 66 µ l di reagente di transfezione (1,1 µ l/cm2), 12 µ g di re-legato MCPyV isolare R17b DNA dal punto 2.4, 8,4 µ g di ST espressione plasmide pMtB e 9,6 µ g di LT espressione plasmide pADL *29.
  7. Quando le cellule transfettate sono quasi confluenti, il giorno seguente, tripsinizzano le cellule e trasferirli su un piatto di 15 cm per la continua espansione.
  8. Eventualmente prendere un piccolo numero di cellule 293TT all'espansione ed eseguire se macchiatura per MCPyV LT (CM2B4) e VP1 (MCV VP1 coniglio30) per determinare l'efficienza di trasfezione. In questa fase, nucleare LT segnale potrebbe essere visibile, ma espressione di VP1 probabilmente non sarà rilevabile.
  9. Quando il piatto di 15cm diventa quasi confluenti (solitamente 5-6 giorni dopo trasfezione iniziale), trasferire le cellule in tre piatti di 15 cm. Raccogliere le cellule dai piatti 15cm quando diventano quasi confluenti e seguire il protocollo di raccolta virus qui sotto.
    Nota: Facoltativamente eseguire il controllo di qualità se come descritto al punto 2.8. La maggior parte delle cellule dovrebbe essere MCPyV LT sia VP1 positivo in questa fase.
  10. Per raccogliere il virus, tripsinizzano cellule, gira a 180 x g per 5 min a RT e rimuovere il surnatante. Aggiungere un volume di pellet cellulare di DPBS-Mg (DPBS con 9,5 mM MgCl2 e 1 x antibiotico antimicotico). Quindi aggiungere solfato di ammonio di 25 mM (da una soluzione madre 1 M a pH 9) seguita da 0,5% Triton X-100 (da una soluzione madre 10%), 0,1% Benzonase e 0,1% di una dnasi ATP-dipendente. Mescolare bene e incubare a 37 ° C durante la notte.
  11. Incubare la miscela per 15 min sul ghiaccio e poi aggiungere 0.17 volume di 5 M di NaCl. Miscelare e incubare in ghiaccio per un altro 15 min Spin per 10 min a 12.000 x g in una centrifuga di 4 ° C. Se non è chiaro il supernatante, delicatamente capovolgere la provetta e ripetere il passaggio di filatura. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
  12. Risospendere il pellet utilizzando un volume di DPBS completati con 0,8 M di NaCl e spin di nuovo, come descritto al punto 2.11.
  13. Combinare i surnatanti dal passo 2.11 e 2.12 e girare ancora una volta come descritto al punto 2.11.
  14. Via sottostante (27%, quindi 33%, quindi 39%) pour pendenze di iodixanol in tubi a parete sottile 5ml polyallomer ~0.7 passaggi di mL utilizzando una siringa da 3 mL muniti di un lungo ago o una pipetta p1000.
  15. Caricare 3 mL di surnatante chiarificato contenenti virus sul gradiente iodixanol preparati.
  16. Spin per 3,5 h a 234.000 x g e a 16 ° C in un rotore di SW55ti. Impostare l'accelerazione e la decelerazione per rallentare.
  17. Dopo ultracentrifugazione, raccogliere 12 frazioni in tubi siliconati (ogni frazione è ~ 400 µ l).
  18. Analizzare le frazioni per la presenza di virus dsDNA reagente e/o Western blot per VP1 (MCV VP1 coniglio30). Piscina gradiente frazioni con picco dsDNA e/o contenuti di VP1 e caratterizzano lo stock mediante PCR quantitativa per calcolare l' equivalente del genoma virale31. Negozio di stock di virion di MCPyV a-80 ° C.

3. infezione

  1. Mantenere i fibroblasti cutanei umani primari in DMEM con 10% siero fetale del vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina. Una volta raggiunta la confluenza, split fibroblasti 1:4 senza rotazione verso il basso.
    Nota: Per la massima efficienza di infezione MCPyV, utilizzare fibroblasti primari tra passaggi 5 e 12 che si dividono attivamente al momento della placcatura.
  2. Per infettare i fibroblasti cutanei umani, il mezzo di aspirare e lavare le cellule con DPBS.
  3. Aggiungere 1 mL di 0.05% tripsina-EDTA al piatto e incubare a 37 ° C per 5-10 min.
  4. Verifica sotto il microscopio per assicurarsi che le celle sono venuta fuori il piatto.
  5. Aggiungere 10 mL di terreno DMEM/F12 contenente 20 ng/mL EGF, bFGF di 20 ng/mL e 3 µM CHIR99021, i quali stimolano l'infezione MCPyV24, al piatto e trasferire la soluzione di cella in una provetta da 15 mL.
  6. Rotazione verso il basso le cellule a 180 x g per 2 min e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in DMEM/F12 medium contenente 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF e 3 µm CHIR99021 a 2-4 x 104 cellule per mL.
  7. Semi di 200 µ l della sospensione delle cellule completata con tipo di 1mg/mL collagenasi IV in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Scongelare il magazzino virione MCPyV su ghiaccio. Aggiungere 109 equivalenti di genoma virale dei virions MCPyV (calcolato nel passaggio 2.18) a 1 µ l di iodixanol per ogni 2.500 a 5000 cellule essere infettati.   Toccare delicatamente il lato della piastra e posizionare la piastra nell'incubatore.
  8. Dopo incubazione a 37 ° C in 5% CO2 per 48-72 h, aggiungere 20% FBS in ciascun pozzetto.
  9. Permettere che l'infezione di procedere a 37 ° C in 5% CO2 per 72-96 h.

4. immunofluorescenza colorazione

  1. Difficoltà cellule ottenute nel passaggio 3.9 con paraformaldeide 3% in PBS per 20 min.
  2. Lavare le cellule con PBS due volte.
  3. Incubare le cellule nel buffer blocco/permeabilizzazione (0,5% Triton X-100, 3% BSA in PBS filtrata attraverso 0,22 µm) a temperatura ambiente per 1 h.
  4. Incubare le cellule con i seguenti anticorpi primari: mouse monoclonale anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) e anticorpo policlonale anti-MCPyV (1: 2000), VP1 di coniglio al RT per 3 h.
  5. Lavare le cellule con PBS tre volte.
  6. Incubare le cellule con gli anticorpi secondari: 594 Fluor anti-topo di capra IgG (1: 1000) e Fluor 488 capra anti-coniglio IgG (1: 500) a temperatura ambiente per 1 h.
  7. Lavare le cellule con PBS tre volte.
  8. Colorante di contrasto le cellule con 0,5 µ g/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dicloridrato).
  9. Vetrini coprioggetto di montaggio su vetro scivola e analizzare utilizzando un microscopio di fluorescenza invertito.

5. In situ del DNA-HCR

Nota: Questa tecnica richiede che le cellule seminate su vetrini coprioggetti. Per questo scopo, le condizioni di infezione descritte sopra (passaggio 3) possono essere scalate al formato piastra a 24 pozzetti.

  1. Difficoltà cellule coltivate sulle lamelle con 4% PFA in PBS per 10 min. lavare i vetrini coprioggetti due volte con PBS, poi trattarli con etanolo al 70% per permeabilize le cellule a 4 ° C durante la notte.
    Nota: I campioni fissati possono rimanere in questo stato per diversi giorni.
  2. Pre-ibridare campioni sostituendo l'etanolo con tampone di ibridazione della sonda e incubare per 60 minuti a TA.
  3. Diluire il sonde (1 µM) (tabella 1) ibridazione della sonda in soluzione tampone diluizione 1: 500 30 min prima della fine della fase di pre-ibridazione e incubare a 45 ° C.
  4. Alla fine delle incubazioni, Pipettare ~ 10 μL del mix di sonde diluito per coprire i vetrini su vetrini da microscopio. Posto i coprioggetti, cella-lato verso il basso, il loro rispettive goccioline della sonda di ibridazione mescolare. Sigillare i bordi e le parti posteriori delle lamelle per le diapositive con una quantità generosa di cemento di gomma.
  5. Impostando le diapositive sul lato piatto di un blocco di calore di calore le diapositive con le sonde aggiunto a 94 ° C per 3 min. Trasferire i vetrini in una camera umidificata e incubare a 45 ° C durante la notte. Per rendere una semplice camera umidificata, inumidire leggermente i tovaglioli di carta sterile con dH2O e posto nella parte inferiore di un contenitore di plastica che sigilla con una guarnizione in gomma.
    Nota: Durante il riscaldamento il cemento di gomma può bolla brevemente. Tuttavia, assicurarsi che la guarnizione non si rompe.
  6. Attentamente staccarsi il cemento di gomma con il forcipe e posizionare il coprioggetti cella-lato posteriore nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Lavare i vetrini coprioggetti con tampone di lavaggio di sonda a RT tre volte.
  7. Incubare il vetrino coprioggetto nel buffer da amplificazione (200 µ l in piastre da 24 pozzetti) RT 30-60 min.
  8. Nel frattempo, tempri ciascuno dei due tornanti del oligonucleotide con etichetta riconoscendo le sonde (tabella 1) in provette PCR separate da riscaldamento a 94 ° C per 90 s e raffreddamento a RT per 30 min, proteggendo dalla luce. Mescolare le due forcine nel buffer di amplificazione, ciascuno ad una diluizione di 01:50.
  9. Fare una superficie per la reazione di amplificazione da stretching paraffina pellicola sopra il viso aperto di un coperchio piastra a 24 pozzetti. Pipettare 50-100 µ l gocce della miscela tampone tornante/amplificazione sulla pellicola paraffina per ogni vetrino coprioggetti. Utilizzare pinze per rimuovere con attenzione il coprioggetto dalla soluzione di pre-amplificazione. Asciugare il vetrino coprioggetto toccando il bordo di un panno monouso poroso e fissarlo cella-lato giù alla goccia di amplificazione.
  10. Posizionare il coperchio della piastra che tiene i coprioggetti in una camera umidificata e incubare per una notte a temperatura ambiente al buio.
  11. Tornare i coprioggetti pozzi ancora una volta. Incubare i campioni con 5 x SSCT [5x di cloruro di sodio citrato di sodio (SSC) 0.1% Tween 20 filtrata attraverso un filtro da 0,22 µm] contenente 0,5 µ g/mL DAPI per 1 h a TA. lavare due volte con 5 i campioni x SSCT a TA.
  12. Montare i vetrini coprioggetti su vetrini da microscopio. Analizzare le cellule e i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito di immagine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il protocollo descritto in questo manoscritto ha permesso l'isolamento di una popolazione quasi omogenea di HDFs (Figura 1). Come dimostrato dalla macchiatura immunofluorescente, quasi il 100% di cellule cutanee umane isolate utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo sono state positivamente macchiato per gli indicatori dei fibroblasti cutanei, il vimentin e collagene sono24, ma la negazione per l'essere umano marcatore di prepuzio del keratinocyte K14 (Figura 1). La figura 2 Mostra il processo di generazione MCPyV virioni utilizzando ricombinante MCPyV genoma e un campione di virion dopo concentrazione ultracentrifuga. Dopo la visualizzazione della band dei virions MCPyV concentrato nel nucleo della sfumatura (contrassegnato da una freccia nella Figura 2B), sono stati raccolti 500 frazioni µ l e MCPyV qPCR è stato effettuato per identificare le frazioni di picco. Un esempio dei dati di analisi qPCR è illustrato nella Figura 2C. In alcuni altri esperimenti, i campioni sono stati analizzati anche con Western blotting usando un anticorpo di coniglio-anti-MCPyV VLP (Supplemental figura 1). La figura 3 Mostra immagini immunofluorescente macchiati di HDFs infettati con MCPyV. Per manualmente e quantificare le cellule positive, abbiamo contato almeno tre punti di vista casuale di circa 300 celle. Consideriamo le cellule che sono LT positivo, VP1 positivo, o sia LT e VP1 positivo positivo per infezione MCPyV. Negli esperimenti illustrati nella Figura 3, oltre il 30% delle cellule sono LT positivo e più del 10% sono VP1 positivo. Il genoma di MCPyV replicato nelle cellule infette sono stati rilevati utilizzando il pesce HCR-DNA (Figura 4A) e il pesce immunofluorescente-HCR-DNA (Figura 4B). Mentre il pesce HCR-DNA rivela la localizzazione del DNA MCPyV presente nello stabilimento replica (fuochi) in Figura 4A, i metodi immunofluorescente-HCR-DNA FISH permette la rilevazione simultanea di DNA MCPyV e LT co-localizzazione della proteina alla replica centri (Figura 4B). Le immagini dal pesce immunofluorescente-HCR-DNA hanno dimostrato che questa tecnica potrebbe essere utilizzata per rivelare co-localizzazione di DNA virale e la proteina virale associata.

Figure 1
Figura 1 . Fibroblasti cutanei umani isolati dal prepuzio umano neonatale. Cellule cutanee umane coltivate in DMEM/F12 supplementato con 10% FBS erano macchiate usando gli anticorpi contro il vimentin, collagene I, o cheratina 14 (K14). Le cellule sono state anche controcolorate con DAPI. Bar, 50 µm. Questa figura è stata adattata da Figura S2 di Liu et al., 201624. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Produzione di MCPyV virione utilizzando il genoma virale ricombinante. Mappa di plasmide (A), A di pR17b (MCPyV plasmide genoma). (B) un quadro rappresentativo di un campione di virion MCPyV raccolto e purificato sopra una sfumatura. Freccia segna la band dei virions MCPyV concentrato nel nucleo della sfumatura. Numero (C), la copia del genoma virale in ogni frazione di gradiente è stato quantificato utilizzando qPCR. Nucleo di gradiente frazioni (numeri, contando dall'alto della sfumatura, sono indicati nella parte inferiore del grafico). Barre di errore rappresentano errore standard della media (s.e.m.) di tre ripetizioni di tecniche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Fibroblasti cutanei umani supportano robusto infezione, trascrizione e replica MCPyV. Fibroblasti cutanei isolati dalla pelle umana sono stati trattati con MCPyV virioni in DMEM F12 medio contiene EGF, bFGF, CHIR99021 e collagenasi IV per due giorni. Dopo aver cambiato a terreno DMEM/F12 nuovo contenente 20% FBS per altri tre giorni, le cellule erano immuno-macchiati usando gli anticorpi indicati e controcolorati con DAPI. Molte delle cellule non solo sono altamente espressi LT e VP1, ma mostrano anche i fuochi di replica MCPyV robusti. Questa figura è stata adattata da Figura 3 di Liu et al., 201624. Scala bar, 50 m. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Rilevamento di MCPyV in cellule infettate con tecniche di pesce. (A) cellule cutanee umane coltivate in DMEM/F12 contenente EGF, bFGF, CHIR99021 e collagenasi tipo IV sono stati trattati con MCPyV per 2 giorni. Dopo aver cambiato a fresco DMEM/F12 contenente FBS per altri 3 giorni, le cellule sono stati sottoposti ad analisi di HCR-DNA FISH. Le cellule sono state anche controcolorate con DAPI. (B) cellule cutanee umane coltivate in media contiene EGF, bFGF, e CHIR99021 erano entrambi (Mock) non trattati o trattati (infetto) con MCPyV come descritto in (A). Le cellule sono stati sottoposti a immuno-pesce utilizzando LT di sonde di DNA dell'anticorpo e MCPyV-specifici prima colorazione con DAPI. HPV16 sonde sono state usate come controllo negativo. Barra della scala, 10 m. Questa figura è stata adattata da Figura 4 di Liu et al., 201624. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome della sonda Sequenze
MCPyV sonda 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonda 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda di HPV 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabella 1: Sonde utilizzate nello studio.

Supplemental Figure 1
Supplementare nella figura 1. Frazioni di gradiente di Iodixanol di screening per MCPyV VP1. Cellule infettate da MCPyV sono state lisate e sottoposto a frazionamento gradiente Iodixanol. Core gradiente frazioni (numeri, contando dalla parte inferiore della sfumatura in questo esperimento, sono indicati nella parte superiore della figura) sono stati sottoposti ad analisi Western blot per rilevare VP1. 10 µ l campioni di ogni frazione sono stati regolati a 1 x tintura di carico con una concentrazione finale di 5% di 2-mercaptoetanolo e brevemente riscaldati a 65 ° C. I campioni sono stati separati su un gel di bis-Tris di 4-12% e cancellati sulla nitrocellulosa. Macchiarsi occidentale è stato condotto in TBST con latte in polvere senza grassi utilizzando un coniglio-anti-MCPyV VLP antisiero diluito 1: 5000. L'antisiero è disponibile su richiesta. I 50 kDa standard (che consente di migrare allo stesso modo il kDa 47 MCPyV VP1 monomero) è contrassegnato con un asterisco. Nell'immagine mostrata, riduzione campione era incompleta e bisolfuro-collegati VP1 multimers sono evidenti. Uso di ditiotreitolo e/o temperature superiori di denaturazione può causare riduzione più completa per le specie di monomero VP1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I metodi descritti sopra, compreso isolamento dei fibroblasti cutanei dal tessuto di pelle umana, la preparazione dei virions MCPyV ricombinante, infezione di cellule coltivate, macchiatura immunofluorescente e un metodo sensibile di pesce adattato dalla tecnologia HCR, che dovrebbe consentire ai ricercatori di analizzare MCPyV infezione27. Una delle fasi più critiche al raggiungimento MCPyV infezione in vitro è la produzione di preparazioni di alto-titolo virione. Utilizzando il protocollo per la preparazione dei virions di MCPyV ricombinante descritto qui, raggiungiamo titoli virali di 10 copie di genoma12 millilitri di idoxanol solvente11,12. Queste alto-titolo MCPyV preparazioni ci ha permesso di identificare HDFs come il tipo di cellula cutanea primaria solo finora che sembra sostenere l'infezione MCPyV completo ciclo24.

Isolando i fibroblasti cutanei umani freschi mediante il protocollo descritto in questo manoscritto ci ha permesso di controllo della qualità delle celle utilizzate nell'infezione MCPyV sperimentare e garantire la coerenza dei risultati tra le cellule isolate da diversi campioni di pazienti. Tutti i fibroblasti cutanei umani isolati dalla pelle neonatale dovrebbero essere valutati per la presenza del DNA di MCPyV di qPCR per garantire l'assenza di infezione MCPyV prima del trattamento con ricombinante MCPyV virioni. Al fine di ottenere la massima efficienza di infezione MCPyV, è fondamentale utilizzare fibroblasti cutanei umani isolati appena da prepuzio umano neonatale come fibroblasti di passaggio superiore supportano inferiore efficienze di infezione MCPyV. Inoltre, quando isolato in parallelo da campioni di pelle adulta, fibroblasti ottenuti da campioni di pelle neonatale supportati molto più elevati di efficienza di MCPyV infezione24. Mai abbiamo testato tutte le celle disponibili in commercio per MCPyV l'infezione. Tuttavia, vediamo nessun motivo specifico che commercialmente isolato fibroblasti dovrebbe essere inferiore diverso se sono passaggio superiore al punto di congelamento.

Abbiamo anche usato il protocollo descritto qui per isolare fibroblasti cutanei da altri animali. Ad esempio, utilizziamo il protocollo per isolare con successo i fibroblasti cutanei da topo (Mus musculus), ratto (Rattus norvegicus), albero toporagno (Tupaia Belangeri) e rhesus Macaco (Macaca mulatta)25. Come osservato in cellule umane, fibroblasti isolati da più giovane scimpanzé ammessi infezione di MCPyV molto più efficiente rispetto ai più vecchi animali25.

Rispetto ai tradizionali di pesce, pesce HCR-DNA è un semplice, ma metodo altamente sensibile per la rilevazione del genoma virale24,27. Centri di MCPyV replica possono essere facilmente individuate nei nuclei delle cellule infette come fuochi punctati altamente specifici, con poco o nessun segnale di fondo rilevato negli stessi campioni trattati con un HPV sonda specifica (Figura 4)24. In futuro, l'approccio di conseguenza potrebbe essere esplorato per rilevare il DNA di MCPyV basso-abbondanza presente nella pelle umana infetta. Può anche essere adattato per monitorare altri virus a DNA. Quando combinato con la macchiatura immunofluorescente, immuno-pesce fornisce un metodo potente per rilevare simultaneamente il DNA virale e codifica per la proteina virale o proteine ospite presente nelle stesse cellule (Figura 4). Per ottenere i risultati ottimali utilizzando i protocolli descritti qui, si consiglia di utilizzare campioni appena fissi per la macchiatura immunofluorescente e l'analisi dei pesci HCR-DNA. Per l'analisi dei pesci HCR-DNA, le sonde e amplificatore devono essere conservati a-80 ° C in piccole aliquote per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.

Mediante coltura cellulare HDF e del protocollo di infezione MCPyV, abbiamo esplorato le condizioni di crescita cellulare che meglio supportano voce MCPyV, trascrizione e replica in HDFs. Abbiamo scoperto che il trattamento di HDFs con fattori di crescita come EGF, bFGF e stimolazione della via di segnalazione WNT significativamente promuovere infezione MCPyV. Espressione genica rivela che, dopo stimolazione con questi fattori di crescita e l'attivazione della via di segnalazione WNT, diversi geni della famiglia matrice metalloproteasi (MMP), tra cui MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 e 13, robustamente sono stati indotti. Poiché questi enzimi MMP sono in grado di degradare le proteine della matrice extracellulare, ragioniamo che essi possano stimolare MCPyV infezione interrompendo la matrice extracellulare delle cellule dell'ospite. Infatti, il trattamento HDFs con tipo collagenosi IV, un membro della famiglia MMP, robustamente stimola MCPyV infezione (Figura 3)24. Abbiamo anche proiettato una matrice di composti, tra cui diversi inibitori di chinasi approvato dalla FDA, per effetto inibitorio sull'infezione di MCPyV. Abbiamo scoperto che trametinib, un inibitore MEK1 e MEK2, inibisce drammaticamente MCPyV infezione24. Altri possono utilizzare o modificare questo sistema di infezione come una piattaforma di scoperta di droga per gli inibitori di MCPyV che ridurre il carico virale di MCPyV in pazienti immunocompromised.

In sintesi, questi protocolli per raggiungere altamente efficiente MCPyV infezione forniscono una piattaforma per delucidare il mal capito MCPyV ciclo infettivo e meccanismi oncogenici MCPyV-indotta nel contesto dell'infezione virale. Questo insieme di protocolli potrebbe essere applicato negli studi futuri per esplorare ulteriori tipi della cellula umana MCPyV-permissiva e le cellule originali del MCC, in cui incidentali MCPyV infezione potrebbe portare allo sviluppo del tumore.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) e Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) per la fornitura di reagenti e supporto tecnico. Ringraziamo anche i membri dei nostri laboratori di discussione utile. Questo lavoro è stato supportato dalle borse di studio del National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), il NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) e il premio di Penn CFAR (P30 AI 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

Immunologia e infezione problema 144 polyomavirus delle cellule di Merkel isolamento fibroblasti cutanei infezione collagenasi IV CHIR99021 macchiatura immunofluorescente fluorescenza in situ di ibridazione reazione a catena del DNA-ibridazione in situ trascrizione replica
Cellule di Merkel Polyomavirus infezione e rilevamento
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter