Summary
Her præsenterer vi et flow cytometric protokol for at identificere CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter i humant perifert blod ved hjælp af kun to fluorokromer i stedet for syv. Med denne tilgang, kan fem ekstra markører registreres på de fleste flow cytometers.
Abstract
Immun celle karakterisering afhængig stærkt af flerfarvet flowcytometri at identificere delpopulationer baseret på differentierede udtryk af overflade markører. Opsætning af en klassiske flerfarvet panel kræver high-end instrumenter, brugerdefinerede mærkede antistoffer og omhyggelig undersøgelse design at minimere spektrale overlapning. Vi udviklede en multiparametric analyse for at identificere større immun befolkningsgrupper (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter) i perifert blod ved at kombinere syv lineage markører ved hjælp af kun to fluorokromer. Vores strategi er baseret på den iagttagelse, at lineage markører konstant er udtrykt i en unik kombination af hver celle befolkning. Ved at kombinere denne information med en omhyggelig titrering af antistoffer gør det muligt for efterforskerne at registrere fem ekstra markører, udvide den optiske grænse for de fleste flow cytometers. Head-to-head sammenligning viste, at langt størstedelen af immun cellepopulationer i perifert blod kan karakteriseres med tilsvarende nøjagtighed mellem vores metode og den klassiske "en fluorokrom-en markør tilgang", selvom sidstnævnte er stadig mere præcist for at identificere befolkningsgrupper som NKT celler og γδ T celler. Kombinerer syv markører ved hjælp af to fluorokromer giver mulighed for analyse af komplekse immun cellepopulationer og kliniske prøver på overkommelige 6-10 fluorokrom flow cytometers, og selv på 2-3 fluorokrom feltinstrumenter i områder med begrænsede ressourcer. High-end instrumenter kan også drage fordel af denne fremgangsmåde ved hjælp af ekstra fluorokromer til at opnå dybere analyse af handelsstrømmen flowcytometri. Denne tilgang er også meget godt egnet til screening flere cellepopulationer ved kliniske prøver med begrænset antal celler.
Introduction
Flowcytometri er en teknik, der blev udviklet for at analysere flere parametre på én partikler med en hastighed på flere tusinde af begivenheder pr. anden1. Eksempler på prøver analyseret ved flowcytometri omfatter, men er ikke begrænset til, celler, perler, bakterier, vesikler og kromosomer. En fluidic system dirigerer partikler på forhør punkt, hvor hver partikel skærer sin vej med en eller flere lasere, og flere parametre registreres for yderligere analyse. Frem og side scatters, genereret af spredning af ren laserlys, der bruges til at identificere målgruppen og hente oplysninger om den relative størrelse og indre kompleksitet/granulering af partikler, henholdsvis. Alle de andre parametre, der tegner sig for de fleste af data i et flow cytometric analyse, er afledt af fluorokrom-mærket sonder, der genkender og binder til specifikke mål for partikler af interesse.
Flowcytometri er en primære værktøj til at identificere og karakterisere cellepopulationer immunologiske undersøgelser. For at dissekere kompleksiteten af immunsystemet, Multifarve paneler under konstant udvikling for at udvide antallet af markører samtidig registreres for dyb Immunofænotypning af celle populationer1. Dette fører til udvikling af bedre i stand til instrumenter og fluorokromer, med de seneste high-end flow cytometers overstiger 20 fluorescerende parametre. Dette resulterer i komplekse undersøgelse design på grund af fluorokrom spektrale overlapning og højere omkostninger i forbindelse med brugerdefinerede antistof mærkning og kvalificerede operatører. I flere tilfælde reduceres kompleksitet og omkostninger ved at bruge separate paneler af markører for forskellige cellepopulationer. Denne tilgang, men er fejl liggende, reducerer oplysninger i hvert panel, og kan være vanskelig at anvende til prøver med begrænset antal celler. Desuden øge antallet af markører til hinder for dyb Immunofænotypning på instrumenter med færre fluorescerende parametre. Vi tidligere udviklet en farvnings-protokol til at identificere store immun befolkningsgrupper (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter) i perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved at kombinere syv lineage markører ved hjælp af kun to fluorokromer i stedet for syv kræves ved hjælp af den traditionelle "en fluorokrom-en markør" tilgang (www.hcdm.org)2,3. Vores indledende rapport undersøgt og godkendt begrebet kombinerer syv markører i to fluorokromer til dyb Immunofænotypning. I denne betænkning præsenterer vi en trin for trin protokol for at isolere og plette perifere blod celler, med fokus på det praktiske aspekt og fejlfindingstrin for at opnå en vellykket farvning.
Denne protokol er baseret på den iagttagelse, at lineage markører har et konstant udtryk på cellens overflade, og at hver celle befolkning har en eksklusiv kombination af lineage markører. I PBMC, CD3 udtryk underinddeler immunceller i to hovedkategorier: CD3-positive T-lymfocytter og CD3-negative celler. Inden for den positive undergruppe i CD3, CD4+, CD8+ og γδ T celler kan adskilles ved hjælp af antistoffer, der er udelukkende rettet mod CD4 og CD8 γδ receptor. I en sammenlignelig måde i CD3 negative undergruppe, kan B-celler, NK-celler og monocytter identificeres entydigt ved hjælp af antistoffer mod CD19, CD56 og CD14, henholdsvis. I en standard en fluorokrom-en markør tilgang, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 og -TCR γδ antistoffer er fundet med syv forskellige fluorokromer. Vores tilgang kombinerer anti-CD3, - CD56 og -TCR γδ antistoffer i et fluorokrom (mærket for bekvemmelighed fluorokrom A) og anti-CD4-CD8, -CD14 og - CD19 antistoffer i en anden fluorokrom (fluorokrom B). Dette er muligt ved en kombination af antistoftitrering og differentieret antigen udtryk. Begge CD4+ og CD8+ T celler er positive for anti-CD3-antistof i fluorokrom A, men de kan adskilles i fluorokrom B maksimering udtryk for CD8 signal samtidig lægge, med en ad hoc-titrering, CD4 signalet mellem CD8 og CD3 positive-CD4/CD8 dobbelt negativ celler. Γδ T celler udtrykker højere niveau af CD3 end CD4 og CD8, og derfor kan identificeres som CD3 høj4. Dette signal er yderligere styrket ved mærkning γδ T-celler i fluorokrom A med en anti-TCR γδ antistoffer, dermed forbedre adskillelse mellem CD3 lav T-celler og CD3 høj γδ T celler. B-celler kan identificeres som CD3- i fluorokrom A og CD19+ i fluorokrom B. For at adskille CD3 negative NK celler fra B-celler, blev en anti-CD56 antistof brugt i fluorokrom A som anti-CD3. Dette er muligt fordi CD56 udtrykt på NK celler på et meget lavere niveau end CD3 på T celler5. Endelig, monocytter kan identificeres via en kombination af fremad-side scatter egenskaber og udtryk af CD14 i fluorokrom B.
Idé om at kombinere op til fire markører ved hjælp af to fluorokromer allerede med held har forsøgt før6,7,8, og er blevet brugt i en klinisk protokol til at identificere maligne lymfatisk populationer9 . En tidligere rapport også kombineret syv markører (med forskellige specificitet fra markører end vi brugte i vores protokol) ved hjælp af to fluorokromer, men denne tilgang har påberåbt sig en kompleks mærkning af hver enkelt antistof med varierende mængde af fluorokrom10. Dette er i modsætning til vores metode, som benytter kommercielt tilgængelige antistoffer og kan tilpasses til konfigurationen af instrument og kan drage fordel af den nye generation af polymer fluorokromer.
Det overordnede mål med denne metode er at udvide de optisk grænserne for de fleste flow cytometers giver mulighed for optagelse af fem ekstra markører til at afhøre komplekse cellepopulationer. Som en konsekvens, avancerede immunologiske analyse kan udføres på overkommelige 6-10 fluorokrom flow cytometers, og 2-3 fluorokrom feltinstrumenter kan nå bemærkelsesværdige resultater i områder med begrænsede ressourcer. High-end instrumenter kan også drage fordel af denne fremgangsmåde ved hjælp af ekstra fluorokromer til at opnå dybere analyse af handelsstrømmen flowcytometri og skabe modulære flow cytometric paneler målretning flere slægter på den samme tid11. Dette kan potentielt reducere antallet af paneler bruges i modulære Immunofænotypning flowcytometri og reducere omkostninger, fejl og håndtering tid. Denne tilgang er også meget godt egnet for kliniske prøver med begrænset antal celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier af menneskers materialer blev godkendt af Johns Hopkins institutionelle Review Board under Health Insurance mobilitet og Accountability Act. Patienten og kontrol prøver blev de identificerede. PBMC og blod fra raske kontrolpersoner blev indhentet af informeret samtykke.
Bemærk: Denne protokol er blevet testet på frisk eller frossen isolerede perifere blodceller og fuldblod.
1. celle forberedelse
-
Isolering af perifere blod celler (PBMC) fra fuldblod
- Trække blod i en 10 mL grøn-top rør indeholdende natrium heparin. Når røret er blevet fyldt med blod, umiddelbart invertere røret flere gange for at forhindre koagulation.
Bemærk: Rør indeholdende andre antikoagulans ethylendiamintetra syre (EDTA) eller natriumcitrat kan bruges med sammenlignelige resultater. Hvis en forskellige mængde af blod er indsamlet, skal følgende trin i protokollen skaleres i overensstemmelse hermed. - Omhyggeligt overføre trukket blod ind i en 50 mL konisk rør. Fortynde blodet med en lige mængde fosfatbufferet saltopløsning (PBS) uden calcium og magnesium.
- Tilsættes 15 mL tæthed gradient medium (f.eks. Ficoll) til bunden af en ny 50 mL konisk slange og omhyggeligt overlay den fortyndede blod på toppen af tæthed gradient medium, undgå enhver blanding mellem tæthed gradient medium og fortyndet blod.
Bemærk: Dette er et afgørende skridt til en passende adskillelse af PBMC fra røde blodlegemer. - Der centrifugeres ved 400 x g i 30 min. ved stuetemperatur (RT), med ingen bremse at undgå forstyrrelser af grænsefladen.
- Efter centrifugering, omhyggeligt Opsug den øvre lag ved hjælp af en pipette og kassere det, være opmærksom på ikke fjerne celler på interfacet mellem plasma og tæthed gradient medium, thats hvor PBMC lagdeles. Indsamle så mange celler som muligt fra interface uden at røre den roede blodlegemer pellet nederst i 50 mL konisk tube og overførsel til en ny 50 mL konisk slange.
- Tilføje PBS for at bringe de endelige volumen på 25 mL og invertere flere gange for at blande. Centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved RT med bremsen på at fjerne enhver tæthed gradient medium forurening fra cellesuspension.
- Omhyggeligt Aspirér supernatanten uden forstyrrende celle pellet. Tilføje PBS for at bringe de endelige volumen på 25 mL og invertere flere gange for at blande. Der centrifugeres ved 200 x g i 10 min. ved RT med bremse på Fjern blodplader.
- Omhyggeligt Aspirér supernatanten uden at forstyrre den celle pellet. Resuspend PBMC i 1 mL af PBS/0.1% natriumazid. Natriumazid reducerer udjævningen, kaste, internalisering af de antistoffer, og øge celle opsving, men dets giftighed kan forringe cellernes levedygtighed. Derfor bør natriumazid undgås i alle trin, hvis celler vil blive kulturperler for efterfølgende forsøg. Celle isolation og farvning uden natriumazid gav lignende resultater til farvning udføres i nærværelse af natriumazid.
Forsigtighed: Natriumazid kan medføre døden ved at påvirke centralnervesystemet. Kontakt kan forårsage forbrændinger på huden og øjnene. - Fortynd celler til optælling ved at overføre 30 µL af PBMC i 1,5 mL microcentrifuge rør. Derefter tilsættes 120 µL af PBS og 150 µL af Trypan blå til at bestemme cell antal og levedygtighed (1:10 celle fortynding). Resuspend omhyggeligt.
- Overfør 10 µL til en hemocytometer, tæller cellerne i overensstemmelse hermed at den anvendte tælle kammer og bestemme antallet af levedygtige celler. Levedygtige celler = antallet af Trypan blå negative celler i alt x 10 (fortyndingsfaktoren bruges i denne protokol) x 104.
Bemærk: I gennemsnit 7-15 x 106 af PBMC bør indsamles fra 10 mL blod. - Resuspend celler på 10 x 106 pr. mL af PBS/0.1% natriumazid
Bemærk: PBMC kan nedfryses og opbevares i flydende nitrogen for en længere periode. Dog kan udtryk for markører som chemokine receptorer ændres ved denne procedure.
- Trække blod i en 10 mL grøn-top rør indeholdende natrium heparin. Når røret er blevet fyldt med blod, umiddelbart invertere røret flere gange for at forhindre koagulation.
-
Forberedelse af celler fra frosne PBMC
Bemærk: forskellige indefrysning procedurer kan påvirke celle opsving og levedygtighed12. PBMC for disse eksperimenter var frosset specielt formuleret frysning medier eller føtal bovint serum (FBS)/10% dimethylsulfoxid (DMSO) med lignende resultater.
Forsigtighed: DMSO kan være lidt farligt ved indånding (lunge lokalirriterende), hudkontakt (lokalirriterende, permeator), af øjenkontakt (lokalirriterende), af indtagelse.- Fjern frosne PBMC fra flydende kvælstof og Anbring på is. Overføre cryovial fra isen direkte til 37 ° C vandbad. Holde cryovial på vandoverfladen og Ryst forsigtigt hætteglassene indtil en lille is pellet tilbage. Overføre cryovial tilbage på isen.
- Fjerne enhver vand med en 70% ethanol sprøjtede tørre. Langsomt tilsættes 1 mL PBS/0.1% natriumazid ved 4 ° C og omhyggeligt overføre cellen til en 15 mL konisk slange. Langsomt tilføje kolde PBS/0.1% natriumazid ved 4 ° C til at nå en endelige mængden af 15 mL.
- Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. Fjern forsigtigt de supernatanten, resuspend cellerne i 1 mL af PBS/0.1% natriumazid.
Bemærk: Cellerne kan også være genopslemmes i RPMI 10% FBS med lignende resultater. - Fortynd celle for at tælle ved at overføre 30 µL af PBMC i 1,5 mL microcentrifuge rør. Derefter tilsættes 120 µL af PBS og 150 µL af Trypan blå til at bestemme cell antal og levedygtighed (1:10 celle fortynding). Resuspend omhyggeligt.
- Overfør 10 µL til en hemocytometer, tæller cellerne i overensstemmelse hermed at den anvendte tælle kammer og bestemme antallet af levedygtige celler. Levedygtige celler = antallet af Trypan blå negative celler i alt x 10 (fortyndingsfaktoren bruges i denne protokol) x 104.
- Resuspend celler på 10 x 106 pr. mL i PBS/0.1% natriumazid.
-
Forberedelse af celler fra fuldblod
- Trække blod i en 10 mL grøn-top rør indeholdende natrium heparin. Når røret er blevet fyldt med blod, umiddelbart invertere røret flere gange for at forhindre koagulation.
Bemærk: Rør indeholdende andre antikoagulans, såsom EDTA eller natriumcitrat kan bruges med sammenlignelige resultater. Hvis en forskellige mængde af blod er indsamlet, skal følgende trin i protokollen skaleres i overensstemmelse hermed. - Overføre 200 µL fuldblod til en 12 mm x 75 mm udjævnede rør, tilføje 2 µL af natriumazid og vortex forsigtigt for 2 s.
- Trække blod i en 10 mL grøn-top rør indeholdende natrium heparin. Når røret er blevet fyldt med blod, umiddelbart invertere røret flere gange for at forhindre koagulation.
2. celle farvning
Bemærk: At vælge par af fluorokromer med stort set ingen spektrale overlapning er vigtigt at reducere spredning af data på grund af høje spillover af en fluorokrom i anden fluorokrom-detektoren. For at opnå en optimal identifikation af al celle subsets, bør fluorokromer med en høj kvanteudbytte anvendes som antistof par PE-BV421 og PE-APC.
-
Farvning af ferske og frosne PBMC
- Overfør 100 µL af PBMC (1 x 106 celler) til V-bundplade med 96 brønde.
Bemærk: Et vilkårligt antal celler lavere end 1 x 106 kan bruges med lignende resultater2. - Der centrifugeres ved 350 x g i 3 min. på RT og omhyggeligt Aspirér supernatanten uden at forstyrre den celle pellet. Føje til hver godt 100 µL af PBS, som indeholder en live/døde fixable farvestof, der reagerer med frie Amin på proteiner i 10 min at mærke døde celler.
- Forberede hver prøve 30 µL af en blanding, der indeholder alle antistofferne (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorchrome A og anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorchrome B). Koncentrationen af antistoffer er angivet i tabel 1 og Tabel2. På dette stadium, titreret antistoffer mod forskellige målmolekyler og i forskellige fluorokromer kan tilføjes også (f.eks. tabel 3).
Bemærk: Antistoffer koncentration kan variere afhængigt af producenten og lotnummer. Indledende tests bør derfor gøres for at opnå den optimale signal. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% natriumazid eller PBS/0.5% BSA/0.1% natriumazid blev brugt med lignende resultater til at fortynde antistoffer2. Cellen kan også farves i bind forskellig fra 30 µL til nemt at integrere denne metode til allerede eksisterende farvning protokoller. - Der centrifugeres ved 350 x g i 3 min. på RT og omhyggeligt Aspirér supernatanten uden at forstyrre den celle pellet. Tilføje antistof cocktail til hver brønd og resuspend omhyggeligt uden at skabe bobler. Inkuber i 30 min. ved RT i mørke.
Bemærk: Det er muligt at plette prøver ved 4 ° C med lignende resultater. - Tilføj 150 µL af farvning buffer, og der centrifugeres ved 350 x g i 3 min på RT og omhyggeligt Aspirér supernatanten uden at forstyrre den celle pellet. Resuspend celler i 200 µL af PBS og erhverve data på en flow Flowcytometret. Hvis farvning diskenheder er ændret, skal du sikre mindst en 20-fold fortynding af den oprindelige antistof mix bruges til at vaske overskydende af antistoffer.
Bemærk: Farvede celler kan være fast med i PBS/2% PARAFORMALDEHYD, opbevares i køleskab ved 4 ° C natten over og derefter erhvervet på forskellige en flow den følgende dag.
Forsigtighed: PARAFORMALDEHYD er skadelige, hvis sluges og kan forårsage hudirritation
- Overfør 100 µL af PBMC (1 x 106 celler) til V-bundplade med 96 brønde.
-
Farvning af fuldblod
- Til hver 12 mm x 75 mm udjævnede rør, tilføje cocktail af antistoffer (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorokrom A og anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorokrom B) og inkuberes ved RT i 30 min. ved RT i mørke. Koncentrationen af antistoffer er angivet i tabel 4. På dette stadium, titreres antistoffer mod forskellige målmolekyler og i forskellige fluorokromer kan tilføjes så godt. Antistof koncentration kan variere afhængigt af producenten og lotnummer. Indledende tests bør derfor gøres for at opnå den optimale signal.
Bemærk: Det er muligt at plette prøver ved 4 ° C med lignende resultater. - Der centrifugeres ved 350 x g i 3 min. på RT og omhyggeligt Aspirér supernatanten uden at forstyrre den celle pellet. Gøre en 1 x opløsning af røde blodlegemer lysisbuffer efter fabrikantens anvisninger.
Bemærk: Lysis løsning bør være på RT før brug. - Tilføje 2,0 mL af 1 x røde blodlegemer lysisbuffer til hver tube, cap godt og invertere flere gange for at blande. Dæk med folie og lad sidde i 15 min.
- Spin ned på 300 x g for 5 min. omhyggeligt Aspirér supernatanten uden at forstyrre den celle pellet.
- Der tilsættes 2 mL PBS og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
Bemærk: på dette punkt bør celle pellet har en bleg hvid farvning med angivelse af et vellykket røde blodlegemer lysering. Omhyggeligt Aspirér supernatanten vil ikke forstyrre celle pellet og forsigtigt resuspend celler i 200 µL af PBS. - Stamme celler gennem 12 mm x 75 mm rør med 40 µm filter hætter at fjerne celle aggregater og erhverve data på en flow Flowcytometret.
- Til hver 12 mm x 75 mm udjævnede rør, tilføje cocktail af antistoffer (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorokrom A og anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorokrom B) og inkuberes ved RT i 30 min. ved RT i mørke. Koncentrationen af antistoffer er angivet i tabel 4. På dette stadium, titreres antistoffer mod forskellige målmolekyler og i forskellige fluorokromer kan tilføjes så godt. Antistof koncentration kan variere afhængigt af producenten og lotnummer. Indledende tests bør derfor gøres for at opnå den optimale signal.
3. antistoftitrering
Bemærk: Antistoftitrering er den mest afgørende skridt for at opnå høj kvalitet, reproducerbare data. Titrering af anti-CD3,-CD8,-CD14 - CD19 og -TCR γδ følger standardproceduren, koncentration af antistof mod optimalt adskille positive og negative toppe er afledt af maksimal farvning indeks13,14. Fortyndinger på peak eller tættere på peak på den stigende side af pletten indeks kurven skal være valgt (Figur 1A-C). Anti-CD4 antistof er titreret for at placere toppen af CD4 positive befolkningen mellem CD3 enkelt positive populationer og CD3 / CD8 + T celler, tættere til CD3 enkelt positivt signal til bedre diskriminerer CD8dim populationer (CD8 + γδ T celler og NK T-celler). Langs linjen samme CD56 titrering mål til position NK CD56+ celler mellem CD3+ og CD3- befolkning.
-
Maksimale pletten indeks kurve
Bemærk: titrering af anti-CD3,-CD8,-CD14 - CD19 og -TCR γδ følger standardproceduren, koncentration af antistof mod optimalt adskille positive og negative toppe er afledt af maksimalt farvning indeks kurve15. Hvis antistoffer mod andre mærker er føjet til panelet, skal de også titreres med en maksimal farvning indeks kurve.- Forberede en 2-fold antistof fortynding ved at udfylde 10 brønde i en 96-brønd plade med 40 µL af farvning buffer. I de første godt, øge den endelige rumfang til 80 µL af farvning buffer og tilføje antistof af interesse i en koncentration på 4 gange den koncentration, som producenten foreslået.
- Bland godt og overføre 40 µL til anden godt. Bland godt og Gentag dette trin for alle de andre brøndene.
- Pletten 10 prøver af PBMC eller fuldblod med 30 µL af 10 forskellige 2-fold Fortyndingerne af antistoffer efter protokollen beskrevet før.
- Erhverve data med et flow forskellige og plot signalet fra hver fortynding (figur 1A).
- Gate på de negative og positive befolkninger for hver antistof koncentration. Øget koncentration af antistoffer kan føre til en højere baggrund. Derfor, resize negative porten i overensstemmelse hermed.
- For hver antistof koncentration, udtrække oplysninger om median og standardafvigelsen for fluorescerende intensiteten af befolkningens negative og median for fluorescerende intensiteten af befolkningens positive. Beregn for hver antistof koncentration pletten indeks med denne formel: (median fluorescerende intensiteten af befolkningens positive — median fluorescerende intensiteten af befolkningens negative) ÷ (2 x standardafvigelse af fluorescerende intensiteten af den negative befolkning) (figur 1B).
- Plot pletten indeks vs. antistof koncentration udtrykt som brøk af antistof fortynding (f.eks. 1:10 fortynding = 0,1), og identificere koncentrationen af antistof med maksimal pletten index værdi (figur 1 c).
-
Anti-CD4 og -CD56 antistoftitrering
Bemærk: Anti-CD4 og -CD56 antistoffer titrering bygger på tidligere titrering andre markører i panelet to-fluorokrom. For anti-CD4-antistof titreringen sigter mod at placere anti-CD4 signal mellem de dobbelte CD8+/CD3+ signal og CD3 enkelt positive befolkning (fig. 1 d).- Der titreres anti-CD4 og CD56 antistoffer med en 2-fold fortynding strategi som beskrevet før, tilføje yderligere koncentrationer i mellem for at identificere fint udvalg af koncentration, der gør det muligt for at adskille CD4+ T celler og NK celler fra anden cellen populationer.
- Titreres anti-CD4 antistof ved at placere anti-CD4 signalet mellem den dobbelte CD8+/CD3+ signal og CD3 enkelt positive befolkning (fig. 1 d).
Bemærk: Særlig omsorg bør gøres klart adskille CD4+ T celler fra CD8+ dim populationer. - Titreres anti-CD56 antistof efter en strategi magen til antistoftitrering anti-CD4 ved at placere NK celler mellem CD3-negative og CD3-positive populationer.
4. gating strategi
-
Identificere lymfatisk og monocytic cellepopulationer og fjerne døde celler og de fleste af de resterende røde blodlegemer fra analysen.
- Vælg hele befolkningen indeholdende lymfocytter og monocytter baseret på fremadrettede vs side scatter område (FSC-A vs SSC-A). Fjerne celle aggregater fra analyse via forward scatter højde vs forward scatter bredde (FSC-H vs FSC-W) og side scatter højde vs side scatter bredde (SSC-H vs SSC-W).
- Brug en live/døde forskelsbehandling markør til at udelukke lyse positive døde celler og resterende røde blodlegemer fra analysen. Gate på lymfocytter og monocytter baseret på de forskellige FSC-A og SSC-en profil.
-
To-fluorokrom syv-markør gating strategi af lymfatisk populationer.
Bemærk: inden for den positive undergruppe i CD3, CD4+, CD8+ og γδ T celler kan adskilles ved hjælp af antistoffer, der er udelukkende rettet mod CD4 og CD8 γδ receptor. I en sammenlignelig måde i CD3 negative undergruppe, kan B-celler, NK-celler og monocytter identificeres entydigt ved hjælp af antistoffer mod CD19, CD56 og CD14, henholdsvis.- Vælg lymfocyt gaten og oprette en dot plot med på hver akse, en af to fluorokromer bruges i denne protokol (figur 2B).
- Gate på CD8+ T celler identificeret som CD3+/CD8+ dobbelt positive celler i det øverste højre hjørne af dot-plot (figur 2B). Udelukke dim CD8 befolkningen, som kan indeholde NKT celler. Gate på CD4+ T celler identificeret som befolkningen i mellem CD8+ T celler og CD3 enkelt positive populationer. Gate på γδ T celler identificeret som høj CD3 celler. Opdele γδ T-celler i CD8 positive og CD8 negative.
- Gate på NK celler identificeret som befolkningen i mellem CD3-positive og CD3-negative celler. Underopdele NK celler i CD8 positive og CD8 negative. Gate på B-celler identificeret som CD3-negative CD19+ befolkning i nederste højre hjørne af dot plot.
- Vælg monocyt gates og oprette en dot plot med på hver akse, en af to fluorokromer bruges i denne protokol (figur 2 c). Gate på CD3-/CD14+ befolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Setup og analyse af et flow flowcytometri eksperiment af humane celler, perifere blod farves med syv lineage markører (anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 og -TCR γδ antistoffer) ved hjælp af kun to fluorokromer præsenteres.
Repræsentative resultater er beskrevet for anti-CD8 og -CD56 antistoftitrering. For hver antistof (i dette eksempel, anti-CD8), data fra ti successive 2-fold fortyndinger blev registreret for at beregne en plet indeks kurve (Figur 1A-C). Optimal antistof koncentration blev fastsat ved den maksimale pletten indeks signal13,14. Fortyndinger på peak eller tættere på peak på den stigende side af pletten indeks kurven skal være markeret. Anti-CD4 og -CD56 antistoffer var titreres ved farvning perifere blod celler sammen med de andre markører i panelet to-fluorokrom (tidligere titreres). For anti-CD4-antistof, titreringen bør sigte mod at placere anti-CD4 signalet mellem den dobbelte CD8+/CD3+ signal og CD3 enkelt positive befolkning (fig. 1 d). Særlig omsorg bør gøres klart adskille CD4+ T celler fra CD8+ dim populationer. PBMC var plettet med optimal koncentration af de angivne markører og forskellige koncentrationer af anti-CD4. Farve kode af koncentrationer: grøn angiver koncentrationer, der resulterer i en optimal adskillelse af CD4+ T celler fra andre CD3+befolkninger; Orange angiver koncentrationer, der resulterer i en acceptabel, men ikke ideel adskillelse; rød angiver koncentrationer, der resulterer i dårlig adskillelse af CD4+ T celler fra dim CD8-celler eller CD4/CD8 dobbelt negativ populationer. Anti-CD56 titrering blev udført på en lignende måde som anti-CD4-antistof, ved at placere NK celler mellem CD3-negative og CD3-positive populationer.
Repræsentant gating strategi viser hvordan man identificere lymfatisk og monocytic cellepopulationer og fjerne fra analyse døde celler og de fleste af de resterende røde blodlegemer (figur 2A). Alle de efterfølgende analyse var baseret på denne gating strategi. Repræsentant gating strategi bruges til at identificere CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter i de to fluorokrom-syv markør farvning (figur 2B-C).
Repræsentative negative resultater som følge af forkert prøveforberedelsen og titrering af anti-CD4 og -CD56 antistoffer. Undlade at korrekt titreres CD4 resulterer i dårlig adskillelse af CD4+ T celler fra CD8+ T celler (figur 3A), mens en dårlig CD56 titrering kan føre til en dårlig adskillelse af NK fra B-celler og celler negative for alle markører i det farvning () panel Figur 3B). Dårlig RBC lysis kan forekomme med fuldblod farvning. Hvis det primære mål med protokollen er at beregne procentdelen af forskellige celle population (f.eks. % af CD4+ T celler), forurening med RBC dobbelt negativ celler, der vises i dot plot som dobbelt negativ befolkning, bør udelukkes fra analyse (figur 3 c). Baseret på vores erfaring med denne protokol, har vi bemærket, at præcis adskillelse mellem B-celler og NK CD8+ celler kan kontrolleres ved hjælp af andre markører. Som et eksempel er NK-celler dobbelt negativ for HLA-DR og CCR6, mens B-celler er dobbelt positive (figur 3D).
Protokollen præsenteret i dette håndskrift er beregnet til at være en del af en flerfarvet farvnings-panel til at afhøre flere immunsystemet befolkningerne i prøver med begrænset antal celler. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, undersøgte vi dynamics i immunsystemet befolkningerne i længderetningen prøver fra donorer med myelomatose modtager en stamcelletransplantation (Clinicaltrials.gov NCT0056609816). Frosne PBMC blev indsamlet og analyseret ved flowcytometri på dag 0, 14, 28, 60, 180, 360 efter transplantation. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi har kunnet afhøre flere lymfocyt befolkning med fokus på deres naive/memory profile (CD45RA, CCR7), aktivering og celle udmattelse status (HLA-DR, CD57, CD45RA + effektor hukommelse, CD16), og T effektor fænotype (CCR4, CCR6, CXCR3) i en enkelt farvning panel17,18,19,20,21,22,23,24,25 , 26. det har været særlig nyttig i betragtning af at antallet af indsamlede celler for nogle patienter og tidspunkter var næppe tilstrækkeligt for kun en enkelt farvning panel. Repræsentant gating strategi (figur 4) og dynamikken i markerede cellepopulationer (figur 5) af en recidiverende patient over tid. I myelomatose B kan celler udtrykke NK markør CD56. For at udelukke denne mulighed, brugte vi HLA-DR og CCR6 til yderligere differentiere B-celler fra NK celler (figur 4B). CD8+ hukommelse og naive T-celler blev identificeret af udtryk for CD45RA og CCR7: naive (CD45RA+/CCR7+), central hukommelse (CM, CD45RA-/CCR7+), effektor hukommelse (EM, CD45RA-/CCR7- ) og effektor hukommelse CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (fig. 4 c). Udtryk for HLA-DR og CD57 i CD8+ naiv, samlede hukommelse T celler (som omfatter CM, EM og EMRA), CM, EM og EMRA (figur 4D). CD4+ hukommelse og naive T-celler blev identificeret af udtryk for CD45RA og CCR7: naive (CD45RA+/CCR7+), central hukommelse (CM, CD45RA-/CCR7+), effektor hukommelse (EM, CD45RA-/CCR7- ) og effektor hukommelse CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (figur 4E). HLA-DR og CD57 udtryk i CD4+ naive og memory befolkning (som omfatter CM, EM og EMRA), CM, EM og EMRA (figur 4F). CCR4 og CCR6 blev brugt som markører til at identificere inden for befolkningens hukommelse Th9 CD4+ T-celler (figur 4 g). Th1, Th1/17, Th2 og Th17 CD4+ T helper delpopulationer blev identificeret ved ekspression af CCR4, CCR6 og CXCR3 (figur 4 H). CD16 og CD57 udtryk i NK celler (figur 4I). Stamceller transplantation resulteret i en vedvarende CD4+ og CD8+ T-celle aktivering som vist ved øget udtryk for HLA-DR og CD57 og i et vrid af T hjælper til en Th1 fænotype. På dag 60 procent af B-celler dramatisk augmented forudsige patienternes tilbagefald (figur 5).
Figur 1: repræsentative antistoftitrering. (A) Dot plot viser CD8 udtryk på frisk PBMC farves med den målte koncentration af antistoffet. (B) tabel repræsenterer median og standardafvigelsen af fluorescerende intensiteten af CD8+, median fluorescerende intensitet CD8- befolkning, og de afledte pletten indeks for hver koncentration testet. (C) grafen vist hvordan til afledte den optimale koncentration af antistoffet som en funktion af pletten indeks. (D) repræsentative titrering af CD4 antistof. Panelet D er blevet ændret fra Boin et al. 20172. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative gating strategi og resultater af delpopulation forskelsbehandling. (A) skematisk gengivelse af doublet udstødelse, levende celler forskelsbehandling og størrelse-baserede gating af lymfocytter og monocytter. (B) lymfocyt delpopulationer identificeret med to fluorokrom tilgang. (C) monocytter identificeret med to fluorokrom tilgang. Tallet er blevet ændret fra Boin et al. 20172. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative resultater fra forkert prøve adskillelse og forkerte antistoftitrering. (A) forkert titrering af CD4 antistof resulterer i dårlig opløsning mellem CD4+ og CD8+ populationer. (B) fattige CD56 titrering kan føre til en dårlig adskillelse af NK fra B-celler. (C) effekten af RBC ufuldstændige lysis på delpopulationer forskelsbehandling. (D) eksempel på brugen af andre markører til at kontrollere præcis adskillelse mellem B-celler og NK-celler: B-celler er HLA-DR og CCR6 dobbelt positive, NK-celler er dobbelt negativ. Panelet D er blevet ændret fra Boin et al. 20172. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Gating strategi for at analysere prøver fra en patient med myelomatose. (A) lymfocytter var gated på grundlag af deres FSC-A og SSC-området og deres flow cytometric profil med to-fluorokrom immun-celle farvning er vist. (B) adskillelse af NK og B celler ved hjælp af CCR6 og HLA-DR. (C) Gating strategi til at identificere CD8+ hukommelse og naive T-celler. (D) udtryk for HLA-DR og CD57 i CD8+ naive og memory T-celler. (E) Gating strategi for at identificere CD4+ hukommelse og naive T-celler. (F) HLA-DR og CD57 udtryk i CD4+ naive og memory T-celler. (G) identifikation af Th9 CD4+ T-celler (H) identifikation af Thelper CD4+ T-celle delpopulationer, (jeg) CD16 og CD57 udtryk i NK-celler. Tallet er blevet tilpasset fra Boin et al. 20172. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dynamics af cellen befolkningen i patienter med myelomatose. (A) dynamisk store lymfocyt befolkning i PBMC isoleret og befrugtede på den angivne dag efter stamcelletransplantation (SCT). (B) karakterisering af CD8 delpopulationer over tid. (C) karakterisering af CD4 delpopulationer over tid. (D) analyse af NK undersæt. Data har været afbildet med GraphPad prisme. Tallet er blevet tilpasset fra Boin et al. 20172. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Target | Klon | Fluorokrom | Kreditor | Koncentration | Formål |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | Afstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Døde celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/døde forskelsbehandling | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabel 1: Antistof panel bruges til to-fluorokrom immun-celle farvning af PBMC (BV421-PE kombination).
| Target | Klon | Fluorokrom | Kreditor | Koncentration | Formål |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | Afstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | APC | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Døde celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/døde forskelsbehandling | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabel 2: Antistof panel bruges til to-fluorokrom immun-celle farvning af PBMC (APC-PE kombination).
| Target | Klon | Fluorokrom | Butik | Kreditor | Koncentration | Formål |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | Afstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | Bio | 1/30 | Differentiering |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1 G 1 | PE-Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | Th delmængder |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | Bio | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | BD | 1/900 | Aktivering/udmattelse |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 3 G 8 | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK, monocyt aktivering |
| Døde celler | L/D blå | L-23105 | LT | 1/300 | Live/døde forskelsbehandling | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | ||||||
Tabel 3: Antistof panel bruges til at plette frosne PBMC fra en patient med myelomatose.
| Target | Klon | Fluorokrom | Kreditor | Koncentration | Formål |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | Afstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/200 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Døde celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/døde forskelsbehandling | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabel 4: Antistof panel bruges til to-fluorokrom immun-celle farvning af fuldblod (BV421-PE kombination).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her har vist sig at være ganske fleksible og ufølsomme over for ændringer i farvning buffer, temperatur og perifere blod celle forberedelse på grund af den høje udtryk af lineage markører på cellens overflade. Det mest afgørende skridt for at opnå høj kvalitet, reproducerbare data er antistoftitrering. At bemærke, da titrering af antistoffer bør altid udføres under installationen af et flow cytometric panel, føjer dette trin ikke ekstra bænk-tid til vores to-fluorokrom tilgang. Titrering af anti-CD3,-CD8,-CD14 - CD19 og -TCR γδ følger standardproceduren, koncentration af antistof mod optimalt adskille positive og negative toppe er afledt af maksimal farvning indeks13,14. Fortyndinger på peak eller tættere på peak på den stigende side af pletten indeks kurven skal være valgt (figur 1A-C). På den anden side skal en ad hoc-titrering af antistoffer, anti-CD4 og anti-CD56 udføres. Anti-CD4 antistof er titreret for at placere toppen af CD4 positive befolkningen mellem CD3 enkelt positive populationer og CD3+/CD8+ T celler tættere til CD3 enkelt positivt signal til bedre diskriminere CD8dim populationer ( CD8+ γδ T celler og NK T-celler). Langs linjen samme CD56 titrering mål til position NK CD56+ celler mellem CD3+ og CD3 befolkning. Naturligvis lavere udtryk for CD56 lettere titrering af denne antistoffer med koncentration at bruge tæt på værdien opnået i en mætning kurve. Ved hjælp af høje quantum udbytte fluorokromer er en anden afgørende faktor for en optimal adskillelse af flere markører/befolkninger på samme detektoren. Vi opnået gode resultater med APC, BV421 og PE, men andre fluorokromer, som den nye generation af polymer farvestof, bør give sammenlignelige resultater. For at mindske muligheden for artefakter som følge af kompensation, det er også vigtigt at vælge et par af fluorokromer med lidt, hvis nogen, spektrale overlapning, som PE og APC, eller PE og BV421. At vælge par af fluorokromer med stort set ingen kompensation er vigtigt at reducere spredning af data på grund af høje spillover af en fluorokrom i anden fluorokrom-detektoren. Sprede reduktion letter gating immun delpopulationer ved at minimere signalforvrængning og giver mulighed for at bruge denne metode, hvis begrænset til to fluorokromer, uden behov for kompensation kontrol.
Kombination af markører, som vi foreslog er meget tilpasselig baseret på kravene til investigator. Nogle af markørerne kan faktisk udelukkes fra analysen hvis de ikke henviser til en befolkning af interesse. For eksempel, det er muligt at fjerne anti-CD19 antistof at udelukke B-celler, eller anti-CD4 antistof at fokusere kun på CD8+ T celler. Af note, anti-CD8 antistof er vigtigt at identificere CD8+ NK celler og γδ T celler, og derfor ikke bør fjernes fra panelet. For at forbedre adskillelse af sjældne cellepopulationer, kan andre fluorokromer/detektorer bruges til nogle af markørerne af to-fluorokrom farvning. Som et eksempel, kan CD56 flyttes til en anden detektor til at opdage NKT celler, der er ikke muligt med panelet to-fluorokrom. Mens det er muligt at reducere antallet af markører fra panelet, bør forsigtighed udøves i tilføje, ændre eller skifte markører.
Forudsat at den nødvendige instrumentation, antistoffer og færdighed sæt, standard en fluorokrom en markør tilgang er stadig den mest præcise måde at identificere flere immunsystemet befolkningerne og diskriminere sjældne delpopulationer, som NKT eller γδ T-celler. Men det primære mål for denne metode er ikke at erstatte den klassiske tilgang, men snarere at opnå en dyb Immunofænotypning, når du arbejder med instrumenter med et lavt antal af detektorer, eller prøver med et begrænset antal celler, samtidig med at reducere kompleksitet og omkostninger i opsætte den eksperimentelle system. Vi har gjort omfattende screening af kliniske prøver fra patienter med myelomatose, systemisk sklerose, dermatomyositis og Lyme sygdom viser, at denne farvning procedure kan forbedre samtidige forhør af flere befolkningsgrupper med begrænset antallet af celler. Vores resultater har hidtil vist, at denne procedure er ufølsom over for kronisk immun aktivering eller smitsomme sygdomme, men indledende test skal gennemføres for at vurdere rigtigheden af denne protokol i forskellige sygdomstilstande.
Fremtidige retninger for yderligere at styrke potentialet i denne protokol omfatter undersøgelser for at karakterisere infiltrerer lymfocytter i primære væv fra kliniske prøver. Dette er relevant for tumor og autoimmun sygdom immunologi, hvor denne tilgang kunne give uvurderlige oplysninger til analyse af prøver med begrænset materiale. Vi planlægger at teste dette panel på permeabilized cellerne til at udvide potentialitet for at opdage cytokin udtryk og signalering molekyler på de samme kliniske prøver. Endelig skal det bemærkes, at lignende metoder, sigter mod at udvide antallet af skrivbare markører, kunne også blive udviklet ved hjælp af forskellige sæt af markører og kan også være udviklede fordifferent dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af det nationale Institut for gigt og bevægeapparat og hudsygdomme, < https://www.niams.nih.gov/>, award antallet P30-AR053503; De Stabler Foundation, www.stablerfoundation.org; National Institute for allergi og smitsomme sygdomme, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irland Program for lunge sundhed (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , Wiley. (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, Blackwell Science. (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
