Summary

Um ensaio de citotoxicidade à base de placas para a avaliação da função citolítica de células assassinas naturais do rato

Published: June 02, 2019
doi:

Summary

Aqui, nós fornecemos uma metodologia detalhada para isolar e avaliar a função citotóxica de pilhas naturais do assassino das placentas por um ensaio colorimétrico da placa. O modelo reduzido de rato de pressão de perfusão uterina de isquemia placentária foi escolhido para demonstrar o isolamento e a avaliação mediada por anticorpos da função citotóxica de células assassinas naturais.

Abstract

É sabido que as pilhas decidual natural do assassino (NK) jogam um papel crítico no estabelecimento e na manutenção da gravidez normal. Estudos recentes demonstraram uma população alterada de células NK circulantes e decidual em mulheres que sofrem de complicações adversas da gravidez, como aborto espontâneo e pré-eclampsia. Os estudos de nosso grupo mostraram que a hipertensão na gravidez é associada com um aumento da população de pilhas NK ativadas na placenta baseada na expressão de marcadores de ativação de superfície. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para avaliar a função citotóxica de pilhas de NK isoladas das placentas em um preeclampsia-como o modelo animal da isquemia placentária cirùrgica induzida. As seguintes etapas são descritas em detalhe: geração da única suspensão da pilha, isolação da pilha de NK, estimulação ex vivo, Effector: cocultura da pilha de alvo, e o ensaio da citotoxicidade.

Introduction

A pré-eclâmpsia é uma doença hipertensiva da gravidez caracterizada por restrição de crescimento fetal, dano de órgão final e ativação imune crônica. A ativação imune crônica em mulheres com pré-eclampsia leva a aumento das citocinas inflamatórias circulantes e placentárias, um desequilíbrio nas populações de células T CD4+ e uma população aumentada de células de Killer natural (NK) ativadas1. Os estudos publicados recentemente por nosso laboratório demonstram um papel para pilhas de NK em causar alguma da patofisiologia associada com o pré-eclâmpsia no modelo reduzido do rato da pressão de perfusão uterine (Rupp) do pré-eclâmpsia. Utilizando-se a citometria de fluxo para medir a expressão superficial dos marcadores de ativação nas células NK, observou-se aumento da população de células NK ativadas na circulação e placentas de ratos RUPP comparados aos ratos gestantes normais (NP)2.

Para confirmar as observações de citometria de fluxo, foram realizados estudos funcionais para avaliar a atividade citotóxica de células NK isoladas das placentas dos ratos NP e RUPP. Existem vários métodos disponíveis para a avaliação da função citotóxica de células T citotóxicas CD8+ e células NK. O padrão-ouro para análise citotóxica funcional é o ensaio de liberação de cromo3. Outros protocolos desenvolvidos utilizados incluem citometria de fluxo4, citometria de imagem5, liberação de calceina6e, mais recentemente, bioluminescência7. Este vídeo fornecerá um protocolo detalhado em usar o ensaio bem estabelecido da liberação do desidrogenase do lactato (LDH) para medir a função citotóxica de pilhas de NK usando um jogo comercialmente disponível do ensaio da citotoxicidade de LDH.

Protocol

Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do centro médico da Universidade do Mississippi. O cuidado e manuseio dos animais estavam de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health para o tratamento ético dos animais. 1. isolação da pilha do linfócito de placentas Remova uma placenta do útero do rato (dia 19 da gestação) e coloc em 10 mL de PBS gelo-frio8. Coloque uma placenta num …

Representative Results

Células NK placentárias obtidas de ratos NP e RUPP foram incubadas por 5 h com células-alvo em suas respectivas mídias em uma proporção de 50:1 (NK: Target). A absorbância foi registrada em 490 nm e os dados brutos são mostrados na tabela 2. Calculou-se a absorvência média do fundo do meio de cultura e os poços de controle de correção de volume. Essas médias foram subtraidas dos poços apropriados indicados no protocolo do fabricante e estão representadas na tabela 3. Os v…

Discussion

Há um número de importantes notas-chave a considerar para obter resultados ideais. A esterilidade das células utilizadas é muito importante. Após a coleta da placenta, é importante que a preparação e o isolamento das células NK sejam realizados condições estéreis em um gabinete de biossegurança. Além disso, como todas as células liberam LDH após dano celular, deve-se tomar cuidado para obter uma alta viabilidade das células NK após o isolamento e durante o processo de cocultura. Demasiada liberação es…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo National Heart Lung e Blood Institute dos institutos nacionais de saúde a subvenção R00HL130456, o Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o prêmio P20GM104357, e pelo Mississippi INBRE, financiado por um prêmio de desenvolvimento institucional (IDeA) dos institutos nacionais de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o número de subvenção P20GM103476. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

References

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Cite This Article
Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

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