Summary
ここでは、比色プレートアッセイによって胎盤からナチュラルキラー細胞の細胞毒性機能を分離・評価するための詳細な方法論を提供する。胎盤虚血の減少した子宮灌流圧ラットモデルは、抗体媒介性の分離とナチュラルキラー細胞の細胞傷害機能の評価を実証するために選ばれた。
Abstract
Decidual ナチュラルキラー (NK) 細胞が正常妊娠の確立と維持に重要な役割を果たすことはよく知られています。最近の研究は、再発流産や子癇前症などの有害な妊娠合併症に苦しむ女性で、循環し、decidual NK 細胞の変化した人口を示しました。我々のグループからの研究では、妊娠中の高血圧は、表面活性化マーカーの発現に基づいて、胎盤の活性化された NK 細胞の増加した集団と関連していることが示されている。本稿では、外科的に誘導された胎盤虚血の子癇前症様動物モデルに胎盤から分離した NK 細胞の細胞毒性機能を評価するための詳細なプロトコールを提供する。以下のステップについて詳細に説明する: 単一細胞懸濁液の生成、NK 細胞単離、ex in vivo 刺激、エフェクター: 標的細胞共培養、および細胞傷害アッセイ。
Introduction
子癇前症は、胎児の発育制限、末端器官の損傷および慢性免疫活性化によって特徴付けられる妊娠の高血圧性障害である。子癇前症の女性における慢性免疫活性化は、増加した循環および胎盤炎症性サイトカイン、CD4+ T 細胞集団の不均衡、および活性化されたナチュラルキラー (NK) 細胞の集団の増加につながる。当研究室が最近発表した研究は、子癇前症の減少した子宮灌流圧 (ラップ) ラットモデルにおける子癇前症に関連する病態生理学の一部を引き起こすことにおける NK 細胞の役割を実証する。フローサイトメトリーを用いて、NK 細胞に対する活性化マーカーの表面発現を測定するために、正常な妊娠 (NP) ラットと比較してラップラットの循環および胎盤における活性化 NK 細胞の集団の増加が観察された2。
フローサイトメトリー観測を確認するために、NP およびラップラットの胎盤から単離された NK 細胞の細胞傷害活性を評価するための機能的研究を行った。細胞傷害性 CD8+ T 細胞および NK 細胞の細胞毒性機能の評価のために利用可能ないくつかの方法がある。機能的細胞傷害性分析のための金本位は、クロム放出アッセイ3である。利用される他の発達したプロトコルは、フローサイトメトリー4、イメージサイトメトリ5、カルセインリリース6、および最も最近の生物発光7を含む。このビデオでは、市販の LDH 細胞毒性アッセイキットを使用して NK セルの細胞毒性機能を測定するために、十分に確立された乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出アッセイを用いた詳細なプロトコルを提供する。
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Protocol
すべてのプロトコルは、ミシシッピ大学医療センターの機関の動物ケアと使用委員会によって承認されました。動物のケアと取り扱いは、倫理的な動物治療のための健康ガイドラインの国立研究所と一致していました。
1. 胎盤からのリンパ球細胞の分離
- ラット子宮から1つの胎盤を除去し (妊娠19日目)、10 mL の氷冷 PBS8に入れる。
- 100μ m フィルターに1つの胎盤を置き、13.5 mL の RPMI および 1.5 mL の FBS を含むペトリ皿に座らせる (総容積は 15 mL である)。注射器の平らな面を使用してフィルターを通して胎盤をペトリ皿に押し込む。
- 各組織に 3 15 mL の円錐チューブを準備します。各チューブに密度勾配培地 (材料の表を参照) を 3 ml 追加し、均質化した胎盤5ml を各チューブに慎重にオーバーレイします。
- 300 x gで室温 (RT) で25分間遠心分離し、ブレーキをかけない。転写ピペットで薄い白のバフィー層を収集します。
注:遠心分離後、3層が表示され、上部には赤色の RPMI、中央には白色の軟部層、下部には透明な密度の勾配媒体層があります。トランスファーピペットを使用して、チューブから白いバフィー層を引き上げます。同じ胎盤のすべてのチューブからのバフィー層を1つのチューブに結合します。 - 結合されたバフィー層に 10 mL の RPMI を加えます。10分、300 x g、4° c で遠心分離を行い、上清を廃棄します。
2. ナチュラルキラー細胞の分離
- 50μ l の氷冷 PBS 中の再懸濁細胞ペレット
- メーカーのプロトコルに従ってペレット化された細胞にビオチン標識 CD3 抗体を追加し、ピペットでよく混ぜる.チューブ回転子にチューブを置き、4° c で20分インキュベートします。
- 1 mL の RPMI を加え、400 x gおよび4° c で10分間遠心分離し、そして上澄みを捨てる。
- 再懸濁ペレットを 1 mL の RPMI で、1.5 mL マイクロ遠心チューブ中の150μ l の磁気ビーズと組み合わせます。チューブ回転子にマイクロ遠心チューブを置き、4° c で30分間インキュベートしながら回転させます。
注:この時点でリリースバッファを引き出して、バイオセーフティキャビネットの RT に到達することができます。 - 1分間の磁石にチューブを配置し、上清を収集し、氷の上に 15 mL のチューブ内の CD3 細胞集団を保存します。
注:これは CD3-細胞の集団です。 - マグネットからチューブを取り出し、1 mL の RPMI を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合する。
- ステップ2.5 を繰り返します。
- 400 x gおよび4° c で10分間細胞の CD3-集団を遠心分離し、上清を捨てる。細胞ペレットを50μ l の氷冷 PBS で再懸濁
- メーカーのプロトコルに従って CD3 細胞にビオチン標識された CD161a 抗体を追加し、よく混ぜる.チューブ回転子にチューブを置き、4° c で20分間インキュベートします。
- 1 mL の RPMI を加え、400 x gおよび4° c で10分間遠心分離し、そして上澄みを捨てる。再懸濁ペレットを 1 mL の RPMI で、1.5 mL マイクロ遠心チューブ中の150μ l の磁気ビーズと組み合わせます。
- チューブ回転子にマイクロ遠心チューブを配置し、4° c で30分間インキュベートしながら回転させます。
- 1分間磁石にチューブを置き、上清を収集し、CD3-/CD161a 細胞を捨てます。
- マグネットからチューブを取り出し、1 mL の RPMI を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合する。
- ステップ2.12 を繰り返します。
- マグネットからマイクロ遠心チューブを取り外し、1 mL の RT リリースバッファを追加します。管の回転子に管を置き、RT の 15 min のためにインキュベートしている間回転しなさい。
- 1分間磁石にチューブを置き、氷の上に新しい 15 mL の円錐管で上清を収集します。
注:これが NK 細胞の個体数です。 - マグネットからチューブを取り出し、RT RPMI 1 mL を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合します。
- ステップ2.16 を繰り返し、同じチューブに上清を置く。よく混ぜると細胞を数える20μ l のサンプルを取る
注:チューブを氷上に保つ。 - /CD161a +細胞を 10 分間、400 x gを4° c で遠心分離し、その後、上清を除去する。再懸濁の細胞を RPMI (10% FBS、1% ペン/喉頭炎、2 ng/mL IL-2) および 3 x 105細胞/ウェルの 2.5 ML の NK 細胞活性化培地中で播種する。48 h の細胞を37° c でインキュベートし、 5% co2 を加湿したインキュベーター内で培養する。
3. 細胞毒性アッセイ: 培養または通過細胞から NK 細胞または YAC1 を取り出す
注:すべてのステップは、ボンネットの下で行わなければなりません。すべての細胞管は常に氷上で維持されなければならない。
- ガラス血清 pipet を使用して、フラスコから YAC1 細胞および培地を収集し、氷上で 50 mL チューブに置き、よく混ぜる。細胞を数える20μ l を取る。
- YAC1 細胞を 300 x gおよび4° c で10分間スピンさせる。これらがスピンしている間、セルを数えます。
- NK 細胞6ウェルプレートの各ウェルにトリプシン/EDTA を加えます。プレートをタップし、インキュベーター内に配置します。
- 細胞をトリプシン/EDTA と共に37° c で ~ 5 分間インキュベートした後、プレート/フラスコを滅菌プレートスクレーパーで掻き取る。各ウェルに 1 mL の NK 細胞培地を加えます。
- 血清学的 pipet を用いて細胞および培地を収集し、15 mL の遠心管に集めます。細胞を数える20μ l を取る。
- NK 細胞を10分間、400 x gを4° c で回転させる。この遠心分離の間にステップ3.5 からの細胞のサンプルを数える。
注:培養プレートを廃棄する前に顕微鏡で見て、井戸の底に付着した細胞がないことを確認します。この実験では NK 細胞と YAC1 細胞を使用しているため、それぞれを個別にカウントしてください。 - 最適化試験で決定された濃度で細胞および再懸濁をカウントし、適切な数の標的: エフェクター比を試験する。これは、次の細胞濃度を作るために、対応する媒体中のペレットを再懸濁させることによって達成される: 4 x 105細胞/ML で YAC1、NK 細胞を 2 x 107細胞/ml で。
4. 細胞毒性アッセイ: アッセイプロトコル
- 円形ボトムを使用して、培養処理 96-ウェルプレートは、表 1に示唆されるようにプレートをセットアップする。次の表は、実験的なコントロールと3セットの NK 実験カラムを示しています。これは96プレートの NK 実験カラムを合計10個まで拡大することができます。
- 250 x gのアッセイプレートを4分間遠心し、エフェクタとターゲットセルが接触していることを確認します。96-ウェルプレートを37° c で加湿されたチャンバーインキュベーター内で5時間インキュベートし、5% co2 をエフェクター細胞による標的細胞およびエフェクターセルと標的細胞溶解との十分な接触を達成する。
注:プロトコルはここで一時停止することができます。 - 45分上清を収穫する前に、ターゲット細胞最大 LDH 放出ウェル (ウェル1E、1F、1G、1H) に10μ l を添加し、プレートを加湿チャンバ内に戻します。
- インキュベーション時間が終了したら、250 x gのプレートをマルチチャンネル Pipettor を使用して4分間遠心し、すべてのウェルから50μ l のアリコートを新鮮な96ウェルフラットボトムアッセイプレートに移します。
注:細胞が新鮮なアッセイプレートに移されないように、ウェルの底部に触れないでください。培養処理したプレートをフレッシュなアッセイプレートとして使用しないでください。 -
アッセイ試薬を作成します。
- アッセイバッファーが室温に達した後、12 mL のアッセイバッファーを1つの基板混合ボトルに追加します。反転し、完全に溶解するまで穏やかに振る。1ボトルは 2 96 ウェルプレートのために十分です。
注:アッセイバッファーは、解凍中に光から保護する必要があります。使用直前に混ぜます。
- アッセイバッファーが室温に達した後、12 mL のアッセイバッファーを1つの基板混合ボトルに追加します。反転し、完全に溶解するまで穏やかに振る。1ボトルは 2 96 ウェルプレートのために十分です。
- ステップ4.6 からのアッセイプレートのすべてのウェルに50μ l のアッセイ試薬を加えます。光から保護するためにホイルでプレートを覆い、室温で30分インキュベートします。
注:新しく作られた試金試薬はフリーザーで貯えられるべきである。試薬は約8週間有効です。 - 各井戸に50μ l の停止溶液を加えます。停止溶液を加えた後、1時間以内にプレートを読み取り、490 nm で吸光度を記録します。代表的なデータを表 2に示す。
5. 結果の計算
- 培養基のバックグラウンドウェルからの平均吸光度値を計算し、実験のためのすべての吸光度値から差し引く、標的細胞自発的 LDH 放出およびエフェクター細胞自発 LDH 放出井戸。
- ボリューム補正制御ウェルの平均吸光度値を計算し、ターゲットセル最大 LDH 放出制御ウェルについて取得された吸光度値から減算します。
- 次の式でステップ5.1 と5.2 の修正後の値を使用して、各エフェクタの細胞毒性率を計算します。
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Representative Results
NP 及びラップラットから得られた胎盤 NK 細胞を50:1 の割合でそれぞれの媒体中の標的細胞と共に5時間インキュベートした (NK: 標的)。吸光度は 490 nm で記録され、生データは表 2に示されている。培地背景と体積補正制御ウェルの平均吸光度を計算した。これらの平均値は、製造元のプロトコルに示されている適切なウェルから減算され、表 3に示します。次いで、修正された値を、製造業者によって提供されるプロトコルを使用して% 細胞傷害性を得るために使用した (表 4)。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
表 1: アッセイプレートのレイアウト。TCS = 標的細胞自発 LDH 放出 (50 μ l 標的細胞 + 50 μ l 標的細胞培地);TCM = ターゲットセルの最大 LDH 放出 (50 μ l の標的細胞 + 50 μ l 標的細胞培地);VCC = ボリューム補正制御 (50 μ l 標的細胞培地 + 50 μ l NK 細胞培地);CMB = 培地バックグラウンドコントロール (50 μ l 標的細胞培地 + 50 μ l NK 細胞培地);ECSR = エフェクター細胞自発放出 (50 μ l NK 細胞 + 50 μ l NK 細胞培地);EW = 実験ウェル (50 μ l の標的細胞 + 50 μ l の NK 細胞)。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Np | ラップ | Np | ||
| 0.615 | 0.484 | 0.473 | 0.463 | 0.471 |
| 0.586 | 0.484 | 0.458 | 0.474 | 0.469 |
| 0.61 | 0.486 | 0.464 | 0.459 | 0.469 |
| 0.578 | 0.495 | 0.478 | 0.458 | 0.482 |
| 0.605 | 0.55 | 0.524 | 0.526 | 0.543 |
| 0.576 | 0.504 | 0.519 | 0.502 | 0.528 |
| 0.565 | 0.512 | 0.515 | 0.513 | 0.531 |
| 0.563 | 0.581 | 0.526 | 0.508 | 0.519 |
表 2: YAC1 標的細胞に対する NP 及びラップラット由来の胎盤 NK 細胞の細胞傷害性を測定するための第1列及び第2段階の実験対照を含むアッセイプレートの生吸光度データ。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Np | ラップ | Np | ||
| 0.12775 | -0.01425 | -0.02425 | -0.01625 | |
| 0.09875 | -0.02925 | -0.01325 | -0.01825 | |
| 0.12275 | -0.02325 | -0.02825 | -0.01825 | |
| 0.09075 | -0.00925 | -0.02925 | -0.00525 | |
| 0.06825 | 0.03675 | 0.03875 | 0.05575 | |
| 0.03925 | 0.03175 | 0.01475 | 0.04075 | |
| 0.02825 | 0.02775 | 0.02575 | 0.04375 | |
| 0.02625 | 0.03875 | 0.02075 | 0.03175 |
表 3.修正された吸光度。製造業者のプロトコルに従ってコントロールウェルの平均吸光度を減算した後のウェルの吸光度。カラム1、ウェル1-4 は、TC absorbances 値-平均 CMB 吸光度値である。列1、ウェル5-8 は、TCM の吸光度値であり、平均 VCC 吸光度値です。
| Np | ラップ | Np | |
| 128.9916 | 108.8235 | 93.69748 | |
| 63.44538 | 118.9076 | 66.80672 | |
| 75.92593 | 72.75132 | 64.28571 | |
| 66.27907 | 63.17829 | 83.33333 | |
| 細胞毒性の平均% | 83.66049 | 90.91518 | 77.03081 |
表 4.細胞毒性計算。NP およびラップラットから単離された胎盤 NK 細胞の複製サンプルの細胞毒性の平均% である。
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Discussion
最適な結果を得られるように考慮すべき重要事項がいくつかあります。利用される細胞の無菌性は非常に重要である。胎盤の採取の後、NK 細胞の調製および単離がバイオセーフティキャビネットの無菌条件下で行われることが重要です。さらに、すべての細胞が細胞損傷によって LDH を放出するので、分離後および共培養プロセス中に NK 細胞の高い生存率を得るために注意が必要である。NK 細胞からの自然な LDH 放出が多すぎると、しばしば陰性で使用できないデータが生じることがある
このプロトコルには、ユーザーとそのニーズに固有のいくつかの側面があります。例えば、この記事では、機械的および酵素的分解などの方法に加えて胎盤からの単核細胞の単離のための様々な方法がある。さらに、最適な標的細胞数およびエフェクターを決定するためにユーザが、それらの実験に適するであろう目標比である。我々の手では、1万の標的細胞およびエフェクター: 50:1 の標的比は、我々の実験に最適であると判定された。これらの数は、選択された標的細胞および NK 細胞が単離される組織に応じて変化し得る。他の研究者は、肝臓および脾臓9から分離された細胞の NK 機能を評価するためにこの方法を利用している。したがって、この方法は、我々がそれを使用することを選択したように、子癇前症の研究だけでなく、研究の様々な分野で採用することができる。
細胞毒性評価に関する金本位は、クロム放出アッセイ5である。この方法は信頼性が高く、再現性がありますが、最も明白な制限は、人員と放射性廃棄物に対する放射性暴露リスクの使用です。他の、フローサイトメトリーベースおよび calcien 放出アッセイのような非放射性細胞毒性アッセイは、CRA6、10、11に匹敵する結果を有することが報告されている。ただし、フローサイトメトリーベースのアッセイでは、分析を実行するためにフローサイトメトリーの担当者に専門トレーニングを追加する必要があります。LDH 放出アッセイは、アッセイを実行するために単純なピペット操作のみを必要とするため、専門のトレーニングを必要としません。さらに、LDH 放出アッセイは、標準的な分光分析または蛍光検出を使用して利用することができるが、calcien 放出およびフローサイトメトリーベースの方法は、蛍光を検出できる装置を必要とする。LDH 放出アッセイの制限は、損傷した細胞からの LDH の不完全な放出による細胞死の過小評価を含む。
このアッセイでは、培地に放出された LDH の測定は、iodonitrotetrazolium (ジフェニルテトラゾリウム塩) がホルマザン (赤色の色) に変換される酵素反応によって起こる。吸光度は標準的な分光法によって測定され、文化の損傷された細胞の量は赤い色の強度に比例している。このアッセイは、サンプル中の損傷した細胞または傷ついたセルを正確に測定することを可能にします。最後に、この比色アッセイはまた、他の細胞型と共に、細胞媒介性ならびに化学的媒介性のメカニズムを介して生じた細胞毒性をアッセイするために使用することができる。
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Disclosures
利益相反、金銭的またはその他の利害関係は、著者によって宣言されていません。
Acknowledgments
この研究は、グラント R00HL130456 の下で国立衛生研究所の国立心臓肺と血液研究所によってサポートされていました, 国立衛生研究所の P20GM104357 賞の下で, そして、ミシシッピ INBRE は、認可番号 P20GM103476 の下で国立衛生研究所の一般医学研究所からの制度的開発賞 (アイデア) によって資金を提供されました。コンテンツは、著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
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