Summary
在这里, 我们提供了一个详细的方法, 以分离和评估细胞毒性功能的自然杀伤细胞从胎盘通过比色板分析。选择减少子宫灌注压力大鼠胎盘缺血模型, 以证明其抗体介导的分离和对自然杀伤细胞细胞毒性功能的评估。
Abstract
众所周知, 决定性自然杀伤细胞 (NK) 在正常妊娠的建立和维持中发挥着至关重要的作用。最近的研究表明, 患有反复流产和先兆子宫炎等不良妊娠并发症的妇女的循环和卵形 NK 细胞数量发生了变化。我们组的研究表明, 根据表面激活标记的表达, 妊娠期高血压与胎盘中激活的 NK 细胞数量增加有关。本手稿提供了一个详细的方案, 以评估从胎盘分离出的 NK 细胞的细胞毒性功能, 在手术诱导的胎盘缺血的前激素样动物模型中。详细介绍了以下步骤: 单细胞悬浮液的产生、NK 细胞分离、体外刺激、效应因子: 靶细胞共培养和细胞毒性试验。
Introduction
先兆子宫炎是一种妊娠期高血压疾病, 其特征是胎儿生长受限、终末期器官损伤和慢性免疫激活。先兆子宫炎妇女的慢性免疫激活导致循环和胎盘炎性细胞因子增加, CD4+ t 细胞数量不平衡, 激活的自然杀手 (nk) 细胞1的数量增加。我们实验室最近发表的研究表明, 在子宫炎先兆大鼠模型中, NK 细胞在引起一些与先兆子宫炎相关的病理生理学方面发挥了重要作用。采用流式细胞仪测量 NK 细胞活化标记的表面表达, 观察到与正常怀孕大鼠相比, RUPP 大鼠在循环和胎盘中激活的 NK 细胞数量增加2。
为证实流式细胞仪观察结果, 进行了功能研究, 以评估从 NP 和 RUPP 大鼠胎盘分离出的 NK 细胞的细胞毒性活性。有几种方法可用于评估细胞毒性 CD8+ t 细胞和 nk 细胞的细胞毒性功能。功能细胞毒性分析的黄金标准是铬释放分析3。其他使用的协议包括流式细胞术4, 图像细胞术5, 钙素释放6, 最近的生物发光7。本视频将提供一个详细的协议, 使用成熟的乳酸脱氢酶 (LDH) 释放检测测量 NK 细胞的细胞毒性功能使用一个商业上可用的 LDH 细胞毒性检测试剂盒。
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Protocol
所有协议都得到了密西西比大学医学中心动物护理和使用机构委员会的批准。对这些动物的护理和处理符合国家卫生研究院关于合乎道德的动物治疗的指导方针。
1. 胎盘淋巴细胞分离
- 从大鼠子宫中取出一个胎盘 (怀孕第19天), 放在10毫升的冰凉 PBS8中。
- 将一个胎盘放在100μm 的过滤器上, 放在含有13.5 毫升 RPMI 和 1.5 mL FBS (总体积为 15 mL) 的培养皿中。使用注射器柱塞的扁平侧将胎盘通过过滤器推入培养皿。
- 为每个组织准备三个15毫升锥形管。在每个管中加入3毫升密度梯度介质 (见材料表), 然后小心地将5毫升的均质胎盘覆盖到每个管中。
- 在室温 (RT) 下, 在 300 x克的温度下离心 25分钟, 无需刹车.收集薄薄的白色蓬松层与转移移液器。
请注意:离心后可见3层, 顶部为红色 RPMI, 中间可见白色的模糊层, 底部可见清晰的密度梯度介质层。使用转移移液器从管中拉出白色的起泡层。将同一胎盘的所有管中的蓬松层结合成1管。 - 添加10毫升 RPMI 到混合的混合的混合层。在4°C 下离心 10分钟, 300 x克,并丢弃上清液。
2. 天然杀伤细胞的分离
- 冰凉 PBS 50Μl 中的再补给细胞颗粒
- 根据制造商的协议, 在颗粒细胞中加入生物素标记的 CD3 抗体, 并与移液器充分混合。将管放在管式旋转器中, 在4°C 下孵育20分钟。
- 加入1毫升 RPMI, 在 400 x g和4°c 下离心 10分钟, 并丢弃上清液。
- 在 RPMI 的1毫升中再利用颗粒, 并与150μl 的磁珠在 1.5 mL 微离心管中结合。将微离心管放置在管旋转器中, 在4°C 下孵育30分钟时旋转。
请注意:此时拉出释放缓冲, 并允许在生物安全柜中到达 RT。 - 将管子放入磁铁中 1分钟, 收集上清液, 并在冰上15毫升管中保存 CD3 细胞群。
请注意:这是 CD3-细胞的数量。 - 从磁铁中取出管, 加入1毫升的 RPMI。用移液器混合细胞和珠子5次。
- 重复步骤2.5。
- 在 400 x g和4°c 条件下离心 cd3 细胞----细胞种群 10分钟, 并丢弃上清液.在50Μl 的冰凉 PBS 中重新弹性细胞颗粒
- 根据制造商的协议, 在 CD3细胞中加入生物素标记的 CD161a 抗体, 搅拌良好。将管放在管式旋转器中, 在4°C 下孵育20分钟。
- 加入1毫升 RPMI, 在 400 x g和4°c 下离心 10分钟, 并丢弃上清液。在 RPMI 的1毫升中再利用颗粒, 并与150μl 的磁珠在 1.5 mL 微离心管中结合。
- 将微离心管放入管旋转器中, 在4°C 下孵育30分钟时旋转。
- 将管子放入磁铁中 1分钟, 收集上清液并丢弃 CD3-/cd161a细胞.
- 从磁铁中取出管子, 加入1毫升的 RPMI。用移液器混合细胞和珠子5次。
- 重复步骤2.12。
- 从磁铁中取出微离心管, 加入1毫升的 RT 释放缓冲液。将管放在管旋转器上, 在 RT 孵育15分钟时旋转。
- 将管子放入磁铁中 1分钟, 在冰上的新的15毫升锥形管中收集上清液。
请注意:这是 NK 细胞的数量。 - 从磁铁中取出管子, 加入1毫升的 RT RPMI。用移液器混合细胞和珠子5次。
- 重复步骤 2.16, 将上清液放入同一管中。混合好, 取20Μl 样品对细胞进行计数
请注意:把管子放在冰上。 - 离心 CD3-/cd161a + 细胞 10分钟, 400xg 在4°c 下, 然后去除上清液. 在 RPMI 中重新移植细胞 (10% FBS, 1% Pen/Strep, 2 ng/ml il-2), 并在 2.5 mL Nk 细胞培养基的6孔板中种子浓度为 3 x 10 5 细胞。在37°c 下孵育细胞 48小时, 在加湿孵化器中孵育 5% co 2.
3. 细胞毒性检测: 从培养或传递细胞中回收 NK 细胞或 YAC1
请注意:所有步骤都必须在引擎盖下进行。所有的细胞管都必须时刻保持在冰上。
- 使用玻璃血清学管道从烧瓶中收集 YAC1 细胞和培养基, 放置在冰上的50毫升管中, 并混合良好。取20Μl 计数细胞。
- 在 300 x g和4°c 下旋转 YAC1 细胞10分钟。在细胞旋转时对其进行计数。
- 在 NK 细胞6井板中的每口井中加入胰蛋白酶. edta。点击盘子, 放在孵化器里。
- 在37°c 条件下, 用胰蛋白酶培养约 5分钟, 用无菌板刮刀刮板/瓶。在每口井中添加1毫升的 NK 细胞培养基。
- 用血清学管道收集细胞和培养基, 收集在15毫升的离心管中。取20Μl 计数细胞。
- 在4°C 下旋转 NK 电池 10分钟, 400 x g. 在离心过程中, 从3.5 步计算细胞样本。
请注意:在丢弃培养板之前, 请先在显微镜下查看培养板, 以确保井底没有更多的细胞粘附在这些培养板上。由于实验使用 NK 细胞和 YAC1 细胞, 请务必分别对每个细胞进行计数。 - 在优化试验中确定的浓度下计数细胞并重新悬浮, 以测试适当数量的目标: 效应比。这将通过在相应的培养基中重新悬浮颗粒来实现: YAC1 在 4 x10细胞/细胞和 nk 细胞在 2 x 10 7 细胞/ml 处的浓度.
4. 细胞毒性检测: 检测协议
- 使用圆底, 培养处理96孔板设置板, 如表 1所示。下表显示了实验控件和3组 NK 实验列。这可以在96孔板中扩展到总共 10个 NK 实验柱。
- 将检测板离心为 250 x g, 每次 4分钟, 以确保效应细胞和目标细胞接触。在37°c 的加湿室孵化器中孵育96孔板 5小时, 使目标细胞和效应细胞之间充分接触,并通过效应细胞进行靶细胞裂解。
请注意:协议可以在这里暂停。 - 在收获上清液前 45分钟, 在目标细胞最大 LDH 释放井 (Wells 1E、1E、1E 和 1E) 中加入10Μl 的10倍裂解溶液, 并将板材放回加湿室。
- 孵育时间完成后, 以 250 x克的速度离心板, 用多通道移液器将50μl 的等价物从所有油井转移到新的96井平底检测板上。
请注意:不要触摸井底, 以免细胞转移到新鲜的检测板。不要使用培养的经过处理的板作为新鲜的检测板。 -
制造检测试剂。
- 检测缓冲液达到室温后, 将12毫升的检测缓冲液添加到一个基板混合瓶中。反转并轻轻摇晃, 直到完全溶解。1瓶足够两个96孔的盘子。
请注意:检测缓冲区应在解冻时免受光线的照射。使用前立即混合。
- 检测缓冲液达到室温后, 将12毫升的检测缓冲液添加到一个基板混合瓶中。反转并轻轻摇晃, 直到完全溶解。1瓶足够两个96孔的盘子。
- 从步骤4.6 开始, 在检测板中的所有油井中加入50μl 的检测试剂。用铝箔覆盖盘子, 以保护其免受光线的照射, 并在室温下孵育30分钟。
请注意:新制造的检测试剂应存放在冰柜中。试剂的有效期约为8周。 - 在每口井中加入50μl 的停止溶液。添加停止解决方案后1小时内读取板, 并将吸收率记录在 490 nm。代表性数据见表 2。
5. 结果的计算
- 计算培养基背景井的平均吸收值, 并从实验、目标细胞自发 LDH 释放和效应细胞自发性 LDH 释放井的所有吸收值中减去。
- 计算体积校正控制井的平均吸收值, 并从目标单元最大 LDH 释放控制井获得的吸收值中减去。
- 使用以下公式中步骤5.1 和5.2 中的更正值计算每个效应的百分比细胞毒性: 目标井。
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Representative Results
从 NP 大鼠和 RUPP 大鼠身上获得的胎盘 NK 细胞在各自的培养基中以 50:1 (NK:1: 靶向) 的比例孵育了5小时。吸收量记录在490纳米, 原始数据见表 2。计算了培养基背景和体积校正控制井的平均吸收率。这些平均数是从制造商协议中指出的适当井中减去的, 如表 3所示。然后使用制造商提供的协议 (表 4), 使用修正后的值获取% 的细胞毒性。
| 1 | 2 | 3个 | 4个 | 5 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| 中医 | 中巴 | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| 中医 | 中巴 | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| 中医 | 中巴 | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| 中医 | 中巴 | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
表 1: 检测板布局.TCS = 靶细胞自发 LDH 释放 (50μl 靶细胞 + 50μl 靶细胞培养基);TCM = 靶细胞最大 LDH 释放 (50μl 靶细胞 + 50Μl 靶细胞培养基);VCC = 体积修正控制 (50μl 靶细胞培养基 + 50μl NK 细胞培养基);CMB = 培养基背景控制 (50μl 靶细胞培养基 + 50μl NK 细胞培养基);ESSR = 效应细胞自发释放 (50μl NK 细胞 + 50μl NK 细胞培养基);EW = 实验井 (50μl 靶细胞 + 50μl NK 细胞)。
| 1 | 2 | 3个 | 4个 | 5 |
| Np | 鲁普 | Np | ||
| 0.615 | 0.484 | 0.473 | 0.4 63 | 0.471 |
| 0.586 | 0.484 | 0.458 | 0.474 | 0.469 |
| 0.61 | 0.486 | 0.464 | 0.459 | 0.469 |
| 0.578 | 0.495 | 0.478 | 0.458 | 0.482 |
| 0.605 | 0.55 | 0.524 | 0.526 | 0.543 |
| 0.576 | 0.504 | 0.519 | 0.502 | 0.528 |
| 0.565 | 0.512 | 0.515 | 0.513 | 0.531 |
| 0.563 | 0.581 | 0.526 | 0.508 | 0.519 |
表 2: 含有第1栏和第2栏实验控制的检测板和实验井的原始吸收率数据, 用于测量 NP 大鼠和 RUPP 大鼠胎盘 NK 细胞对 YAC1 靶细胞的细胞毒性。
| 1 | 2 | 3个 | 4个 | 5 |
| Np | 鲁普 | Np | ||
| 0.12775 | -0.01425 | -0.02425 | -0.01625 | |
| 0.09875 | -0.02925 | -0.01325 | -0.01825 | |
| 0.12275 | -0.02325 | -0.02825 | -0.01825 | |
| 0.09075 | -0.00925 | -0.02925 | -0.00525 | |
| 0.06825 | 0.03675 | 0.03875 | 0.05575 | |
| 0.03925 | 0.03 175 | 0.01475 | 0.04075 | |
| 0.02825 | 0.02775 | 0.02575 | 0.04375 | |
| 0.02625 | 0.03875 | 0.02075 | 0.03 175 |
表3。已更正吸收.根据制造商的协议, 控制井平均吸收率减去后的井的吸收率。第1栏, Wells 1-4, 是 TCS 吸收值-平均 CMB 吸收值。第1栏, 威尔斯 5-8, 是中医吸收值--平均 VCC 吸收值。
| Np | 鲁普 | Np | |
| 128.9916 | 108. 8235 | 93.69748 | |
| 63.44538 | 118.9076 | 66.80672 | |
| 7.592593 | 7.75 132 | 64.28571 | |
| 662.907 | 63.17829 | 83.33333 | |
| 平均百分比细胞毒性 | 83.66049 | 90.91518 | 77. 03081 |
表4。细胞毒性计算.从 NP 大鼠和 RUPP 大鼠分离的胎盘 NK 细胞复制样本的平均细胞毒性百分比。
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Discussion
为了获得最佳效果, 有许多重要的关键注意事项需要考虑。所利用的细胞的不育是非常重要的。在收集胎盘后, 重要的是在生物安全柜的无菌条件下制备和隔离 NK 细胞。此外, 由于所有细胞在细胞损伤时都会释放 LDH, 因此应注意在分离后和共培养过程中获得高活力的 NK 细胞。NK 细胞中过多的自发 LDH 释放通常会导致负面的、无法使用的数据
此协议的某些方面将特定于用户及其需求。例如, 除了本文中的方法外, 还有各种从胎盘中分离单个核细胞的方法, 如机械和酶分解。此外, 它是由用户来确定最佳的目标细胞数量和效应器: 目标比率, 这将是适合他们的实验。在我们手中, 10, 000个靶细胞和一个效应因子: 目标比率50:1 被确定为我们实验的最佳选择。这些数字可能会根据所选择的目标细胞和 NK 细胞被分离的组织而改变。其他研究者利用这种方法评估从肝脏和脾脏9分离出的细胞的 NK功能。因此, 这种方法可以应用于各个领域的研究, 而不仅仅是我们选择使用的先兆子痫的研究。
细胞毒性评估的黄金标准是铬释放法5。虽然这种方法是可靠和可重复的, 但最明显的限制是对人员和放射性处置使用放射性暴露风险。据报道, 其他非放射性细胞毒性检测, 如流式细胞仪和钙释放检测, 其结果与 cra6、10、11 相当.然而, 基于流式细胞仪的检测需要额外的流式细胞仪人员的专门培训来进行检测。LDH 释放检测不需要任何专门的培训, 因为这种测试只需要简单的移液来进行检测。此外, 虽然 LDH 释放分析可以使用标准光谱或荧光检测, 但钙化释放和基于荧光细胞仪的方法需要能够检测荧光的设备。LDH 释放分析的局限性包括低估了受损细胞不完全释放 LDH 导致的细胞死亡。
在这种检测中, 释放到培养基中的 LDH 的测量是通过酶反应进行的, 在这种反应中, 碘硝基四唑 (四唑盐) 被转化为福尔扎赞 (红色)。吸收率是用标准光谱测量的, 培养中受损细胞的数量与红色的强度成正比。这种检测可以准确地测定样品中受损或受伤的细胞。最后, 这种比色测定也可与其他细胞类型一起用于检测通过细胞介导的细胞毒性以及化学介导的机制。
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Disclosures
提交人没有宣布任何经济或其他利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院国家心脏肺和血液研究所的支持, 该研究所获得了 R00HL130456 赠款, 国家卫生研究院普通医学科学研究所获得了 P20GM104357 奖, 并得到了密西西比州 INBRE, 由国家卫生研究院国家普通医学研究所颁发的机构发展奖 (IDeA) 资助, 赠款号为 P20GM103476。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
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