Summary
여기, 우리는 분리 하 고에서 자연 킬러 세포의 세포 독성 기능을 평가 하는 상세한 방법론을 제공 합니다. 비 색 판 분석에 의해. 태 반 허 혈의 감소 된 자 궁 관류 압력 쥐 모형은 천연 킬러 세포의 세포 독성 기능의 항 체 매개 분리 및 평가를 입증 하기 위해 선택 되었다.
Abstract
의사는 정상적인 임신의 확립과 유지에 중요 한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근의 연구에의 하면 재발 성 유산 및 자간 전 증과 같은 임신 합병증을 앓고 있는 여성들의 순환 및 의사 이중 NK 세포의 변화 된 인구가 입증 되었다. 우리 그룹의 연구는 임신 중 고혈압이 표면 활성화 마커의 발현을 기반으로 태 반에 활성화 된 NK 세포의 증가 된 인구와 연관 된다는 것을 보여주었습니다. 이 원고는 수술로 유도 된 태 반 허 혈의 자간 전 증 유사 동물 모델에서와 같이, 장소에서 분리 된 NK 세포의 세포 독성 기능을 평가 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 한다. 다음 단계는 상세히 설명 된다: 단일 세포 현 탁 액의 생성, NK 세포 분리, 전 생체 자극, 이펙터: 표적 세포 공동 배양 및 세포 독성 분석 법.
Introduction
자간 전 증은 태아 성장 제한, 말단 장기 손상 및 만성 면역 활성화를 특징으로 하는 임신의 고혈압 질환 이다. 자간 전 증을 가진 여성에서의 만성 면역 활성화는 증가 된 순환 및 태 반 염증 성 사이토카인, CD4+ T 세포 집단의 불균형 및 활성화 된 천연 킬러 (NK) 세포의 증가 된 인구에 이르게 한다1. 우리 연구실에서 최근에 출판 된 연구는 자간 전 증의 자 궁 내 관류 압력 (파열)을 자간 전 증과 관련 된 일부 병 리 생리학의 원인에서 NK 세포에 대 한 역할을 증명 한다. 유 세포 분석을 이용 하 여 NK 세포에 대 한 활성화 마커의 표면 발현을 측정 하 고, 정상 임신 (NP) 쥐에 비하여 파열 된 랫 트의 순환 및 위치에서 활성화 된 NK 세포의 증가 된 인구가 관찰 되었다2.
유 세포 분석 관찰을 확인 하기 위해, 플 래 트에서 분리 된 NK 세포의 세포 독성 활성을 평가 하는 기능적 연구가 NP 및 파열 쥐의 수행 되었다. CD8+ T 세포 및 NK 세포의 세포 독성 기능에 대 한 평가에 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있다. 기능적 세포 독성 분석을 위한 금 표준은 크롬 방출 검정3이다. 사용 되는 기타 개발 된 프로토콜은 유 세포 분석4, 이미지 분석5, calcein 릴리즈6및 가장 최근의 생물 발광7을 포함 한다. 본 영상은 상업적으로 입수 가능한 LDH 세포 독성 분석 키트를 이용 하 여 잘 확립 된 락 테이 트 탈 수소 효소 (LDH) 방출 분석을 이용 하 여 NK cell의 세포 독성 기능을 측정 하는 자세한 프로토콜을 제공할 것 이다.
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Protocol
모든 프로토콜은 미시시피 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 동물의 치료와 취급은 윤리적 동물 치료를 위한 건강 지침의 국가 학회와 일치 했습니다.
1. 림프 구 세포 분리
- 쥐 자 궁 (임신 일 19)에서 태 반을 제거 하 고 얼음 차가운 PBS8의 10ml에 넣습니다.
- 100 µm 필터에 1 개의 태 반을 놓고 RPMI 13.5 mL 및 1.5 mL의 FBS를 함유 하는 페 트리 디쉬에 앉 습니다 (총 부피는 15ml). 주사기 플런저의 평평한 면을 사용 하 여 태 반을 필터를 통해 페 트리 접시에 밀어 넣으십시오.
- 각 조직에 대 한 3 15 mL 원뿔 튜브를 준비 합니다. 각 튜브에 3 mL 밀도 구배 매체 ( 재료 표참조)를 넣고 각 튜브에 5 ml의 균질 한 태 반을 조심 스럽게 겹쳐 놓습니다.
- 브레이크 없이 실 온 (RT)에서 300 x g 에서 25 분 동안 원심 분리기. 전사 파이 펫을 사용 하 여 얇은 흰색 버 레이어 를 수집 합니다.
참고: 원심 분리 후에는 3 층이 보이고, 상단에는 적색 rpmi가, 중간에는 흰색 버 층, 하단에는 투명 한 밀도 그라데이션 매체 레이어가 있습니다. 전사 파이 펫을 사용 하 여 튜브에서 흰색 버 층을 당깁니다. 동일한 태 반의 모든 튜브에서 버 층을 1 튜브로 결합 하십시오. - 결합 된 버 층에 10ml의 rpmi를 추가 합니다. 10 분간 원심 분리기, 300 x g, 4°c에서 상층 액을 버리십시오.
2. 자연 살해 세포의 분리
- 얼음-저온 PBS의 50 μ l에서의 소생 세포 펠 렛
- 비오 틴-표지 된 CD3 항 체를 펠 라이 셀에 추가 하 여 제조업체의 프로토콜에 따라 피 펫과 잘 섞어 줍니다. 튜브를 튜브로 테이터에 넣고 4°c에서 20 분간 배양 한다.
- RPMI 1 mL을 넣고, 400 x g 및 4°c에서 10 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 버리십시오.
- RPMI 1 mL의 소생 펠 렛을 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 150 μ l의 자기 비드와 결합 합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브를 튜브 회전자에 놓고 4°c에서 30 분 동안 배양 하 여 회전 시킵니다.
참고: 이 때 방출 버퍼를 꺼내 생물학적 안전 캐비닛에 RT에 도달 할 수 있습니다. - 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 상층 액을 수집 하 고 얼음에 15 mL 튜브에 CD3 세포 집단을 저장 합니다.
참고: 이것은 CD3 세포 의 인구입니다. - 자석에서 튜브를 분리 하 고 RPMI 1 mL을 추가 합니다. 세포와 구슬을 5 회 파이 펫과 섞어 줍니다.
- 2.5 단계를 반복 합니다.
- 400 x g 및 4°c에서 10 분 동안 세포의 CD3를 원심 분리 하 고 상층 액을 버리십시오. 얼음-저온 PBS의 50 μ l에서 세포 펠 렛의 소생
- 비오 틴-라벨링 된 CD161a 항 체 를 제조사의 프로토콜에 따라 CD3 세포에 첨가 하 고 잘 섞어 줍니다. 튜브를 튜브로 테이터에 놓고 4°c에서 20 분 동안 배양 한다.
- RPMI 1 mL을 넣고, 400 x g 및 4°c에서 10 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 버리십시오. RPMI 1 mL의 소생 펠 렛을 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 150 μ l의 자기 비드와 결합 합니다.
- 마이크로 원심 분리기 튜브를 튜브 회전자에 넣고 4°c에서 30 분 동안 배양 하 여 회전 시킵니다.
- 튜브를 자석에 1 분 동안 놓습니다. 상층 액을 모으고 CD3-/Cd161a- 세포를 버리십시오.
- 자석에서 튜브를 제거 하 고 RPMI 1 mL을 추가 합니다. 세포와 구슬을 5 회 파이 펫과 섞어 줍니다.
- 2.12 단계를 반복 합니다.
- 자석에서 마이크로 원심 분리기 튜브를 제거 하 고 1 mL의 RT 방출 완충 제를 추가 하십시오. 튜브 회전자에 튜브를 놓고 RT에서 15 분 동안 배양 하는 동안 회전 합니다.
- 1 분간 자석에 튜브를 놓습니다. 얼음에 새로운 15 mL 원추형 튜브에 상층 액을 수집 합니다.
참고: 이것은 NK 세포의 인구입니다. - 자석에서 튜브를 제거 하 고 RT RPMI 1 mL을 추가 합니다. 세포와 구슬을 5 회 파이 펫과 섞어 줍니다.
- 2.16 단계를 반복 하 여 동일한 튜브에 상층 액을 배치 합니다. 잘 섞어 20 μ l 샘플을 복용 하 여 세포 수를 계산 합니다
참고: 얼음에 튜브를 보관 하십시오. - 원심 분리기 CD3-/cd161a+ 세포를 4°c에서 10 분, 400 x g , 상층 액을 제거 한다. 세포를 RPMI (10% FBS, 1% 펜/Strep, 2ng/mL)로 하 고, 2.5의 NK 세포 활성화 매체에 있는 6 웰 플레이트에서 3 x 105cell/웰의 농도로 종자를 소생 한다. 37 ° c에서 48 h의 세포 배양,가 습 인큐베이터 에서 5% co2.
3. 세포 독성 분석: 배양 또는 전달 세포에서 NK 세포 또는 YAC1 검색
참고: 모든 단계는 내부적으로 수행 되어야 합니다. 모든 세포 관은 항상 얼음에 보관 해야 합니다.
- 유리 혈 청 학적 pipet을 사용 하 여 플라스 크에서 YAC1 세포 및 매체를 수집 하 고 얼음에 50 mL 튜브에 넣고 잘 섞어 줍니다. 셀 수를 계산 하기 위해 20 µ L을 복용 하십시오.
- 300 x g 및 4°c에서 10 분 동안 YAC1 세포를 회전 시킵니다. 회전 하는 동안 셀 수를 계산 합니다.
- NK 셀 6 웰 플레이트에서 각 웰에 트립 신/EDTA를 추가 하십시오. 플레이트를 탭 하 고 인큐베이터에 배치 합니다.
- 세포 후 37 ° c에서 ~ 5 분 동안 트립 신/EDTA로 배양 한 후, 멸 균 플레이트 스 크레이 퍼로 플레이트/플라스 크를 긁어 낸다. 각 웰에 1 mL의 NK 세포 배지를 추가 합니다.
- 혈 청 피 펫으로 세포와 매체를 모으고 15 mL 원심 분리기 튜브에 수집 하십시오. 셀 수를 계산 하기 위해 20 µ L을 복용 하십시오.
- NK 세포를 4°c에서 10 분, 400 x g 로 회전 시켰다. 이 원심 분리 동안 3.5 단계에서 세포의 샘플을 카운트.
참고: 웰의 바닥에 더 이상 부착 된 세포가 없는지 확인 하기 위해이를 폐기 하기 전에 현미경으로 배양 판을 봅니다. 이 실험은 NK 세포와 YAC1 세포를 사용 하기 때문에 각각 따로계산 해야 합니다. - 최적화 실험에서 결정 된 농도의 세포 및 소생을 카운트 하 여 적절 한 개수의 타겟: 이펙터 비율을 시험 한다. 이것은 그들의 상응 하는 매체에서 펠 릿을 재 현 탁 하 여 다음 세포 농도를 확인 함으로써 달성 될 것 이다: YAC1 세포/m l 및 NK 세포에서 2x107 세포/ml에 4 x 10.
4. 세포 독성 분석: 분석 프로토콜
- 표 1에 제시 된 바와 같이 둥근 바닥, 배양 처리 된 96-웰 플레이트를 사용 하 여 플레이트를 설치 한다. 이 표는 실험 대조 군 및 3 개의 NK 실험 칼럼 세트를 보여준다. 이는 96-웰 플레이트에서 총 10 개의 NK 실험 칼럼으로 확장 될 수 있다.
- 상기 분석 판을 250 x g 에서 4 분간 원심 분리 하 여 이펙터와 표적 세포가 접촉 하 고 있는지를 확실 하 게 한다. 37 ° c에서가 습 챔버 인큐베이터에서 5 시간 동안 96-웰 플레이트를 배양 하 고, 5 % co2는 타겟과 이펙터 세포 간의 충분 한 접촉을 달성 하 고 이펙터 세포에의 한 표적 세포 용 해를 실현 하였다.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 45 수확 하기 전에 상층 액, 10 µ L의 용 해 용액을 대상 셀에 최대 LDH 방출 웰 (우물 1E, 1F, 1G 및 1H)을 넣고가 습 챔버에 다시 플레이트를 배치 한다.
- 인큐베이션 시간이 완료 된 후에, 플레이트를 250 x g 에서 4 분간 원심 분리 하 여 µ를 사용 하 여, 모든 웰에서 50을 이송 하 여 새로운 96-웰 플랫 바 텀 분석 플레이트를 이용 한다.
참고: 세포가 신선한 분석 판으로 전달 되지 않도록 우물의 바닥을 만지지 마십시오. 배양 처리 된 플레이트를 신선한 분석 플레이트로 사용 하지 마십시오. -
분석 시 약을 만듭니다.
- 분석 버퍼가 실 온에 도달한 후에는 1 개의 기질 혼합 병에 12 mL의 분석 버퍼를 추가 하십시오. 완전히 녹을 때까지 부드럽게 흔들어 주세요. 1 병은 2 96-웰 플레이트에 충분 합니다.
참고: 분석 완충 액은 해 동 되는 동안 빛 으로부터 보호 되어야 한다. 사용 직전에 섞어 주세요.
- 분석 버퍼가 실 온에 도달한 후에는 1 개의 기질 혼합 병에 12 mL의 분석 버퍼를 추가 하십시오. 완전히 녹을 때까지 부드럽게 흔들어 주세요. 1 병은 2 96-웰 플레이트에 충분 합니다.
- 4.6 단계에서 분석 플레이트의 모든 웰에 50 µ L의 분석 시 약을 추가 하십시오. 빛 으로부터 보호 하 고 실 온에서 30 분 동안 배양 하는 호 일로 플레이트를 덮으 십시오.
참고: 새로 만든 분석 시 약은 냉동 실에 보관 해야 합니다. 약 8 주 동안 시 약이 좋습니다. - 각 웰에 50 µ L 중지 솔루션을 추가 합니다. 중지 용액을 추가 한 후 1 시간 이내에 플레이트를 판독 하 고 490 nm에서 흡 광도를 기록 한다. 대표적인 데이터는 표 2에 나타내 었 다.
5. 결과 계산
- 배양 배지 배경 웰 로부터 평균 흡 광도 값을 계산 하 고, 실험 대상 세포 자발적인 LDH 방출 및 이펙터 세포 자발적인 LDH 방출 웰에 대 한 모든 흡 광도 값 으로부터 감산 한다.
- 볼륨 보정 제어 웰에 대 한 평균 흡 광도 값을 계산 하 고 최대 LDH 방출 제어 웰을 대상 셀에 대해 획득 한 흡 광도 값에서 뺍니다.
- 다음 공식에서 5.1 단계 및 5.2 단계의 수정 된 값을 사용 하 여 각 이펙터에 대 한 세포 독성 퍼센트를 계산 합니다: 대상 웰.
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Representative Results
NP 및 파열 된 랫 트에서 얻어진 태 반 NK 세포는 50:1 (NK: target)의 비율로 각각의 매개체에서 표적 세포와 함께 5 시간 동안 인큐베이션 되었다. 흡 광도는 490 nm에서 기록 하였으며, 원시 데이터는 표 2에 나타내 었 다. 배양 배지 배경의 평균 흡 광도와 부피 보정 제어 웰을 계산 하였다. 이러한 평균은 제조자의 프로토콜에 표시 된 적절 한 웰 로부터 감산 되 고 표 3에 표시 된다. 그 후 수정 된 값은 제조자에 의해 제공 된 프로토콜을 이용 하 여% 세포 독성을 구하는 데 사용 되었다 (표 4).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcm | Cmb | -1 | -2 | -3 |
| Tcm | Cmb | -1 | -2 | -3 |
| Tcm | Cmb | -1 | -2 | -3 |
| Tcm | Cmb | -1 | -2 | -3 |
표 1: 플레이트 레이아웃 분석. TC = 타겟 세포 자발적인 LDH 방출 (50 μ l 표적 세포 + 50 μ l 표적 세포 배지); TCM = 표적 세포 최대 LDH 방출 (50 μ l 표적 세포 + 50 μ l 표적 세포 배지); VCC = 부피 보정 제어 (50 μ l 표적 세포 배지 + 50 μ l NK 세포 배지); CMB = 배양 배지 배경 제어 (50 μ l 표적 세포 배지 + 50 μ l NK 세포 배지); ECSR = 이펙터 세포 자발적 방출 (50 μ l nk 세포 + 50 μ l NK 세포 배지); EW = 실험 우물 (50 μ l 표적 세포 + 50 μ l NK 세포).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Np | 렆 | Np | ||
| 0.615 | 0.484 | 0.473 | 0.463 | 0.471 |
| 0.586 | 0.484 | 0.458 | 0.474 | 0.469 |
| 0.61 | 0.486 | 0.464 | 0.459 | 0.469 |
| 0.578 | 0.495 | 0.478 | 0.458 | 0.482 |
| 0.605 | 0.55 | 0.524 | 0.526 | 0.543 |
| 0.576 | 0.504 | 0.519 | 0.502 | 0.528 |
| 0.565 | 0.512 | 0.515 | 0.513 | 0.531 |
| 0.563 | 0.581 | 0.526 | 0.508 | 0.519 |
표 2: 실험 컨트롤을 포함 하는 분석 판의 원시 흡 광도 데이터를 1, 2 및 실험 우물에서 YAC1 표적 세포에 대항하 여 NP 및 파열 된 쥐 로부터 태 반 NK 세포의 세포 독성을 측정 하였다.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Np | 렆 | Np | ||
| 0.12775 | -0.01425 | -0.02425 | -0.01625 | |
| 0.09875 | -0.02925 | -0.01325 | -0.01825 | |
| 0.12275 | -0.02325 | -0.02825 | -0.01825 | |
| 0.09075 | -0.00925 | -0.02925 | -0.00525 | |
| 0.06825 | 0.03675 | 0.03875 | 0.05575 | |
| 0.03925 | 0.03175 | 0.01475 | 0.04075 | |
| 0.02825 | 0.02775 | 0.02575 | 0.04375 | |
| 0.02625 | 0.03875 | 0.02075 | 0.03175 |
표 3입니다. 보정 된 흡 광도. 제조 업체의 프로토콜에 따라 제어 우물의 평균 흡 광도의 뺄셈 후 우물의 흡 광도. 컬럼 1, 웰 1-4는 TCS 흡착 값-평균 CMB 흡 광도 값입니다. 컬럼 1, 웰 5-8는, TCM 흡 광도 값-평균 VCC 흡 광도 값 이다.
| Np | 렆 | Np | |
| 128.9916 | 108.8235 | 93.69748 | |
| 63.44538 | 118.9076 | 66.80672 | |
| 75.92593 | 72.75132 | 64.28571 | |
| 66.27907 | 63.17829 | 83.33333 | |
| 평균% 세포 독성 | 83.66049 | 90.91518 | 77.03081 |
표 4입니다. 세포 독성 계산. NP 및 파열 쥐 로부터 분리 된 태 반 NK 세포의 복제 샘플의 평균 퍼센트 세포 독성.
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Discussion
최적의 결과를 위해 고려해 야 할 중요 한 주요 참고 사항이 많이 있습니다. 이용 된 세포의 무 균은 매우 중요 합니다. 태 반의 채취 후, 생물 안전 내각에서 멸 균 조건 하에서 NK 세포의 조제 및 분리가 수행 되는 것이 중요 하다. 더욱이, 모든 세포는 세포 손상 시 LDH를 방출 하기 때문에, 분리 후 및 공동 배양 과정 동안 NK 세포의 높은 생존 능력을 얻기 위해 주의를 기울여야 한다. NK 세포에서 너무 많은 자발적 LDH 방출은 종종 부정적이 고, 사용할 수 없는 데이터를 초래
이 프로토콜의 몇 가지 측면은 사용자와 해당 요구에 따라 다릅니다. 예를 들어, 기계 및 효소 분해와 같은 본 기사의 방법 외에 태 반에서 단 핵 세포를 분리 하는 다양 한 방법이 있습니다. 추가적으로, 최적의 타겟 셀 수와 이펙터를 결정 하는 것은 사용자의 것이 고, 그들의 실험에 적합 한 타겟 비율 이다. 우리의 손에, 1만 표적 세포 및 이펙터: 50:1의 표적 비율은 우리의 실험을 위해 최적 인 것으로 결정 되었다. 이러한 수치는 NK 세포가 단 리 되는 조직에 선택 된 표적 세포에 따라 변할 수 있다. 다른 조사자는 간과 비장9에서 고립 된 세포의 NK 기능을 평가 하기 위하여이 방법을 이용 했습니다. 따라서,이 방법은 연구의 다양 한 분야에서 채택 될 수 있다, 뿐만 아니라 자간 전 증의 연구에서, 우리는 그것을 사용 하도록 선택한 대로.
세포 독성 평가를 위한 금 표준은 크롬 방출 분석5이다. 이 방법은 신뢰성과 재현성 이지만, 가장 명백한 제한은 직원과 방사성 처분에 방사성 노출 위험을 사용 하는 것입니다. 다른, 비-방사성 세포 독성 분석 법 등의 유 세포 분석 계 및 석 회화 방출 분석 법은 CRA,도11에 필적 하는 결과를 갖는 것으로 보고 된다. 그러나, 유 세포 분석 기반 분석은 분석을 실행 하기 위해 유 세포 분석기에서 인력에 대 한 추가적인 전문 교육이 필요 합니다. LDH 방출 분석은 분석을 수행 하기 위해 간단한 파이 펫 팅을 필요로 하기 때문에 전문 교육이 필요 하지 않습니다. 추가적으로 LDH 방출 분석은 표준 분 광 법 또는 형광 검출을 사용 하 여 활용 될 수 있지만, 석 회화 방출 및 유 세포 분석 기반 방법은 형광을 검출할 수 있는 장비가 필요 합니다. LDH 방출 분석의 한계는 손상 된 세포 로부터 LDH의 불완전 한 방출로 인 한 세포 사 멸의 과소 평가를 포함 한다.
이 분석에서, 배지로 방출 되는 LDH의 측정은 iodonitrotetrazolium (tetrazolium 염)이 포 르 포 잔 (적색)으로 전환 되는 효소 반응에 의해 발생 한다. 흡 광도는 표준 분광학에 의해 측정 되 고 문화에 있는 손상 한 세포의 양은 빨간 색깔의 강렬에 비례 합니다. 이 분석을 통해 샘플에서 손상 되거나 부상 된 세포를 정확 하 게 측정할 수 있습니다. 최종적으로,이 색도계 분석은 또한 화학 매개 된 기계 장치 뿐 아니라 세포 매개를 통해 서 생기는 세포 독성을 분석 하기 위하여 그밖 세포 유형과 함께 사용 될 수 있습니다.
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Disclosures
이해관계의 상충, 재정 또는 기타는 저자에 의해 선언 되지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 심장 폐와 보조금 R00HL130456에서 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소에 의해 지원 되었다, 국립 의료 과학 연구소의 국가 학회에서 수상 P20GM104357에서, 그리고 미시시피 INBRE는 보조금 번호 P20GM103476 하에서 국립 건강 학회 국립 연구소의 기관 개발 상 (IDeA)에 의해 자금을 지원 했다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이 며, 반드시 건강의 국가 학회 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
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