Summary

Un ensayo de citotoxicidad basada en placas para la evaluación de la función citolítica de la célula asesina natural placentaria de rata

Published: June 02, 2019
doi:

Summary

Aquí, proporcionamos una metodología detallada para aislar y evaluar la función citotóxica de las células asesinas naturales de las en por un ensayo de placa colorimétrica. Se eligió el modelo reducido de la rata de perfusión uterina de isquemia placentaria para demostrar el aislamiento mediado por anticuerpos y la evaluación de la función citotóxica de las células asesinas naturales.

Abstract

Es bien sabido que las células del asesino natural decidua (NK) juegan un papel crítico en el establecimiento y el mantenimiento del embarazo normal. Estudios recientes han demostrado una población alterada de células NK circulantes y deciduales en mujeres que sufren complicaciones adversas en el embarazo como aborto recurrente y preeclampsia. Estudios de nuestro grupo han demostrado que la hipertensión en el embarazo está asociada con un aumento de la población de células NK activadas en la placenta basada en la expresión de marcadores de activación de superficie. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar la función citotóxica de las células NK aisladas de las en en un modelo animal parecido a la preeclampsia de isquemia placentaria inducida quirúrgicamente. Los siguientes pasos se describen detalladamente: generación de suspensión de célula única, aislamiento de células NK, estimulación ex vivo, efector: cocultivo celular objetivo y ensayo de citotoxicidad.

Introduction

La preeclampsia es un trastorno hipertensivo del embarazo caracterizado por la restricción del crecimiento fetal, el daño al órgano final y la activación inmunitaria crónica. La activación inmunitaria crónica en mujeres con preeclampsia conduce a un aumento de la circulación y citoquinas inflamatorias placentarias, un desequilibrio en las poblaciones de células T CD4+ , y un aumento de la población de las células de Killer natural activado (NK)1. Los estudios recientemente publicados por nuestro laboratorio demuestran un papel para las células NK en la causa de parte de la fisiopatología asociada con la preeclampsia en el modelo de la rata de la presión de perfusión uterina reducida (RUPP) de la preeclampsia. Utilizando citometría de flujo para medir la expresión superficial de los marcadores de activación en las células NK, se observó un aumento de la población de células NK activadas en la circulación y en de las ratas Rupp en comparación con las ratas embarazadas normales (NP)2.

Para confirmar las observaciones de citometría de flujo, se realizaron estudios funcionales para evaluar la actividad citotóxica de células NK aisladas de las en de ratas NP y Rupp. Hay varios métodos disponibles para la evaluación de la función citotóxica de las células T de citotóxicos CD8+ y las células NK. El estándar de oro para el análisis citotóxico funcional es el ensayo de liberación de cromo3. Otros protocolos desarrollados utilizados incluyen citometría de flujo4, citometría de imagen5, calceína Release6, y más recientemente bioluminiscencia7. Este video proporcionará un protocolo detallado sobre el uso del ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) bien establecido para medir la función citotóxica de las células NK utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad LDH disponible comercialmente.

Protocol

Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales en el centro médico de la Universidad de Mississippi. El cuidado y el manejo de los animales estaban de acuerdo con las pautas de los institutos nacionales de salud para el tratamiento ético de los animales. 1. aislamiento de células linfocitas de placentas Retire una placenta del útero de la rata (día de gestación 19) y colóquelo en 10 mL de PBS8frío-hielo….

Representative Results

Las células NK placentarias obtenidas de ratas NP y RUPP fueron incubadas durante 5 h con células Diana en sus respectivos medios en una proporción de 50:1 (NK: target). La absorbancia se registró en 490 nm y los datos brutos se muestran en la tabla 2. Se calculó la absorbancia media del fondo del medio de cultivo y los pozos de control de corrección de volumen. Estos promedios se restaron de los pozos apropiados indicados en el protocolo del fabricante y se representan en el cuadro 3</stro…

Discussion

Hay una serie de notas clave importantes a tener en cuenta para obtener resultados óptimos. La esterilidad de las células utilizadas es muy importante. Después de la recolección de la placenta, es importante que la preparación y el aislamiento de las células NK se realicen en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad. Además, debido a que todas las células liberan LDH sobre el daño celular, se debe tener cuidado para obtener una alta viabilidad de las células NK después del aislamiento y durante el…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de pulmón y sangre del corazón de los institutos nacionales de salud bajo la subvención R00HL130456, el Instituto Nacional de ciencias médicas generales de los institutos nacionales de salud bajo el premio P20GM104357, y por el Mississippi INBRE, financiado por un premio de desarrollo institucional (IDeA) de los institutos nacionales de ciencias médicas generales de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P20GM103476. El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

References

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).

Play Video

Cite This Article
Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

View Video