Måle formen og størrelsen på aktivslam partikler immobilisert i Agar med en åpen kildekode programvare rørledning

Summary

Størrelsen og form av partikler i aktivert slam er viktige parametere som måles ved hjelp av ulike metoder. Feil oppstår fra ikke-representative utvalg, suboptimal bilder og subjektive analyser parametere. For å minimere disse feilene og lette måling, presenterer vi en protokoll angir hvert trinn, inkludert en åpen kildekode programvare rørledning.

Abstract

Eksperimentell bioreaktorer, som de behandler avløpsvannet, inneholde partikler som størrelse og form er viktige parametere. For eksempel kan størrelsen og formen på aktivslam flocs angi forholdene på Mikroskala, og også direkte påvirke hvor godt slam bosetter seg i en clarifier.

Partikkelstørrelse og form er begge villedende “enkel” mål. Mange subtile problemer, ofte uadressert i uformelle protokoller kan oppstå når prøvetaking imaging og analyserer partikler. Prøvetaking metoder kan være partisk eller gir ikke nok statistisk styrke. Prøvene seg kan være dårlig bevart eller gjennomgå endring under immobilisering. Bilder kan ikke være av tilstrekkelig kvalitet; overlappende partikler, kan dybdeskarphet, forstørrelsesnivå, og ulike støy alle gi dårlige resultater. Dårlig angitte analyse kan introdusere bias, som produseres av manuell bilde terskelverdi og segmentering.

Rimelig og gjennomstrømning er ønskelig sammen med reproduserbarhet. En rimelig, høy gjennomstrømming metode kan aktivere hyppigere partikkel måling, produsere mange bilder som inneholder tusenvis av partikler. En metode som bruker billig reagenser, felles dissecting mikroskop og fritt tilgjengelige åpen kildekode analyseprogramvare kan gjentas, tilgjengelig, reproduserbare og delvis automatisert eksperimentelle resultater. Videre, produktet av slik metode kan være velutformet, veldefinerte og lett forstått av dataanalyse programvare, lettelser både innen-lab analyser og datadeling mellom laboratorier.

Vi presenterer en protokoll som viser trinnene som trengs for å produsere et produkt, inkludert: prøvetaking, prøve forberedelse og immobiliseringsløsninger agar, digital image vinningen, digital bildeanalyse og eksempler på eksperimentet-spesifikk figur generasjon fra den analyseresultater. Vi har også inkludert en åpen kilde data analyse rørledning for å støtte denne protokollen.

Introduction

Formålet med denne metoden er en godt definert, repeterbare og delvis automatisert metode for å bestemme størrelsen og formen distribusjoner av partikler i bioreactors, spesielt de som inneholder aktivslam flocs og aerobic granulater^{1 , 2}. begrunnelsen bak denne metoden var å forbedre den rimelig, enkelhet, gjennomstrømning, og repeterbarhet våre eksisterende in-house protokoller^3,4, lette partikkel måling for andre, og lette deling og sammenligning av data.

Det er to hovedkategorier av partikkel måling analyse – direkte tenkelig og inferential metoder å bruke slike egenskaper som lysspredning⁵. Selv om inferential metoder kan automatiseres og har stor gjennomstrømming, er utstyret dyrt. Dessuten, mens inferential metoder å nøyaktig bestemme tilsvarende størrelsen på en partikkel⁶, gir de ikke detaljert form information⁷.

Behovet for figurdata, har vi basert vår metode på direkte bildebehandling. Mens noen høy gjennomstrømming tenkelig metoder finnes, har de tradisjonelt nødvendige dyr kommersiell maskinvare eller tilpassede innebygde løsninger^8,9. Vår metode er blitt bebygget for å ansette felles, rimelig maskinvare og programvare som, selv om lider av en reduksjon i gjennomstrømning, gir langt mer partikkel bilder enn minimum nødvendig for mange analyser¹⁰.

Eksisterende protokoller kan ikke angi viktig prøvetaking og bilde oppkjøpet trinnene. Andre protokoller kan angi manuelle trinn som innføre subjektive bias (for eksempel ad hoc terskelverdi¹¹). En veldefinert metode som angir prøvetaking immobilisering trinnene, og bilde oppkjøpet kombinert med fritt tilgjengelig analyseprogramvare vil forbedre både innen-lab bildeanalyse og sammenligninger mellom laboratorier. Et hovedmål for denne protokollen er å gi en arbeidsflyt og verktøy som skal føre til reproduserbar resultater fra ulike labs for samme prøven.

Bortsett fra normalisere bildet analyseprosessen, er data produsert av denne rørledningen registrert i en veldefinert og godt formatert fil¹² egnet for bruk av populære data analyse pakker^13,14, lettelser eksperiment konkrete analyser (som egendefinert figur generasjon) og går lettere datadeling mellom laboratorier.

Denne protokollen er spesielt foreslått for forskere som krever partikkel figurdata, har ikke tilgang til inferential metoder, ikke ønsker å utvikle sine egne bildet analyse rørledning, og ønsker å dele sine data enkelt med andre

Protocol

1. samle inn eksempler for partikkel analyse Finne eksempel volumet for bestemte reaktorer som vil produsere nok partikler for statistisk analyse10 (> 500) og unngå partikkel overlapping. Anta at en rekke 0,5 til 2 mL per prøve blandet brennevin er tilstrekkelig for aktivslam prøver med en blandet brennevin suspendert stoff (MLSS) mellom 250 og 5000 mg/L. Ellers forberede tre test agar plater med 0,5, 2 og 5 mL av prøven (trinn 1.2 gjennom 2.7). Visuelt …

Representative Results

Filer generertProsessen illustrert i figur 1 vil produsere to filer per bilde analysert. Den første filen er komma separert fil (CSV) tekst der hver rad tilsvarer en personlige partikkel og kolonnene beskriver ulike partikkel beregninger som området, sirkularitet og soliditet og definert i ImageJ manuell17. Eksempel-CSV-filer er inkludert tilleggsinformasjon og i mappen eksempler/data. <p class="jove_content"…

Discussion

Selv om bildet analyse systemet er ganske robust og QC skritt er tatt for å sikre dårlig bilder er fjernet, kan riktig oppmerksomhet til problemer i prøvetaking, plate forberedelser og bildeopptak forbedre både nøyaktigheten av dataene og andelen av bilder passerer QC.

Prøvetaking konsentrasjon
Antar et representativt utvalg overtatt, er viktigste å sikre at tilstrekkelig partikler tilstede for representant⁹ og effektiv analyse mens ikke så k…

Materials

10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.