Summary
Storleken och formen av partiklar i det aktiva slammet är viktiga parametrar som mäts med olika metoder. Felaktigheter uppkommer icke-representativ provtagning, suboptimal bilder och subjektiva analysparametrar. För att minimera felen och underlätta mätning, presenterar vi ett protokoll som anger varje steg, inklusive en öppen källkod programvara gasledning.
Abstract
Experimentell bioreaktorer, såsom de behandlande avloppsvattnet, innehålla partiklar vars storlek och form är viktiga parametrar. Exempelvis kan storlek och form av aktiverat slam flockar ange villkor på den hur provtagningsutrustningen skall, och också direkt påverka hur väl slammet bosätter sig i en Hårblekningsmedel.
Partikelstorlek och form är både misleadingly 'enkla' mätningar. Många subtila frågor, ofta oadresserade i informella protokoll, kan uppstå när provtagning, imaging och analysera partiklar. Provtagning kan vara partisk eller ger inte tillräcklig statistisk power. Proverna som själva kan vara dåligt bevarad eller genomgå en förändring under immobilisering. Bilder får inte vara av tillräckligt god kvalitet; överlappande partiklar, kan skärpedjup, förstoringsgrad, och olika buller alla ger dåliga resultat. Dåligt specificerad analys kan införa bias, såsom som produceras av manuell bild tröskelvärde och segmentering.
Överkomliga priser och genomströmning är önskvärda vid sidan av reproducerbarhet. En prisvärd, hög genomströmning metod kan aktivera oftare partikel mätning, producerar många bilder som innehåller tusentals partiklar. En metod som använder billig reagenser, gemensamma dissekera mikroskopet och fritt tillgängliga open source analys programvara tillåter repeterbara, tillgänglig, reproducerbar och delvis automatiserad experimentella resultat. Produkten av en sådan metod kan dessutom vara väl formaterad, väldefinierade och lätt att förstå av data analysprogram, lätta både inom-lab analyser och delning av data mellan labs.
Vi presenterar ett protokoll som beskriver de steg som behövs för att producera sådan produkt, inklusive: provtagning, prov förberedelse och immobilisering i agar, digital bild förvärv, digital bildanalys och exempel på experiment-specifik figur generationen från den analysresultat. Vi har även inkluderat en öppen källkod data analys pipeline till stöd för detta protokoll.
Introduction
Syftet med denna metod är att ge en väldefinierad, repeterbara och delvis automatiserad metod för att bestämma storlek och form distributioner av partiklar i bioreaktorer, särskilt de som innehåller aktiva slammet flockar och aerob granulat1 , 2. tanken bakom denna metod var att öka köpkraften, enkelhet, genomströmning, och repeterbarhet av våra befintliga interna protokoll3,4, underlätta partikel mätning för andra, och underlätta delning och jämförelse av data.
Det finns två huvudkategorier av partikel mätning analys - direct imaging och inferential metoder med sådana egenskaper som ljusspridning5. Även om inferential metoder kan automatiseras och har stor genomströmning, är utrustningen dyra. Dessutom, medan inferential metoder kan exakt bestämma motsvarande storleken på en partikel6, ger de inte detaljerad form information7.
På grund av behovet för formdata, har vi grundat vår metod på direct imaging. Medan vissa hög genomströmning avbildningsmetoder existerar, har de traditionellt krävs antingen dyr kommersiell hårdvara eller anpassade byggda lösningar8,9. Vår metod har utvecklats för att anställa gemensamma, prisvärda maskinvara och programvara som, även om lider av en minskning av genomströmning, producerar mycket mer partikel bilder än det minimum som krävs för många analyser10.
Befintliga protokoll kan inte ange viktiga provtagning och bild förvärv steg. Andra protokoll kan ange manuella steg att inför subjektiva bias (såsom ad hoc-tröskelvärde11). En väldefinierad metod som anger provtagning, immobilisering och bild förvärv steg kombineras med fritt tillgängliga analysprogramvara kommer att förbättra både inom-lab bildanalys och jämförelser mellan laboratorier. Ett viktigt mål i detta protokoll är att ge ett arbetsflöde och verktyg som ska leda till reproducerbara resultat från olika laboratorier för samma prov.
Bortsett från normaliserad bild analysprocessen, registreras data produceras av denna rörledning i en väldefinierad, väl formaterad fil12 lämplig för användning av populära data analys paket13,14, lätta experiment specifika analyser (såsom anpassade figur generation) och underlätta delning av data mellan labs.
Detta protokoll föreslås särskilt för forskare som kräver partikel formdata, har inte tillgång till inferential metoder, vill inte utveckla sin egen bild analys pipeline, och vill dela sin data med andra
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samla in prover för Partikelanalys
- Avgöra provvolymen för specifika reaktorer som kommer att producera tillräckligt partiklar för statistisk analys10 (> 500) samtidigt undvika partikel överlappning.
- Anta att en rad 0,5 till 2 mL per prov av blandade sprit räcker för aktiva slammet prover med en blandad sprit Suspenderade fasta ämnen (MLSS) mellan 250 och 5.000 mg/L.
- Annars, förbereda tre test agarplattor använder 0,5, 2 och 5 mL av provet (steg 1.2 genom 2.7).
- Visuellt uppskatta vilka (om några) provvolymer bästa uppfyller de kriterier som anges i steg 1,1.
- Om partiklar överlappar fortfarande för 0,5 mL provet, upprepa steg 1.1.2 och 1.1.3 med tre 0,5 mL prov utspädda med en tillsats 0,5, 1 och 2 mL fosfatbuffrad koksaltlösning att fastställa graden som ett 0,5 mL prov måste spädas före steg 2.1.
Obs: Steg 1.1 − 1.1.4 behöver bara göras en gång per experiment eller om reaktorn innehåll förändring så att efterföljande mätningar inte längre uppfyller de kriterier som anges i steg 1,1.
- Förvärva ett representativt prov från en väl blandad del av reaktorn av greppa ~ 40 mL i en bägare eller 50 mL centrifugrör, blanda försiktigt, och omedelbart hälla den beslutsamma provvolymen av välblandade grab i en 15 mL centrifugrör. Späd provet, nödvändiga, som bestäms av steg 1.1.4.
Obs: Protokollet kan pausas här och provet kan förvaras i kylskåp (4 ° C) i upp till 48 timmar. Provet får inte frysas.
Försiktighet: gemensamma bevarande media (t.ex. formaldehyd/formamid) är inte lämpliga. Den stora ytan av plattan, i kombination med öppna behållaren, värme från ljuskällan och potentiellt dåligt ventilerade mikroskopi setup producera onödigt farliga villkor för lite vinst i bildkvalitet.
2. Förbered agarplattor av färgade, immobiliserade partiklar
- Tillsätt 5 µL 1% (w/v) metylenblått i varje prov, sedan locket och vänd försiktigt på minst 3ggr att blanda. Tillåta prover att färga för minst 5 men högst 30 minuter i rumstemperatur.
- Förbereda ca 10 mL per prov av 7,5% (w/v) agar i avjoniserat vatten.
Obs: Agar kan produceras före tid och lagras på obestämd tid om steriliseras. Agaros kan ersättas, men förbättrar inte väsentligen bilder. - Smält agar med en mikrovågsugn eller vattenbad och låt svalna något innan användning. Säkerställa agar är helt smält och häller enkelt. Solid globuler agar färgar annorlunda, producera bilder med dålig kvalitet.
- Överföra tillräckligt smält 7,5% (w/v) agar till centrifugröret att föra den totala tube volymen mellan 6,5 och 9 mL.
- Resumé centrifugrör och vänd försiktigt minst 3 gånger för att blanda.
- Samtidigt pekar locket borta från sig själv eller i en huva, öppna locket. Häll en 100 mm plast petriskål tube innehållet medan du försiktigt skaka skålen för att uppnå en fullständig, slät beläggning och en visuellt jämn fördelning av partiklar.
FÖRSIKTIGHET: Värmen från ägarn kan producera ett lätt övertryck i röret. Detta ofta ger en hörbar väsa och har potential att utvisa små droppar av heta agar. - Låt plattorna svalna i rumstemperatur i minst 5 minuter, tills agar stelnar.
Obs: Protokollet kan pausas här. Store pläterade inverterad och förseglade (t.ex. i en tätning plastpåse eller med paraffin filma) för upp till 48 timmar under kylning (4 ° C).
3. Hämta partikel bilder med hjälp av stereomikroskopet och digitalkamera
- Placera den avtäckta platta uppåt på Mikroskop scenen av ett stereomikroskop kan 10 x 20 x förstoring. Belysa provet underifrån med jämnt, diffust ljus med utrustning såsom en LED illuminator stativ eller ljus platta.
- Öppna programvaran image capture, Mikroskop ljusstrålen är inställd till fotooch klicka på lämplig kameran från kameralistan.
- Justera mikroskopet så att flera partiklar visas i programvaran i fokalplanet med stora, väldefinierade kanter. Använd en förstoring på 10-20 x för att mäta partiklar samtidigt som en relativt djupt fokalplan.
- Tillfälligt ta bort agarplattan och placera Mikrometern på scenen. Justera fina fokus tills gradering på Mikrometern visas skarpt fokuserad i programvaran image capture.
- Om inte tidigare kalibrerade, spela in pixel-micro förhållande för den aktuella förstoringen.
- Ställ in zoom till 100% genom att klicka Zooma > verklig storlek och välj Alternativ > Kalibrera sedan justera den röda kalibrering bar i största visningsområdet längs den långa axeln av Mikrometern, med de vertikala staplar centrerad på de 0 och 200 µm graderingar. Ange aktuell förstoringsgrad och faktiska längd 200 µm i dialogrutan kalibrera .
- Om redan kalibrerad Välj förstoring från menyraden och välj den aktuella förstoringen nivå och bekräfta kalibrering.
- Välj mätningar > Line > godtyckliga linje. Klicka på skärningspunkten mellan den 0 examen och långa axeln av Mikrometern. Klicka igen på korsningen på 200 och långt axeln. A korrekt kalibrering ska visa ungefärligt 200 µm. radera raden genom att klicka på den, trycka på delete, och trycka på Ja i bekräftelserutan.
Obs: Instruktioner för att välja kameran och kalibrering är specifika för den programvara som används för den här maskinvaran. Liknande funktioner bör vara tillgängliga i andra bildprogram. Målet är att avgöra pixeln micron-kvoten för bilden för korrekt partikel storlek mätning.
- Välj mätningar > Line > godtyckliga linje. Klicka på skärningspunkten mellan den 0 examen och långa axeln av Mikrometern. Klicka igen på korsningen på 200 och långt axeln. A korrekt kalibrering ska visa ungefärligt 200 µm. radera raden genom att klicka på den, trycka på delete, och trycka på Ja i bekräftelserutan.
- Ersätta agarplattan och justera fina fokus för att uppnå maximal detalj i avbildningsprogrammet.
- Justera avbildningsprogrammet så att maximal bildkvalitet uppnås.
- Öka bitdjup till det högsta värdet som tillåts, genom att välja knappen på panelen Bitdjup i kameran sidofältet. Ställa in program att förvärva gråskalebilder genom att välja lämplig alternativknapp på panelen Färg/grå i kameran sidofältet.
- Kollapsa alla öppna sidofältet paneler mellan exponering och histogram. Minska förstärkningen till 1.0 och öka exponeringen tills en tydlig bild visas i visningsområdet och tills histogrammet visas som en distribution som inte är klippt av ände av rutan histogram.
- Justera histogrammet kan undvika över och underexponering. På panelen histogram av kameran sidan baren, Skjut den vänstra gränsen av histogrammet till strax utanför de lägsta värdena och på höger fältetikettsgräns till strax utanför de högsta värdena.
- Spara bilden som en okomprimerad TIFF, inklusive förstoring information i bildmetadata, använder den fil > Spara som dialogrutan välja TIFF-formatet, och se till att kryssrutan Spara med Kalibreringsinformation kontrolleras.
Obs: Spara bildmetadata, inklusive rumsliga kalibrering, kan variera mellan förvärvet program. FIJI15, den underliggande programvaran som används av rörledningen, förstår de vanligaste varianterna. Den viktiga informationen att registrera är pixelhöjd, bredd och associerade enhet(er). - Med hjälp av antingen en rörlig scen eller manuellt flytta plattan själv, Välj ett annat område, som inte överlappar föregående bilder, efter en väg som alternerar mellan vänster-till-höger och höger-till-vänster som en flyttas ner plåten; även känd som 'gräsklippare sökkriterier'. Upprepa steg 3.6 tills tillräcklig bilder produceras för att fånga minst 500 visuellt uppskattade partiklar, mer är bättre.
Obs: Alternativ mönster (e.g., cirkulär, slumpmässiga) är acceptabla men bör rapporteras. Förvärva flera överlappande bilder för kombination till en mosaik via digitala sömmar producerar en resulterande filstorleken som avsevärt försvårar nedströms behandling och artefakter från sömmar kan införas och rekommenderas inte för närvarande. - Behålla plattorna tills efter bildanalys för potentiella uppföljande avbildning. Efter sista imaging, kassera för biologiskt avfall.
4. mäta och analysera partikel silhuetter
- Installera paketen krävs bild analys programvara
- Installera FIJI (en förbättrad version av National Institutes of Health's ImageJ v1.52e följa instruktionerna på: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- Installera git, om inte redan finns, genom att följa anvisningarna på: https://git-scm.com/downloads
- Förvärva partikel analys koden från genom att klona git repository16.
- På kommandoraden, hämta den senaste versionen av koden genom att skriva:
git klon https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git- Installera analys koden följande instruktionerna i README.md textfilen finns i toppnivåkatalogen av klonade databasen.
Obs: Med hjälp av git är att föredra, eftersom det kommer automatiskt att hämta den senaste versionen av koden. Om git inte finns, det är också möjligt att ladda ner koden som en zip-fil på sidan release på: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
- Installera analys koden följande instruktionerna i README.md textfilen finns i toppnivåkatalogen av klonade databasen.
- På kommandoraden, hämta den senaste versionen av koden genom att skriva:
- Redigera en textfil som listar katalogerna som ska bearbetas, tillsammans med valfria parametrar. Se exempel/analys underkatalogen för en lista över parametrar och exempel.
- Kör analysen på kommandoraden genom att skriva:
< FIJI-PATH > \ImageJ-win64.exe--konsol - makro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
där < FIJI-sökväg > är den katalog som ImageJ-win64.exe finns och < paramsfile > platsen för den textfil som beskriver inställningen för analys
Obs: Namnet på den körbara filen kan variera, beroende på vilket operativsystem FIJI är installerad på. Beroende på antalet och storleken på bilder, analysen kan ta några minuter till timmar och körs automatiskt. - Utföra en kvalitetskontroll-check
- Undersöka kvalitetskontroll filerna i underkatalogen överlägg för angivna utdatakatalogen. Observera bilder med falska, missade och dåligt infångade partiklar, alla uppenbara som skuggade konturer som inte matchar bakgrunden. Se figur 3 för exempel på sådana. Partikel data är nu redo för experiment-specifik analys figur generation.
- Avvisa antingen hela plattor eller enskilda partiklar genom att ange i kodexen analys den noterade filer eller partikel IDs att ignoreras. Se exempel/censurera i databasen för relevanta R och Python kod.
- Generera experiment specifika siffror med bild analysresultaten för varje bild lagras i en TIDY12 kommatecken separerad textfil i underkatalogen resultat av angivna utdatakatalogen. Se exempel/siffror/R och exempel/siffror/Python underkataloger för exempel på hur man läser resultatfiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Filer som genereras
Processen illustreras i figur 1 kommer att producera två filer per bild analyseras. Den första filen är ett kommatecken separerad textfil (SKV-filer) där varje rad motsvarar en enskild partikel och i kolumner beskrivs olika partikel mätvärden såsom område, loopkontroll och soliditet och definieras i ImageJ manuell17. Exempel CSV-filer ingår som tilläggsinformation och i katalogen exempel/data.
Figur 1: Grafiskt arbetsflöde som beskriver de fyra huvudstegen i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den andra filen är avsedd för användning i kvalitetskontroll (QC) och är en GIF-bild fil som överlägg ursprungliga bilden med halvgenomskinligt regioner som representerar identifierade partiklarna, som i figur 2. Kvaliteten på partikel-identifiering och segmentering kan sedan utvärderas snabbt manuellt. Även om ingen partikel tröskelvärde metod är perfekta18, presenteras figur 2 som ett exempel på ett acceptabelt resultat. Bilder av dålig kvalitet kan antingen återtogs, eller om det finns tillräckliga data, helt enkelt bort från vidare bearbetning.
Figur 2: Exempel på en kvalitetskontroll (QC) gif genereras av rörledningen bild analys. Förstoring av huvudbilden 15 x. Utdrag är digitalt zoomad visar siffror att identifiera enskilda partiklar i bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När du utvärderar QC bilder, det finns tre vanliga fel hittade:
1. underlåtenhet att korrekt överensstämma med partikel gränserna
2. underlåtenhet att identifiera partiklar
3. artefakt inkludering beror antingen till: icke-partikel komponenter (t.ex. bubblor) eller fel i tröskelvärde
Exempel på dessa fel illustreras i figur 3. Stackars partikel gränsen identifiering och segmentering mellan partiklarna ofta är ett resultat av alltför döende, som kan ses i figur 3a. Dålig belysning kan leda till både att identifiera partiklar (figur 3b, blå fylld cirkel) och artefakt falska partiklar (figur 3b, röd streckad cirkel). Icke-partikel roll, såsom bubblor, protozoer, svampar och metazoans, såsom trögkrypare i figur 3 c kan också identifieras förevändningar som partiklar.
Figur 3: Vanliga fel som upptäcks vid analys av QC. (en) dålig partikel gränsen upptäckt. (b) falska partiklar (röd streckad ellips) och unsegmented partiklar (blå solid ellips). (c), utländska icke-partikel objekt. Förstoringen 15 x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det är enklast att förkasta hela bilden. Det är dock möjligt att använda partikel identifieraren i bilden QC (figur 2, infälld) att avvisa enskilda partiklar. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart när det finns en handfull frågor i en annars användbar bild (såsom införande av icke-partiklar) figur 3 c. Exempel att göra så ingår på ett reproducerbart och rapporterbara sätt i katalogen exempel/censurera på github databasen.
När en liten minsta diameter anges (< 10 pixlar), bildbrus förevändningar kan identifieras som en partikel. I dessa fall bilden kan fortfarande vara accepteras när ytterligare nedströms analys är tar bort deras närvaro. Som en riktlinje bör formdata behandlas med skepsis när partiklar består av mindre än ~ 200 pixlar19.
Figur Generation
CSV-filerna som härrör från bildanalys Tidy12 och kan vara enkelt kombineras och analyseras i forskarens Rekommenderad programpaket (såsom pandor20 med seaborn21 i Python eller dplyr22 med ggplot223 i R). Den exakta siffra typ krävs varierar dock nödvändigtvis med forskningsfrågor och resultatet. Ett exempel på en möjlig siffra ingår nedan (figur 4) och motsvarande kod till generera den från CSV-filer finns tillgänglig på github16.
Figur 4: Exempel på experiment-specifik figur genereras från CSV-data produceras av rörledningen bild. I det här exemplet partikel fördelningarna mellan två experimentella reaktorer över tid visas och kombinerat med kvalitativa metadata noteras av forskaren. Se exempel/siffror/R för att generera kod och data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om systemets bild analys är ganska robust och QC åtgärder vidtas för att säkerställa att fattiga bilder tas bort, kan ordentlig uppmärksamhet på specifika frågor i provtagning, plattan förberedelse och bild förvärv förbättra både riktigheten av uppgifter och andelen bilder passerar QC.
Provtagning koncentration
Förutsatt att ett representativt prov har tagits, är det viktigaste steget att säkerställa att tillräcklig partiklar finns för representativa9 och effektiv analys medan inte så koncentrerad att partiklar överlappar varandra.
Detta har motsvarade cirka 0,5 till 2 mL blandad sprit över ett brett spektrum av totalt suspenderat material, men experiment-specifika bestämning kan behövas. Exempel på alltför koncentrerad, alltför - utspädd, och lämpliga partikel koncentrationer visas i figur 5 som referens. Färgning påverkas också av partikel koncentration. Överdriven utspädning kan resultera i alltför färgade, suddiga partiklar medan under utspädning inte kan producera partiklar med tillräcklig kontrast för optimal tröskelvärde.
Figur 5: Referens bilder visar partikel koncentrationer som är alltför koncentrerade, acceptabelt och alltför utspädda. Förstoringen 15 x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dye koncentration
Mängden fläcken tillsätts provet är avgörande och rätt mängd kan variera mellan slam. Ca 5 µL av 1% (w/v) metylenblått per 0,5 till 2 mL av provet ger tillräcklig kontrast för tröskelvärde utan att orsaka 'blödning' och skymmer den partikelns form.
Det finns ingen enda perfekt koncentration; en balans mellan kontrast och klarhet måste väljas. Figur 6 illustrerar denna avvägning i tre prover färgas med 5, 25 och 50 µL av 1% metylenblått per 2 mL av slam. När väger denna avvägning, är enstaka dåligt kontrasterande partikeln (figur 6a) att föredra över dåligt matchas blobbar (figur 6 c).
Figur 6: Ökad fläcken koncentration förbättrar partikel kontrast, men också snedvrider den observerade gränsen. Förstoringen 15 x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tallrik lagring
Efter immobilisering, kan plattor kylförvaras (4 ° C) i minst 3 dagar. Detta är en konservativ period under vilken det är osannolikt att förorena tillväxt och färgämne diffusion kommer att inträffa. Plattor som inte visar någon av de frågor som beskrivs nedan kan fortfarande avbildas efter 3 dagar. När lagras för länge, befintliga partiklar kan fortsätta att växa och kommer att visas i fokalplanet av andra partiklar samtidigt behålla nyans av fläcken, som kan ses i figur 7a. Yta föroreningar, såsom svampsporer, kan också växa efter långa perioder av lagring. Dessa generellt tar inte upp färgen på fläcken och kommer att visas i en annan fokalplan, som kan ses i figur 7b. I vissa fall är det oklart om överväxt eller diffusion av fläcken har inträffat, exempelvis i botten av figur 7b och centrera av figur 7 c. Oavsett orsak ange ställen såsom de plattan har åldrats bortom dess livslängd
Figur 7: Referensbilder som illustrerar överväxt signalerar att en tallrik har lagrats bortom dess livslängd. Förstoringen 15 x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Plattan förberedelse
Det finns två frågor som förknippas med fysiskt förbereder agarplattor - alltför tjocka agar och överdriven omskakning. I det första fallet (figur 8), blivit partiklarna upphängd på olika djup, vilket gör det svårt att få bilder med majoriteten av partiklar i fokus.
Figur 8: Använder stora mängder av agar kommer att producera ett prov som är tjockare än fokalplanet, vilket resulterar i suddiga partiklar. Förstoringen 15 x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I det andra fallet virvlande producerar en ojämn fördelning av partiklar (figur 9a), förspänns resultat från olika delar av plattan (figur 9b, c. Generellt mer än 7 mL agar krävs att täcka en 100 mm petriskål och bara mild handrörelser behövs för att jämt täcka skålen.
Figur 9: Alltför kraftig omskakning under plattan beredning visas som icke-enhetlig partikel distributioner (en), förspänns sektioner av plattan mot större (b) och mindre (c) partikel distributioner. Plattan är 100 mm i diameter, micrographs förstoras 15 x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mikroskopbilder
Det finns två större bild förvärv frågor som påverkar kvaliteten. Den första frågan är att säkerställa att flesta av partiklar är i fokalplanet. Även vid låg förstoring är storleken på många aktiva slammet partiklar sådan att utan smärre justeringar av grova fokus, många partiklar blir något ur fokus, att införa Felaktiga partikel mätning. Ingen bild kommer att innehålla 100% perfekt fokuserade partiklar; Figur 8 och Figur 5b är respektive exempel på dålig och acceptabla fokus.
Exponeringsnivåer utgör den andra stora frågan. Dåligt exponerade bilder resultera i förlorade data och fattiga segmentering11. Ytterligare, hög kontrast färgämnet kan producera ett smalt histogram, minska det effektiva dynamiska omfånget av data. Övre och nedre gränserna för histogrammet kan justeras innan fånga en bild för att både förebygga dålig exponering och öka det dynamiska omfånget. Exempel över, under, och acceptabel exponeringar ingår nedan i figur 10.
Figur 10: Referensbilder visar dålig och acceptabel bild exponeringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den här metodens fördelar är att det ger särskilda kriterier som omfattar hela processen. Dessutom har vi tillhandahållit en programvara pipeline lättnader inom-lab analys och främja jämförbara mellan-lab data. Den största begränsningen med denna metod är att kravet på att hålla alla partiklar fokuserade förhindrar höga förstoringar, begränsa dess användbarhet för partiklar med små mindre dimensioner - särskilt trådformiga strukturer. Framtida inriktningar av denna metod kunde integrera avancerade analystekniker (särskilt buller minskning24,25, high dynamic range imaging, fokus stapling26,27och maskininlärning assisterad tröskelvärde, segmentering och klassificering28. Större bild förvärv förbättring skulle införliva programvara för att styra mekaniska steg8 och producera 'hela tallrik' mosaik arkiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från de nationella Science Foundation CBET 1336544.
FIJI, R och Python logotyper används med den i enlighet med varumärkespolicyer som följande:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , enligt licensen CC-BY-SA 4.0 överst på: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
References
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Williams, J. C. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004).
- Moghadam, B. K. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012).
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), Available from: http://www.aapspharmscitech.org E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. III Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Available from: http://www.r-project.org (2017).
- van Rossum, G. Python tutorial. , Amsterdam. CS-R9526 (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weaver, J. E. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis. , Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , National Institute of Health. (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- Wickham, H. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. Available from: http://ggplot2.org (2009).
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- Bell, A. A., Brauers, J., Kaftan, J. N., Meyer-Ebrecht, D., Aach, T. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology). 3 (1), Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ 170-184 (2009).
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
