Summary
הגודל והצורה של חלקיקים ב בוצה מופעל הם פרמטרים חשובים זה נמדדים באמצעות שיטות שונות. אי דיוקים נובעים דגימה בלתי מייצג, שיוצרת תמונות ופרמטרים ניתוח סובייקטיבית. כדי למזער שגיאות אלה להקל על המדידה, אנו מציגים פרוטוקול ציון בכל שלב, כולל צינור תוכנה של קוד פתוח.
Abstract
ריאקטורים ניסיוני, כגון אלה לטיפול בשפכים, מכילים חלקיקים בגודל ובצורה של מי הם פרמטרים חשובים. לדוגמה, הגודל והצורה של בוצה מופעל flocs ניתן לציין את התנאים-microscale, משפיעים גם ישירות על מה טוב כל הטינופת בסבלך clarifier של '.
גודל החלקיקים צורה שתי מדידות בניגוד לשמו 'פשוט' בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. רבים בנושאים עדינים, לעיתים קרובות ללא התיחסות בפרוטוקולים פורמלי, יכול להיווצר כאשר הדגימה, הדמיה, ניתוח חלקיקים. שיטות דגימה עשויים להיות מוטים או אינם מספקים מספיק חשמל סטטיסטי. הדגימות עצמם ייתכן יישמרו לקוי או לעבור שינוי במהלך הנייח. תמונות אינה בהכרח באיכות טובה דיה; חופפים חלקיקים, עומק שדה, רמת הגדלה ו רעש שונים יכול כל לייצר תוצאות המסכן. ניתוח לקוי שצוין ניתן להטיה, כגון כי המיוצר על-ידי קביעת סף תמונה ידנית פילוח.
כל אחד מהחדרים מכיל ותפוקת הם רצויים לצד הפארמצבטית. שיטת תפוקה גבוהה, במחיר סביר יכול לאפשר מדידה חלקיקים בתדירות גבוהה יותר, הפקת תמונות רבות המכיל אלפי חלקיקים. שיטה המשתמשת ריאגנטים זולה, מיקרוסקופ ויבתר נפוצות וכן תוכנת ניתוח זמינה בחופשיות קוד פתוח מאפשר תוצאות ניסויית הדיר, נגיש, הדירים חלקית-ממוחשב. עוד, התוצר של השיטה יכולה להיות מעוצבת היטב, מוגדרים היטב, להבין בקלות על ידי תוכנת ניתוח נתונים, הקלות במרחק המעבדה ניתוחים והן שיתוף בין מעבדות נתונים.
אנו מציגים פרוטוקול לפירוט השלבים הדרושים כדי לייצר מוצר שכזה, לרבות: דגימה, לטעום הנייח אגר, ייבוא תמונות דיגיטליות, ניתוח תמונות דיגיטליות ו דוגמאות של דור איור ניסוי ספציפי מן והכנה תוצאות ניתוח. כללנו גם את צינור ניתוח נתונים פתוח כדי לתמוך בפרוטוקול זה.
Introduction
מטרת שיטה זו היא כדי לספק שיטה מוגדרים היטב, הדיר ו חלקית-ממוחשב לקביעת הפצות הגודל והצורה של חלקיקים בתוך ריאקטורים, במיוחד אלה המכילים flocs בוצה מופעל ואת בגרגרים אירובי1 , 2. הרציונל מאחורי שיטה זו היו כדי לשפר את מקלחון, פשטות, תפוקה, הדיר שלנו קיימים פרוטוקולים ללא צורך במיקור חוץ3,4, להקל על מדידת חלקיקים אחרים, וכדי להקל על שיתוף ועל השוואה של נתונים.
ישנן שתי קטגוריות כלליות של חלקיקים מדידה ניתוח - ישיר הדמיה הסקתית ושיטות באמצעות תכונות כאלה כמו פיזור אור5. למרות שיטות הסקתית יכול להיות אוטומטי ויש תפוקה גדולה, הציוד יקר. בנוסף, בעוד שיטות הסקתית ניתן לקבוע במדויק הגודל המקביל של חלקיקים6, הם אינם מספקים מידע מפורט צורה7.
בשל הצורך נתוני צורה, לנו בסיס השיטה שלנו על הדמיה ישירה. בעוד כמה שיטות הדמיה של תפוקה גבוהה קיימים, הם נדרשים באופן מסורתי חומרה מסחרי יקר או פתרונות מותאמים אישית הבנויה8,9. השיטה שלנו פותחה להעסיק משותף, במחירים סבירים חומרה ותוכנה זה, למרות סובל לירידה בתפוקה, מייצרת תמונות חלקיקים הרבה יותר מהמינימום הדרוש עבור ניתוחים רבים10.
קיימים פרוטוקולים עשויה לציין לא הדגימה חשוב והשלבים רכישת התמונה. פרוטוקולים אחרים עשויה לציין שלבים ידניים זה גורם להטיה סובייקטיביות (כגון קביעת סף אד הוק11). שיטה מוגדר היטב כי קביעת שלבי רכישת דגימה, קיבעון ותמונה בשילוב עם ניתוח זמינה בחופשיות תוכנה יהיה לשפר ניתוח תמונה בתוך-מעבדה וגם השוואות בין מעבדות. יעד מרכזי של פרוטוקול זה נועד לספק זרימת עבודה וכלים צריך להוביל לתוצאות לשחזור של מעבדות שונות באותה דגימת זרע.
מלבד נרמול תהליך ניתוח התמונה, הנתונים המיוצר על ידי צינור זה נרשם גם עם קובץ מוגדר היטב, מעוצבת היטב12 מתאים לשימוש על-ידי הנתונים הפופולריים ניתוח חבילות13,14, הקלות ניסוי ניתוחים ספציפיים (כגון יצירת דמות אישית) ונתונים והקלה על שיתוף בין מעבדות.
פרוטוקול זה במיוחד הוא הציע לחוקרים אשר דורשים נתוני צורה של חלקיקים, אין גישה לשיטות הסקתית, לא הייתי רוצה לפתח צינור ניתוח התמונה שלהם, ורוצים לשתף בקלות את הנתונים שלהם עם משתמשים אחרים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לאסוף דגימות לניתוח חלקיקים
- לקבוע את אמצעי האחסון מדגם עבור כורים ספציפיים אשר יפיקו חלקיקים מספיק עבור ניתוח סטטיסטי10 (> 500) תוך הימנעות חפיפה של חלקיקים.
- נניח כי בטווח של 0.5 עד 2 מ לכל דגימה של משקאות מעורבים מספיקה עבור דגימות בוצה מופעל עם מוצקים משקאות מעורבים מושעה (מיס) בין 250 ל- 5000 מ ג/ל'
- אחרת, להכין שלוש צלחות אגר הבדיקה באמצעות 0.5, 2 ו- 5 מ של דגימה (שלבים 1.2 דרך 2.7).
- מבחינה ויזואלית מעריכים אשר (אם בכלל) מדגם אמצעי האחסון הטובה ביותר בקריטריונים המפורטים בשלב 1.1.
- אם החלקיקים עדיין חופפים עבור המדגם 0.5 mL, חזור על שלבים 1.1.2 ו 1.1.3 עם שלוש דוגמאות 0.5 mL מדולל עם הוסיף 0.5, 1, ו 2 מ ל תמיסת פוספט buffered כדי לקבוע את מידת שאליו מדגם 0.5 mL חייב להיות מדולל לפני שלב 2.1.
הערה: השלבים 1.1 − 1.1.4 צריך לבצע אך ורק פעם אחת לכל ניסוי, או אם הכור תוכן שינוי כזה מדידות שלאחר מכן כבר לא עומד בקריטריונים המפורטים בשלב 1.1.
- לרכוש מדגם מייצג של חלק מעורבים היטב הכור על-ידי גרירה ~ 40 מ"ל כוס כימית או 50 מ ל צנטריפוגה הצינור, בעדינות ערבוב, מיד לשפוך נפח דגימה נחוש החטיפה מעורבב היטב לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. לדלל את הדגימה, יש צורך, כפי שנקבע על ידי צעד 1.1.4.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, ניתן לאחסן את הדגימה תחת קירור (4 ° C) עד 48 שעות. אין להקפיא את הדגימה.
זהירות: שימור הנפוץ מדיה (למשל, פורמלדהיד/formamide) אינם מתאימים. שטח גדול של הצלחת, בשילוב עם המיכל פתוח, חום מתוך מקור האור ולאחר ההתקנה מיקרוסקופית פוטנציאלית מאוורר לייצר תנאים מסוכנים שלא לצורך רווח קטן באיכות התמונה.
2. להכין פלטות אגר של חלקיקים מוכתם, קיבוע
- להוסיף 5 µL של 1% (w/v) מתילן כחול כל דגימה, ואז קאפ, היפוך בעדינות ב 3 פעמים לפחות לערבב. אפשר דוגמאות כתם לפחות 5 אבל לא יותר מ 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להכין כ- 10 מ"ל לכל דגימה של 7.5% (w/v) אגר במים יונים.
הערה: אגר עשוי להיות המופק מבעוד מועד, מאוחסנים ללא הגבלת זמן אם עיקור. Agarose יכול להיות מוחלף, אך לא באופן משמעותי לשפר תמונות. - להמיס אגר באמצעות אמבט מיקרוגל או מים ומאפשרים כדי לצנן מעט לפני השימוש. ודא אגר הוא נמס לגמרי נשפך בקלות. צבע אחיד של אגר אכתים אחרת, הפקת תמונות באיכות ירודה.
- העברה מספיק אגר 7.5% (w/v) מומסת הצינור צנטריפוגה כדי להביא האחסון סה כ צינור בין 6.5 ו 9 מ.
- לסכם צנטריפוגה צינורות, בעדינות היפוך לפחות 3 פעמים כדי לערבב.
- תוך כדי שהם מצביעים הכיפה מן האדם עצמו או בשכונה, פתח את הפקק. שופכים את תוכן צינור לתוך פלסטיק 100 מ מ פטרי תוך בעדינות נדנדה המנה כדי להשיג ציפוי מלא, חלק בהתפלגות אחידה מבחינה ויזואלית של חלקיקים.
התראה: בחום אגר עשויה לייצר את הלחץ קלה בצינור. זה לעתים קרובות מייצרת של היס נשמעים, יש פוטנציאל לגרש את טיפות קטנות של אגר חם. - לאפשר את הצלחות להתקרר בטמפרטורת החדר, לפחות 5 דקות, עד אגר עפור.
הערה: הפרוטוקול עשוי להיות עצר כאן. חנות מצופה הפוכה ואטום (למשל, בתוך שקית פלסטיק לאטימת או עם סרט פרפין) עד 48 שעות תחת קירור (4 ° C).
3. לרכוש תמונות של חלקיקים באמצעות stereomicroscope מצלמה דיגיטלית
- מקם את פני צלחת חשפו את הבמה מיקרוסקופ של stereomicroscope מסוגל x 10 כדי 20 x הגדלה. להאיר את הדגימה מלמטה עם תיקו, לפזר אור באמצעות ציוד כגון LED המאייר לעמוד או צלחת אור.
- לפתוח את התוכנה לכידת התמונה, להבטיח שהנתיב מיקרוסקופ אור מוגדר צילוםולחץ על המצלמה המתאימה מתוך הרשימה המצלמה.
- להתאים את המיקרוסקופ כך מרובות חלקיקים מופיעים התוכנה ב מישור מוקד עם קצוות מוגדרים היטב, גדול. להשתמש הגדלה של 10-20 x כדי למדוד חלקיקים תוך שמירה על מטוס מוקד יחסית עמוק.
- הסר את לוחית אגר ולמקם את מיקרומטר באופן זמני על הבמה. התאם את המוקד בסדר עד טקסי-מיקרומטר מופיעים בחדות ממוקד בתוכנה לכידת התמונה.
- אם בעבר לא מכויל, לתעד את הפיקסל מיקרו יחס ההגדלה הנוכחית.
- הגדר את הזום ל- 100% על-ידי לחיצה על זום > גודל ממשי ובחר אפשרויות > כיול ואז ליישר את הסרגל כיול אדום האשנב הראשי לאורך ציר זמן מיקרומטר, עם פסי אנכי מרוכז על סיום לימודים מיקרומטר 0 ו-200. בתיבת הדו-שיח כיול , הזן את רמת ההגדלה הנוכחית ואת האורך הממשי של 200 מיקרומטר.
- אם כבר מכויל בחר ההגדלה של שורת התפריט, בחר ההגדלה הנוכחית ברמה ו לאשר את הכיול.
- בחר המידות > קו > שרירותי קו. לחץ על ההצטלבות של סיום 0, ציר זמן מיקרומטר. לחץ שוב על 200 ו הציר הארוך. בצומת. A נכונה כיול אמורה להציג כ-200 מיקרומטר. למחוק את השורה על-ידי לחיצה עליו, הקשה על delete, והקשה כן בתיבת האישור.
הערה: ההוראות שניתנו לבחירת מצלמה וכיול הספציפיים התוכנה ששימשה עבור חומרה זו. פונקציות דומות צריך להיות זמין תוכנות הדמיה אחרות. המטרה היא לקבוע את הפיקסל מיקרון יחס של התמונה עבור מדידת גודל חלקיקים מדויק.
- בחר המידות > קו > שרירותי קו. לחץ על ההצטלבות של סיום 0, ציר זמן מיקרומטר. לחץ שוב על 200 ו הציר הארוך. בצומת. A נכונה כיול אמורה להציג כ-200 מיקרומטר. למחוק את השורה על-ידי לחיצה עליו, הקשה על delete, והקשה כן בתיבת האישור.
- להחליף את צלחת אגר והתאימו את המוקד בסדר כדי להשיג פרטים מירביים בתוכנת הדמיה.
- להתאים את תוכנת הדמיה כך איכות תמונה מקסימלית מושגת.
- להגדיל את עומק הסיביות לערך המרבי המותר, על-ידי בחירה בלחצן האפשרויות בחלונית ' עומק סיביות ' של הסרגל הצידי המצלמה . להגדיר את התוכנה כדי לרכוש תמונות בגווני אפור על-ידי בחירה בלחצן המתאים בחלונית ' צבע/אפור ' של הסרגל הצידי המצלמה .
- לכווץ את כל לוחות הצידי פתוח בין חשיפה היסטוגרמה. להפחית את הרווח 1.0 ולהגדיל את החשיפה להופעת תמונה ברורה של האשנב, ועד ההיסטוגרמה מופיעה התפלגות זה לא ייחתך על ידי אחד מהקצוות של תיבת היסטוגרמה.
- להתאים את ההיסטוגרמה להימנע לגבי ואת מצילום. בחלונית ' היסטוגרמה ' של סרגל הצד מצלמה, להחליק את הגבול הימני של ההיסטוגרמה אל מחוץ הערכים הנמוכים ביותר ואת הגבול הנכון אל מחוץ הערכים הגבוהים ביותר.
- שמור את התמונה TIFF לא דחוסה, לרבות מידע הגדלה ב- metadata תמונה, באמצעות קובץ > שמירה בשם בתיבת הדו-שיח, בחירת תבנית TIFF, ומבטיחה כי תיבת שמור עם כיול מידע נבדקת.
הערה: שמירת תמונה מטה-נתונים, כולל כיול המרחבי, עשויים להשתנות בין תוכניות רכישה. פיג'י15, התוכנה הבסיסית ששימשה על-ידי הצבר, מבינים גרסאות הנפוץ ביותר. המידע החשוב לתעד הוא פיקסל גובה, רוחב, unit(s) המשויך. - שימוש בכל שלב ניידים או להזיז ידנית את הצלחת עצמה, בחר תחום נוסף, אשר אינו חופף תמונות קודמות, בעקבות נתיב אשר מעבר לסירוגין בין שמאל לימין, מימין-לשמאל כאחד נע למטה את הצלחת; ידוע גם בשם "מכסחת דשא חיפוש דפוס'. חזור על שלב 3.6 עד מספיק תמונות מיוצרים כדי ללכוד חלקיקים באופן חזותי משוער לפחות 500, יותר טובים.
הערה: חלופות דפוסים (למשל., מעגליות, אקראי) מקובלים אבל יש לדווח. רכישת תמונות חופפות מרובות עבור שילוב לתוך. פסיפס דרך דיגיטלי מפיק תפירה וכתוצאה מכך גודל קובץ אשר מאוד מפריע במורד הזרם עיבוד וממצאים מן תפרים עשוי להיות מוצג והיא אינה מומלצת כיום. - שומרים על לוחות עד לאחר ניתוח תמונות עבור פוטנציאל ומעקב הדמיה. לאחר הדמיה הסופי, להתעלם בהתאם לפסולת ביולוגית.
4. למדוד ולנתח חלקיקים צלליות
- התקנת חבילות תוכנה ניתוח התמונה הנדרש
- התקנת פיג'י (גרסה משופרת של ImageJ v1.52e מכוני הבריאות הלאומיים של ההוראות ב: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- התקנת לגית, אם לא שכבר קיים, על פי ההוראות ב: https://git-scm.com/downloads
- רוכשים את הקוד ניתוח חלקיקים על-ידי שיבוט של מאגר לגית16.
- בשורת הפקודה, לאחזור הגירסה האחרונה של הקוד על-ידי הקלדת:
לגית שיבוט https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git- התקן הבאות קוד ניתוח ההוראות בקובץ הטקסט README.md שנמצאו בספריית השורש של המאגר משובטים.
הערה: שימוש לגית הוא המועדף, כמו זה יהיה לאחזר באופן אוטומטי את הגירסה העדכנית ביותר של הקוד. אם לגית אינה זמינה, זה גם אפשרי להוריד את הקוד בתור קובץ zip בדף שחרור ב: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
- התקן הבאות קוד ניתוח ההוראות בקובץ הטקסט README.md שנמצאו בספריית השורש של המאגר משובטים.
- בשורת הפקודה, לאחזור הגירסה האחרונה של הקוד על-ידי הקלדת:
- ערוך את קובץ הטקסט המפרט את הספריות להיות מעובד, יחד עם פרמטרים אופציונליים. עיין ספריית המשנה דוגמאות/ניתוח לקבלת רשימה של פרמטרים ודוגמאות.
- הפעל הניתוח של שורת הפקודה על-ידי הקלדת:
< פיג'י-נתיב > \ImageJ-win64.exe - מסוף - מאקרו SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
כאשר < פיג'י-נתיב > הוא מדריך בהם נמצאת ImageJ-win64.exe ו- < paramsfile > המיקום של קובץ הטקסט המתאר את הכיוונון ניתוח
הערה: שם קובץ ההפעלה עשויים להשתנות, בהתאם פיג'י מערכת ההפעלה המותקנת. בהתאם המספר והגודל של תמונות, הניתוח עלול לקחת כמה דקות עד שעות, יפעלו באופן אוטומטי. - לבצע בדיקת בקרת איכות
- בדוק את בקרת איכות הקבצים הנמצאים המשנה שכבת-על ספריית הפלט שצוינה. הערה תמונות עם כדין, שלא נענו, גרוע שנתפסו חלקיקים, לכאורה כל כקווי מתאר המוצלת אשר אינן תואמות את הרקע. עיין איור 3 לקבלת דוגמאות כאלה. הנתונים חלקיקים מוכנים עכשיו לדור דמות ספציפית בניסוי ניתוח.
- דוחים את כל הצלחות או חלקיקים בודדים על-ידי ציון בקוד ה-ניתוח של קבצים ציין ו/או חלקיק מזהים שיש להתעלם ממנה. עיין דוגמאות/לצנזר במאגר עבור קוד R ופייתון הרלוונטיים.
- ליצור דמויות ספציפיות ניסוי שימוש בתוצאות ניתוח תמונה עבור כל תמונה מאוחסנות בקובץ טקסט מופרדים באמצעות פסיקים מסודר12 ב ספריית המשנה תוצאות של ספריית הפלט שצוינה. עיין ספריות דוגמאות/דמויות/R ודוגמאות/דמויות/פיתון עבור דוגמאות כיצד לקרוא את הקבצים תוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קבצים שנוצרו
התהליך מאויר באיור 1 יהיה לייצר שני קבצים לכל תמונה מנותח. הקובץ הראשון הוא פסיק מופרדים בקובץ הטקסט ערך (CSV) שבו כל שורה מקבילה לאפשרות חלקיקים בודדים ולתאר העמודות מדדים שונים של חלקיקים כגון אזור, מעגליות אחידות הגדרה ידנית ImageJ17. קבצי CSV לדוגמה כלולים כמידע משלים, בספריה דוגמאות/נתונים.
איור 1: זרימת עבודה גרפי המתאר את ארבעת השלבים העיקריים של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הקובץ השני מיועד לשימוש בבקרת איכות (QC) והוא לתמונת GIF קובץ שכבות החלקיקים תמונות עם אזורים אטומים למחצה המייצג מזוהה המקורי, כמו באיור 2. האיכות של חלקיק. וזיהוי פילוח ואז ניתן במהירות ידנית להעריך. אמנם אין שיטה סף חלקיקים מושלם18, באיור 2 מוצג בתור דוגמא תוצאה סבירה. תמונות באיכות ירודה יכול להיות לקחת או אם מספיק נתונים זמין, פשוט יוסר עיבוד נוסף.
איור 2: דוגמה gif ובקרת איכות (QC) שנוצר על-ידי הצבר ניתוח התמונה. הגדלה של התמונה העיקרי 15 x. קטע זה תקריב דיגיטלית כדי להציג את מספרי זיהוי חלקיקים בודדים בתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
בעת הערכת תמונות QC, ישנן שלוש שגיאות נפוצות שנמצאו:
1. כשל לציית במדויק גבולות חלקיקים
2. כשל לזהות חלקיקים
3. החפץ הכללה בשל גם אל: רכיבים שאינם חלקיקים (למשל, בועות) או שגיאות בסף
דוגמאות לשגיאות אלה מומחשים באיור3. חלקיק המסכן גבול וזיהוי פילוח בין חלקיקים לעיתים קרובות היא תוצאה של יתר גוסס, כפי שניתן לראות איור 3 א. תאורה המסכן יכול להוביל הן כשל לזהות חלקיקים (איור 3b, העיגול הכחול מוצק) וחלקיקים החפץ שווא (איור 3b, עיגול מקווקו אדום). Non-חלקיקים משנה, כגון בועות, חד-תאיים, פטריות metazoans, כגון דובוני מים איור 3 ג' גם ניתן לזהות spuriously כמו חלקיקים.
איור 3: שגיאות נפוצות שזוהו במהלך ניתוח QC. () חלקיק המסכן גבול זיהוי. (b) כדין חלקיקים (אליפסה מקווקו אדום), חלקיקים unsegmented (אליפסה כחולה מוצק). (ג) אי-החלקיקים הזרים אובייקט. ההגדלה 15 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
. זה הכי קל לדחות את התמונה כולה. זאת, ניתן להשתמש המזהה חלקיקים בתמונה QC (איור 2, הזחה) לדחות חלקיקים בודדים. גישה זו שימושית במיוחד כאשר יש קומץ של בעיות בתמונה אחרת שימושי (כגון הכללת-חלקיקים) איור 3 ג. דוגמאות עושה אז באופן דיווח הדירים כלולים בספריה לצנזר/דוגמאות של המאגר github.
כאשר צוין קוטר מינימלי קטן (< 10 פיקסלים), הרעש בתמונה עשויה להיות מזוהה spuriously כמו חלקיק. במקרים אלה, התמונה עשויה להיות עדיין להתקבל כאשר עוד ניתוח במורד הזרם הוא מסיר את נוכחותם. כקו מנחה, נתוני צורה יש להתייחס בספקנות כאשר חלקיקים מורכבים פחות מ 200 ~ פיקסלים19.
איור דור
קבצי CSV המתבררת מניתוח תמונת הם מסודרים12 , יכול להיות בקלות בשילוב וניתח בחבילת התוכנה המועדפת של החוקר (כגון פנדות20 עם21 פיתון או dplyr22 עם ggplot223 ב R). עם זאת, סוג הדמות המדויק הנדרש ישתנו בהכרח עם שאלות המחקר ואת התוצאה. דוגמא של דמות אפשרי נכלל מתחת (איור 4), הקוד המתאים כדי ליצור אותו מקבצי CSV זמין על github16.
איור 4: דוגמה של דמות ספציפית ניסוי שנוצר מנתוני CSV המיוצר על-ידי הצבר התמונה. בדוגמה זו, ההפצות חלקיקים בין שני כורים ניסיוני במשך הזמן מוצגים, בשילוב עם מטא-נתונים איכותי מצוינים על-ידי החוקר. ראה דוגמאות/דמויות/R עבור ביצירת הקוד והנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות מערכת ניתוח התמונה היא די חסונים, QC הפעולות הננקטות כדי להבטיח תמונות המסכן יוסרו, תשומת לב המתאים הנושאים הספציפיים דגימה, הכנת צלחת, ייבוא תמונות יכול לשפר גם את הדיוק של הנתונים וגם היחס תמונות עובר QC.
ריכוז דגימה
בהנחה שנלקח מדגם מייצג, הוא הצעד החשוב ביותר כדי להבטיח כי חלקיקים מספיקה נוכח נציג9 וניתוח יעילה בזמן לא כל כך מרוכז כי חלקיקים חופפים.
זה התכתבה כ 0.5 עד 2 מ של משקה מעורבת בטווח רחב של מוצקים על תנאי מוחלט, אבל נחישות ספציפיים ניסוי עשוי להיות נחוץ. דוגמאות מרוכז מדי, יותר מדי - מדולל, ריכוזי חלקיקים המתאימים מוצגים באיור 5 כנקודת התייחסות. צביעת מושפע גם על-ידי ריכוז החלקיקים. לדילול יתר עלולה לגרום חלקיקים מוכתם יתר על המידה, מטושטש תוך דילול שפרמיה לייצר חלקיקים עם חדות מספקת עבור קביעת סף האופטימלי.
איור 5: הפניה תמונות ריכוזי חלקיקים בסה כ מציג אשר מרוכז, מקובל גם מדולל יתר על המידה. ההגדלה 15 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ריכוז לצבוע
הסכום של כתם נוספו המדגם הוא מכריע, הסכום הנכון עשויים להשתנות בין sludges. µL 5 כ 1% (w/v) וורודה לכל 0.5 עד 2 מ של דגימה מספקת חדות מספקת עבור קביעת סף מבלי לגרום "דימום", טשטוש הצורה של החלקיק.
יש ריכוז לא אידיאלי יחיד; יש לבחור איזון בין חדות ובהירות. איור 6 מדגימה זו חליפין שלושת הדגימות מוכתם µL 5, 25 ו- 50 1% וורודה לכל 2 מל של בוצה. שקילה זו חליפין, החלקיק לקוי מנוגדים מזדמנים (איור 6a) נגמר המועדפת לקוי לזיהוי כתמים (איור 6 c).
איור 6: הכתם גדל ריכוז משפר חדות חלקיקים, אבל גם מעוותת את הגבול שנצפו. ההגדלה 15 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
צלחת אחסון
לאחר הנייח, ניתן לאחסן צלחות תחת קירור (4 ° C) במשך לפחות 3 ימים. זה תקופה שמרנית במהלכן אין זה סביר כי מזהמות דיפוזיה צמיחה וצבע יתרחשו. צלחות לא מציג את כל הנושאים המתוארים להלן עשויים עדיין לדימות לאחר 3 ימים. כאשר הוא מאוחסן זמן רב מדי, חלקיקים הקיים עלולה להמשיך לגדול והאם מופיעים במישור המוקד של חלקיקים אחרים תוך שמירה על הגוון של הכתם, כפי שניתן לראות באיור 7 א. משטח מזהמים, כגון נבגים פטרייתיים, יכולים גם לגדול לאחר תקופות ארוכות של אחסון. אלה בדרך כלל לא ייקחו את הצבע של הכתם, יופיעו מטוס מוקד שונים, כפי שניתן לראות באיור 7. במקרים מסוימים, זה לא ברור אם שאירעה יתר או דיפוזיה של הכתם, כגון התחתון של איור 7 ב ומרכז של איור 7c. ללא קשר למטרה, כתמים כגון אלה מציינים שהצלחת הזדקן מעבר תקופת חייו שימושי
איור 7: הפניה תמונות הממחישות overgrowth איתות כי צלחת אוחסן מעבר תקופת חייו שימושי. ההגדלה 15 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הכנת צלחת
ישנן שתי סוגיות הקשורות פיזית מכין את פלטות אגר - יתר על המידה סמיך אגר, מתערבל מוגזמת. במקרה הראשון (איור 8), החלקיקים להיות מושעה בעומקים שונים, ומקשה לרכוש תמונות עם הרוב של חלקיקים בפוקוס.
איור 8: באמצעות עודפות של אגר יפיק מדגם עבה יותר המטוס מוקד, וכתוצאה מכך חלקיקים מטושטש. ההגדלה 15 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
במקרה השני, מתערבל מייצר הפצה לא אחידה של חלקיקים (איור 9 א), ממתח תוצאות ממקטעים שונים של הצלחת (איור 9b, c. בדרך כלל, לא יותר מ 7 מ ל אגר נדרש לכסות צלחת פטרי 100 מ מ, רק תנועות ידיים עדין יש צורך אחיד מכסים את הכלי.
איור 9: מתערבל נמרצת מדי במהלך הכנת צלחת תופיע החלקיקים לא אחידה הפצות (), ממתח מקטעים של הצלחת לכיוון גדול יותר (b), הפצות קטנים יותר של חלקיקים (c). צלחת קוטר 100 מ מ, micrographs מוגדל 15 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הדמיה מיקרוסקופיים
ישנם שני נושאים רכישת התמונה העיקריים המשפיעים על איכות. הסוגיה הראשונה היא להבטיח כי הרוב המכריע של חלקיקים הם ב מישור מוקד. אפילו בהגדלה נמוכה, גודל חלקיקים בוצה מופעל רבים הוא כזה ללא התאמות קלות להתרכז גס, חלקיקים רבים יהיה קצת לא בפוקוס, היכרות עם מדידה מדויקת של חלקיקים. אין תמונה מכילה 100% לגמרי מרוכז חלקיקים; איור 8 המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות בהתאמה דוגמאות המוקד המסכן ומקובל 5b איור .
חשיפה לרמות מהווים ההיבט השני. לקוי נחשפו תמונות לגרום לאיבוד נתונים ופילוח המסכן11. עוד יותר, הניגוד גבוה של לצבוע יכול לייצר היסטוגרמה צר, צמצום הטווח הדינמי יעיל של הנתונים. אולי ניתן לכוונן את חסם של ההיסטוגרמה לפני לכידת תמונה כדי למנוע חשיפה המסכן וגם להגדיל את הטווח הדינמי. דוגמאות של מעל, מתחת, ומקובל חשיפות כלולים להלן איור 10.
איור 10: הפניה תמונות מציג תמונה מסכנה ומקובל חשיפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
היתרונות של שיטה זו הם שהיא מספקת קריטריונים ספציפיים המקיף את התהליך כולו. יתרה מזאת, סיפקנו צינור תוכנה הקלות ניתוח תוך-מעבדה וקידום נתונים דומים בין-lab. המגבלה העיקרית של שיטה זו הוא כי הדרישה לשמור כל החלקיקים ממוקד מונע הגדלה גבוהה, הגבלת השירות שלה עבור חלקיקים עם קטן מידות מינור - ובמיוחד filamentous מבנים. כיוונים לעתיד של שיטה זו יהיה שילוב טכניקות ניתוח תמונה מתקדם (במיוחד רעש הפחתת24,25תמונת טווח דינמי רחב, מיקוד הערימה26,27, למידה חישובית בסיוע סף, פילוח, סיווג28. השיפור רכישת התמונה העיקריים לשלב תוכנה כדי לשלוט שלבים מכני8 לייצר "צלחת מלאה" פסיפס ארכיונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של 1336544 CBET קרן המדע הלאומית.
הלוגוס פיג'י, R ופייתון משמשים עם בהתאם המדיניות סימן ההיכר הבאים:
פיתון: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , לפי רישיון CC-BY-SA 4.0 המפורטים ב: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
פיג ' י: https://imagej.net/Licensing
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
References
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Williams, J. C. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004).
- Moghadam, B. K. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation. , Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012).
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), Available from: http://www.aapspharmscitech.org E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. III Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Available from: http://www.r-project.org (2017).
- van Rossum, G. Python tutorial. , Amsterdam. CS-R9526 (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weaver, J. E. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis. , Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , National Institute of Health. (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- Wickham, H. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. Available from: http://ggplot2.org (2009).
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- Bell, A. A., Brauers, J., Kaftan, J. N., Meyer-Ebrecht, D., Aach, T. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology). 3 (1), Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ 170-184 (2009).
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
