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आकार और सक्रिय कीचड़ कणों के आकार को मापने के एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पाइपलाइन के साथ आगर में मैटीरियल

doi: 10.3791/58963 Published: January 30, 2019

Summary

आकार और सक्रिय कीचड़ में कणों के आकार महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि अलग तरीकों का उपयोग कर मापा जाता है । अशुद्धियाँ गैर-प्रतिनिधि नमूना, इष्टतम छवियों, और व्यक्तिपरक विश्लेषण मापदंडों से उत्पन्न होती हैं । इन त्रुटियों को कम करने और माप कम करने के लिए, हम एक खुला स्रोत सॉफ़्टवेयर पाइपलाइन सहित प्रत्येक चरण निर्दिष्ट प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

ऐसे अपशिष्ट जल के इलाज के रूप में प्रयोगात्मक, प्रतिक्रियात्मक, कणों जिसका आकार और आकार महत्वपूर्ण पैरामीटर होते हैं । उदाहरण के लिए, आकार और सक्रिय कीचड़ flocs के आकार अतिसूक्ष्म में शर्तों का संकेत कर सकते हैं, और यह भी सीधे प्रभावित कैसे अच्छी तरह से कीचड़ एक स्पष्ट में बैठती है ।

कण आकार और आकार दोनों ' बहुत ' सरल माप रहे हैं । कई सूक्ष्म मुद्दों, अक्सर अनौपचारिक प्रोटोकॉल में पता नहीं, जब नमूना, इमेजिंग, और विश्लेषण कणों पैदा कर सकते हैं । नमूना विधियों या पक्षपाती पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति प्रदान नहीं किया जा सकता है । नमूनों स्वयं खराब हो सकता है संरक्षित या स्थिरीकरण के दौरान परिवर्तन से गुजरना । छवियां पर्याप्त गुणवत्ता की नहीं हो सकती हैं; अतिव्यापी कणों, क्षेत्र की गहराई, आवर्धन स्तर, और विभिन्न शोर सभी गरीब परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं. खराब निर्दिष्ट विश्लेषण पूर्वाग्रह, जैसे कि मैनुअल छवि थ्रेसहोल्ड और विभाजन द्वारा उत्पादित का परिचय कर सकते हैं ।

सामर्थ्य और प्रवाह reproducibility के साथ वांछनीय हैं । एक किफायती, उच्च प्रवाह विधि और अक्सर कण माप सक्षम कर सकते हैं, कई कणों के हजारों युक्त छवियों का निर्माण । एक तरीका है कि सस्ती रिएजेंट, एक आम विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है, और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध खुला स्रोत विश्लेषण सॉफ्टवेयर दोहराया, सुलभ, reproducible, और आंशिक रूप से स्वचालित प्रयोगात्मक परिणाम की अनुमति देता है । इसके अलावा, इस तरह के एक विधि के उत्पाद अच्छी तरह से स्वरूपित, अच्छी तरह से परिभाषित किया जा सकता है, और आसानी से डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा समझ में, दोनों के भीतर प्रयोगशाला विश्लेषण और प्रयोगशालाओं के बीच डेटा साझा सहजता ।

हम एक प्रोटोकॉल है कि इस तरह के एक उत्पाद के उत्पादन के लिए आवश्यक कदम विवरण प्रस्तुत करते हैं, सहित: नमूना, नमूना तैयारी और आगर में स्थिरीकरण, डिजिटल छवि अधिग्रहण, डिजिटल छवि विश्लेषण, और से प्रयोग विशेष आंकड़ा पीढ़ी के उदाहरण विश्लेषण परिणाम । हमने इस प्रोटोकॉल का समर्थन करने के लिए एक खुला-स्रोत डेटा विश्लेषण पाइपलाइन भी शामिल किया है ।

Introduction

इस विधि के प्रयोजन के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित, दोहराया, और आंशिक रूप से-स्वचालित विधि का निर्धारण करने के लिए आकार और प्रतिक्रियाशीलता में कणों की आकृति वितरण, विशेष रूप से युक्त उन सक्रिय कीचड़ flocs और एरोबिक granules1 प्रदान करने के लिए है , 2. इस विधि के पीछे तर्क की सामर्थ्य, सादगी, प्रवाह को बढ़ाने के लिए थे, और हमारे मौजूदा घर में प्रोटोकॉल3,4, दूसरों के लिए आसानी कण माप की पुनरावृत्ति, और साझा करने की सुविधा और डेटा की तुलना ।

कण माप विश्लेषण की दो व्यापक श्रेणियां हैं-प्रत्यक्ष इमेजिंग और तरजीही तरीके जैसे गुणों का उपयोग करते हुए प्रकाश कैटरिंग5. हालांकि तरजीही तरीकों को स्वचालित किया जा सकता है और बड़े प्रवाह है, उपकरण महंगा है । इसके अलावा, जबकि तरजीही तरीके सही एक कण6के बराबर आकार निर्धारित कर सकते हैं, वे विस्तृत आकार जानकारी7प्रदान नहीं करते ।

आकार डेटा की आवश्यकता के कारण, हम प्रत्यक्ष इमेजिंग पर हमारे विधि आधारित है । जबकि कुछ उच्च प्रवाह इमेजिंग तरीकों मौजूद हैं, वे परंपरागत रूप से या तो महंगी वाणिज्यिक हार्डवेयर या कस्टम निर्मित समाधान8,9की आवश्यकता है । हमारे विधि आम, सस्ती हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर है कि, हालांकि प्रवाह में कमी से पीड़ित, कई विश्लेषण10के लिए आवश्यक ंयूनतम से कहीं अधिक कण छवियों का उत्पादन, रोजगार के लिए विकसित किया गया है ।

मौजूदा प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण नमूना और छवि प्राप्ति चरणों को निर्दिष्ट नहीं कर सकते हैं । अंय प्रोटोकॉल व्यक्तिपरक बायस (जैसे कि तदर्थ थ्रेशोल्ड11) का परिचय देने वाले मैंयुअल चरण निर्दिष्ट कर सकते हैं । एक अच्छी तरह से परिभाषित विधि है कि नमूना, स्थिरीकरण और छवि अधिग्रहण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त कदम दोनों के भीतर प्रयोगशाला छवि विश्लेषण और प्रयोगशालाओं के बीच तुलना में वृद्धि होगी निर्दिष्ट करता है । इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लक्ष्य एक कार्यप्रवाह और उपकरण है कि एक ही नमूना के लिए विभिंन प्रयोगशालाओं से reproducible परिणाम के लिए नेतृत्व करना चाहिए प्रदान करना है ।

छवि विश्लेषण प्रक्रिया को सामान्य करने के अलावा, इस पाइपलाइन द्वारा उत्पादित डेटा एक अच्छी तरह से परिभाषित, अच्छी तरह से स्वरूपित फ़ाइल में दर्ज किया गया है12 लोकप्रिय डेटा विश्लेषण द्वारा उपयोग के लिए उपयुक्त13,14, सहजता प्रयोग विशिष्ट विश्लेषण (जैसे कस्टम चित्रा पीढ़ी के रूप में) और प्रयोगशालाओं के बीच डेटा साझा करने की सुविधा.

इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से शोधकर्ताओं जो कण आकार डेटा की आवश्यकता होती है के लिए सुझाव दिया है, को तरजीही तरीकों तक पहुंच नहीं है, अपनी छवि विश्लेषण पाइपलाइन विकसित करने की इच्छा नहीं है, और दूसरों के साथ आसानी से अपने डेटा साझा करना चाहते है

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Protocol

1. कण विश्लेषण के लिए नमूने ले लीजिए

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त कणों का उत्पादन होगा कि विशिष्ट रिएक्टरों के लिए नमूना मात्रा का निर्धारण10 (> 500) जबकि कण ओवरलैप से परहेज.
    1. मान लें कि मिश्रित शराब का नमूना प्रति 2 मिलीलीटर के लिए ०.५ की एक सीमा के साथ सक्रिय कीचड़ नमूनों के लिए पर्याप्त है एक मिश्रित शराब निलंबित ठोस (MLSS) के बीच २५० और ५,००० mg/
    2. अंयथा, ०.५, 2, और नमूना (चरण १.२ के माध्यम से २.७) के 5 मिलीलीटर का उपयोग कर तीन परीक्षण आगार प्लेट्स तैयार करें ।
    3. नेत्रहीन अनुमान है जो (यदि कोई हो) नमूना खंड सबसे अच्छा चरण १.१ में सूचीबद्ध मापदंड को पूरा ।
    4. यदि कणों अभी भी ०.५ मिलीलीटर नमूना के लिए ओवरलैप, दोहराएं कदम 1.1.2 और 1.1.3 तीन ०.५ मिलीलीटर एक जोड़ा ०.५, 1 के साथ पतला नमूनों के साथ, और फास्फेट के 2 मिलीलीटर की डिग्री निर्धारित करने के लिए जो एक ०.५ मिलीलीटर का नमूना पहले से पतला होना चाहिए कदम २.१ ।
      नोट: चरण १.१ − 1.1.4 केवल प्रयोग के प्रति एक बार प्रदर्शन करने की आवश्यकता है, या यदि रिएक्टर सामग्री परिवर्तन इस तरह के बाद माप अब चरण १.१ में सूचीबद्ध मानदंडों को पूरा ।
  2. एक से एक प्रतिनिधि नमूना प्राप्त रिएक्टर के एक अच्छी तरह से मिश्रित भाग से हथियाने ~ ४० मिलीलीटर में एक चोंच या ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब, धीरे मिश्रण, और तुरंत एक 15 एमएल में अच्छी तरह से मिश्रित हड़पने के निर्धारित नमूना मात्रा डालना ट्यूब केंद्रापसारक । नमूना पतला, आवश्यक, के रूप में 1.1.4 कदम द्वारा निर्धारित ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और नमूना प्रशीतन (4 डिग्री सेल्सियस) के तहत ४८ घंटे तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । नमूने को फ़्रीज़ न करें ।
    चेतावनी: आम संरक्षण मीडिया (जैसे, formaldehyde/formamide) उपयुक्त नहीं हैं । प्लेट की बड़ी सतह क्षेत्र, खुले कंटेनर के साथ संयोजन में, प्रकाश स्रोत से गर्मी, और संभावित खराब हवादार माइक्रोस्कोपी सेटअप छवि गुणवत्ता में थोड़ा लाभ के लिए अनावश्यक रूप से खतरनाक स्थितियों का उत्पादन ।

2. तैयार आगर दाग, मैटीरियल कणों की प्लेटें

  1. 1% के 5 µ एल जोड़ें (डब्ल्यू/वी) methylene नीले रंग के प्रत्येक नमूने के लिए, तो टोपी और धीरे से 3 पर कम बार पलटना मिश्रण करने के लिए । नमूनों की अनुमति दें के लिए कम से 5 लेकिन कोई अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दाग ।
  2. ७.५% (w/v) के नमूने प्रति लगभग 10 मिलीलीटर तैयार पानी में आगर ।
    नोट: आगर समय से आगे का उत्पादन किया जा सकता है और अगर निष्फल अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत । Agarose प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन नहीं काफी छवियों में सुधार होगा ।
  3. पिघल एक माइक्रोवेव या पानी के स्नान का उपयोग कर आगर और उपयोग करने से पहले थोड़ा ठंडा करने की अनुमति । सुनिश्चित करें कि आगर पूरी तरह से पिघल गया है और आसानी से डाल देता है । आगर के ठोस globules अलग दाग, गरीब गुणवत्ता छवियों का उत्पादन होगा ।
  4. हस्तांतरण पर्याप्त पिघला ७.५% (डब्ल्यू/वी) के केंद्रापसारक ट्यूब के लिए कुल ट्यूब मात्रा लाने के लिए ६.५ और 9 मिलीलीटर के बीच ।
  5. हालात केंद्रापसारक ट्यूबों और धीरे मिश्रण करने के लिए कम से कम 3 बार पलटना ।
  6. जबकि टोपी अपने आप से दूर या एक हुड में ओर इशारा करते हुए, टोपी खोलो । एक १०० mm प्लास्टिक पेट्री डिश में ट्यूब सामग्री डालो, जबकि धीरे पकवान एक पूर्ण, चिकनी कोटिंग और कणों की एक नेत्रहीन वर्दी वितरण को प्राप्त करने के लिए कमाल ।
    चेतावनी: आगर से गर्मी ट्यूब में एक मामूली दबाव का उत्पादन हो सकता है । यह अक्सर एक श्रव्य फुफकार का उत्पादन और गर्म आगार की छोटी बूंदों को निष्कासित करने की क्षमता है ।
  7. की अनुमति प्लेटों के लिए कमरे के तापमान पर शांत करने के लिए कम से 5 मिनट, जब तक आगर जम ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । प्लेटेड औंधा और सील (उदाहरण के लिए, एक सील प्लास्टिक बैग में या आयल फिल्म के साथ) प्रशीतन (4 डिग्री सेल्सियस) के तहत ४८ घंटे तक के लिए ।

3. एक stereomicroscope और डिजिटल कैमरा का उपयोग कण छवियों मोल

  1. खुला प्लेट एक stereomicroscope 10x 20x आवर्धन करने में सक्षम की माइक्रोस्कोप मंच पर चेहरा ऊपर रखें । यहां तक कि के साथ नीचे से नमूना रोशन, एक एलईडी प्रकाशक खड़े या प्रकाश प्लेट जैसे उपकरणों का उपयोग कर प्रकाश फैलाना ।
  2. छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर खोलें, सुनिश्चित माइक्रोस्कोप प्रकाश पथ तस्वीरके लिए सेट है, और कैमरा सूची से उपयुक्त कैमरे पर क्लिक करें ।
  3. कई कणों बड़े, अच्छी तरह से परिभाषित किनारों के साथ फोकल विमान में सॉफ्टवेयर में दिखाई देते हैं ताकि माइक्रोस्कोप को समायोजित करें । एक अपेक्षाकृत गहरी फोकल विमान को बनाए रखते हुए कणों को मापने के लिए 10-20x के एक आवर्धन का उपयोग करें ।
    1. अस्थाई रूप से आगर प्लेट निकालें और माइक्रोमीटर को मंच पर जगह दें । माइक्रोमीटर पर स्नातकों को तेजी से छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर में ध्यान केंद्रित दिखाई जब तक ठीक ध्यान समायोजित करें ।
    2. यदि पहले नपे नहीं, मौजूदा आवर्धन के लिए माइक्रो अनुपात करने के लिए पिक्सेल रिकॉर्ड ।
      1. ज़ूम > वास्तविक आकार पर क्लिक करके १००% करने के लिए ज़ूम सेट करें और विकल्प का चयन > जांच तो माइक्रोमीटर की लंबी धुरी के साथ मुख्य viewport में लाल अंशांकन पट्टी संरेखित करें, ऊर्ध्वाधर सलाखों के साथ 0 और २०० µm स्नातकों पर केंद्रित । जांचना संवाद बॉक्स में, वर्तमान आवर्धन स्तर और २०० µm की वास्तविक लंबाई दर्ज करें ।
    3. यदि पहले से ही मेनू पट्टी, और वर्तमान आवर्धन स्तर का चयन करें और अंशांकन की पुष्टि से आवर्धन का चयन करें नपे ।
      1. माप > लाइन > मनमाने ढंग से लाइनका चयन करें । माइक्रोमीटर के 0 स्नातक और लंबी धुरी के चौराहे पर क्लिक करें । २०० और लंबी धुरी पर चौराहे पर फिर से क्लिक करें । एक सही अंशांकन लगभग २०० µm प्रदर्शित करना चाहिए । उस पर क्लिक करके, delete दबाकर, और पुष्टिकरण बॉक्स पर हाँ दबाकर लाइन हटाएँ.
        नोट: कैमरा और अंशांकन का चयन करने के लिए दिए गए निर्देश इस हार्डवेयर के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर के लिए विशिष्ट हैं । इसी तरह के कार्य अन्य इमेजिंग सॉफ्टवेयर में उपलब्ध होना चाहिए. लक्ष्य के लिए सटीक कण आकार माप के लिए छवि के माइक्रोन अनुपात पिक्सेल निर्धारित करने के लिए है ।
  4. आगर प्लेट बदलें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर में अधिकतम विस्तार प्राप्त करने के लिए ठीक ध्यान समायोजित करें ।
  5. ताकि अधिकतम छवि गुणवत्ता हासिल की है इमेजिंग सॉफ्टवेयर को समायोजित करें ।
    1. कैमरा साइडबार के बिट गहराई पैनल में रेडियो बटन का चयन करके, अनुमत अधिकतम मान के लिए बिट गहराई बढ़ाएँ. कैमरा साइडबार के रंग/ग्रे पैनल में उपयुक्त रेडियो बटन का चयन करके ग्रेस्केल छवियों को प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें ।
    2. एक्सपोज़र और हिस्टोग्राम के बीच किसी भी खुले साइडबार पैनल को संक्षिप्त करें । १.० करने के लिए लाभ को कम करें और जब तक कि एक स्पष्ट छवि viewport में प्रकट होता है और हिस्टोग्राम के रूप में प्रकट होता है जब तक कि या तो हिस्टोग्राम बॉक्स के अंत द्वारा काटा हुआ नहीं है, तो एक्सपोज़र बढ़ाएँ ।
    3. अधिक और जोखिम से बचने के लिए हिस्टोग्राम समायोजित करें । कैमरा साइड बार के हिस्टोग्राम पैनल में, हिस्टोग्राम की बाईं सीमा को अभी निंनतम मानों और उच्चतम मानों के बाहर दाईं सीमा के बाहर स्लाइड करें ।
  6. छवि को किसी संपीडित TIFFके रूप में सहेजें, छवि मेटाडेटा में आवर्धन जानकारी सहित, फ़ाइल > इस रूप में सहेजें संवाद बॉक्स का उपयोग कर, TIFF स्वरूप का चयन करें, और यह सुनिश्चित करना कि अंशांकन जानकारी के साथ सहेजें बॉक्स चेक किया गया है ।
    नोट: विशेष अंशांकन सहित छवि मेटाडेटा को सहेजना, प्राप्ति प्रोग्राम के बीच भिन्न हो सकता है. फिजी15, पाइपलाइन द्वारा इस्तेमाल किया अंतर्निहित सॉफ्टवेयर, सबसे आम वेरिएंट समझता है । रिकॉर्ड करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी पिक्सेल ऊंचाई, चौड़ाई और संबद्ध इकाई (ओं) है ।
  7. या तो एक मोबाइल मंच का उपयोग या मैंयुअल रूप से प्लेट ही चलती है, एक और क्षेत्र है, जो पिछले छवियों को ओवरलैप नहीं करता है का चयन करें, एक रास्ता है जो बाएं-से-दाएं और दाएं-से-बाएं के बीच के विकल्प के बाद नीचे एक चाल प्लेट; भी एक ' lawnmower खोज पैटर्न ' के रूप में जाना जाता है । दोहराएँ चरण ३.६ जब तक पर्याप्त छवियों पर कब्जा करने के लिए उत्पादित कर रहे हैं कम से ५०० नेत्रहीन अनुमानित कणों, और अधिक बेहतर कर रहे हैं.
    नोट: वैकल्पिक पैटर्न (जैसे, परिपत्र, यादृच्छिक) स्वीकार्य हैं, लेकिन रिपोर्ट किया जाना चाहिए । डिजिटल सिलाई के माध्यम से एक मोज़ेक में संयोजन के लिए कई अतिव्यापी छवियों को प्राप्त करने के एक जिसके परिणामस्वरूप फ़ाइल आकार जो बहुत बहाव प्रसंस्करण और सिलाई से कलाकृतियों में रुकावट पेश किया जा सकता है और वर्तमान में अनुशंसित नहीं है पैदा करता है ।
  8. संभावित अनुवर्ती इमेजिंग के लिए छवि विश्लेषण के बाद तक प्लेटें बनाए रखें । अंतिम इमेजिंग के बाद, जैविक अपशिष्ट के लिए उपयुक्त के रूप में त्यागें ।

4. माप और विश्लेषण कण सिल्हूट

  1. आवश्यक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज स्थापित करें
    1. फिजी स्थापित करें (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के एक उंनत संस्करण ImageJ v 1.52 e निर्देशों का पालन में: https://imagej.net/Fiji/Downloads
    2. git स्थापित करें, यदि पहले से ही मौजूद नहीं है, पर निर्देशों का पालन करके: https://git-scm.com/downloads
    3. अंक भंडार16क्लोनिंग से कण विश्लेषण कोड प्राप्त ।
      1. कमांड लाइन पर, कोड का नवीनतम संस्करण टाइप करके पुनर्प्राप्त करें:
        git क्लोन https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
        1. क्लोन रिपॉसिटरी की शीर्ष-स्तरीय निर्देशिका में README.md पाठ फ़ाइल में निर्देशों का अनुसरण करते हुए विश्लेषण कोड स्थापित करें ।
          नोट: git का उपयोग करना पसंद है, के रूप में यह स्वचालित रूप से कोड का नवीनतम संस्करण प्राप्त होगा । यदि git उपलब्ध नहीं है, यह भी जारी पृष्ठ पर एक ज़िप फ़ाइल के रूप में कोड को डाउनलोड करने के लिए संभव है: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
    4. वैकल्पिक मापदंडों के साथ, संसाधित किया जा करने के लिए निर्देशिकाओं लिस्टिंग एक पाठ फ़ाइल संपादित करें । पैरामीटर्स और उदाहरणों की सूची के लिए उदाहरणों/विश्लेषण उपनिर्देशिका का संदर्भ लें ।
  2. आदेश पंक्ति पर विश्लेषण लिखकर चलाएं:
    < फिजी-पथ > \ImageJ-win64.exe--सांत्वना-स्थूल SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
    जहां < फिजी-पथ > है निर्देशिका जिसमें ImageJ-win64. exe स्थित है और paramsfile < विश्लेषण सेटअप का वर्णन करने वाले पाठ फ़ाइल का स्थान >
    नोट: निष्पादन योग्य का नाम जो ऑपरेटिंग सिस्टम फिजी पर स्थापित किया गया है के आधार पर अलग हो सकता है । संख्या और छवियों के आकार के आधार पर, विश्लेषण घंटे के लिए कुछ मिनट लग सकते हैं और स्वचालित रूप से चलेंगे.
  3. गुणवत्ता नियंत्रण जांच करें
    1. गुणवत्ता नियंत्रण निर्दिष्ट आउटपुट निर्देशिका के ओवरले उपनिर्देशिका में स्थित फ़ाइलों की जांच करें । नकली के साथ छवियों को ध्यान दें, चूक, और खराब कब्जा कर लिया कणों, सभी स्पष्ट छायांकित रूपरेखा जो पृष्ठभूमि से मेल नहीं खाती के रूप में । इस तरह के उदाहरण के लिए चित्रा 3 का संदर्भ लें । कण डेटा अब प्रयोग विशेष विश्लेषण चित्रा पीढ़ी के लिए तैयार हैं ।
  4. या तो पूरी प्लेटें या व्यक्तिगत कणों विश्लेषण कोड में निर्दिष्ट द्वारा अस्वीकार करें नोट की गई फ़ाइलें और/या कण IDs पर ध्यान नहीं दिया जा करने के लिए । उदाहरण के लिए देखें/प्रासंगिक आर और पायथन कोड के लिए भंडार में सेंसर ।
  5. प्रयोग विशिष्ट आंकड़े प्रत्येक छवि के लिए छवि विश्लेषण परिणामों का उपयोग कर उत्पंन एक साफ12 अल्पविराम अलग पाठ फ़ाइल में निर्दिष्ट आउटपुट निर्देशिका के परिणाम उपनिर्देशिका में संग्रहित कर रहे हैं । परिणाम फ़ाइलों को पढ़ने के लिए कैसे करें के उदाहरणों के लिए उदाहरण के लिए देखें/आंकड़े/R और उदाहरण/

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Representative Results

जनरेट की गई फ़ाइलें
इस प्रक्रिया के चित्र 1 में सचित्र छवि प्रति दो फ़ाइलों का उत्पादन होगा विश्लेषण किया । पहली फ़ाइल एक कॉमा सेपरेटेड वैल्यू (CSV) पाठ फ़ाइल है जहां प्रत्येक पंक्ति किसी एक कण से मेल खाती है और स्तंभ विभिंन कण मैट्रिक्स जैसे क्षेत्र, वृत्ति और समेकन का वर्णन करते है और ImageJ मैंयुअल17में परिभाषित किए जाते हैं । उदाहरण CSV फ़ाइलें पूरक जानकारी के रूप में और उदाहरणों/डेटा निर्देशिका में शामिल हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: ग्राफिकल कार्यप्रवाह प्रोटोकॉल के चार प्रमुख चरणों का वर्णन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

दूसरी फ़ाइल गुणवत्ता नियंत्रण (QC) में उपयोग के लिए करना है और एक GIF छवि फ़ाइल जो अर्द्ध अपारदर्शी क्षेत्रों की पहचान की कणों का प्रतिनिधित्व करने के साथ मूल छवि ओवरले, चित्रा 2के रूप में है । कण पहचान और विभाजन की गुणवत्ता तो जल्दी से मैंयुअल रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है । हालांकि कोई कण थ्रेसहोल्ड विधि18परिपूर्ण है, चित्रा 2 एक स्वीकार्य परिणाम का एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया है । गरीब गुणवत्ता छवियों या तो लिया जा सकता है, या यदि पर्याप्त डेटा उपलब्ध है, बस आगे प्रसंस्करण से हटा दिया ।

Figure 2
चित्रा 2: छवि विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा जनरेट किया गया एक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) gif का उदाहरण । मुख्य छवि 15x का इज़ाफ़ा । अंश डिजिटल छवि में व्यक्तिगत कणों की पहचान संख्या दिखाने के लिए ज़ूम है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

QC छवियों का मूल्यांकन करते समय, तीन सामान्य त्रुटियां पाई जाती हैं:
1. सही कण सीमाओं के अनुरूप करने के लिए विफलता
2. कणों की पहचान करने में विफलता
3. विरूपण साक्ष्य शामिल करने के कारण या तो: गैर कण घटकों (जैसे, बुलबुले), या थ्रेसहोल्ड में त्रुटि

इन त्रुटियों के उदाहरण चित्र 3में सचित्र हैं । गरीब कण सीमा पहचान और कणों के बीच विभाजन अक्सर अधिक मरने का एक परिणाम है, के रूप में चित्र 3ए में देखा । गरीब रोशनी दोनों कणों की पहचान करने के लिए विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (चित्र बी, ब्लू ठोस सर्कल) और मूर्ति झूठी कणों (चित्र बी, लाल डैश्ड सर्कल). नॉन-पार्टिकल मैटर, जैसे बुलबुले, प्रोटोजोआ, कवक, और metazoans, जैसे चित्रा 3 सी में tardigrade भी कणों के रूप में पहचाना spuriously किया जा सकता है ।

Figure 3
चित्रा 3: QC विश्लेषण के दौरान सामांय त्रुटियां पाई गईं । () गरीब कण सीमा का पता लगाने । () नकली कणों (लाल डैश्ड दीर्घवृत्त) और अनविभाजित कणों (नीली ठोस दीर्घवृत्त) । () विदेशी गैर-कण वस्तु । आवर्धन 15x । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

यह पूरी छवि को अस्वीकार करने के लिए सबसे आसान है । हालांकि, यह एक अलग कणों को अस्वीकार करने के लिए QC छवि (चित्रा 2, इनसेट) में कण पहचानकर्ता का उपयोग करने के लिए संभव है । इस दृष्टिकोण विशेष रूप से उपयोगी है जब एक अंयथा उपयोगी छवि (जैसे गैर कणों के शामिल किए जाने के रूप में) चित्रा 3सी में मुद्दों की एक मुट्ठी भर रहे हैं । एक reproducible में ऐसा करने के उदाहरण और रिपोर्टत्मक तरीके से github भंडार की निर्देशिका में शामिल है/

जब एक छोटा सा न्यूनतम व्यास (< 10 पिक्सेल) निर्दिष्ट किया जाता है, छवि शोर एक कण के रूप में पहचाना spuriously हो सकता है । उन मामलों में, छवि अभी भी स्वीकार किया जा सकता है जब आगे बहाव विश्लेषण उनकी उपस्थिति हटा दिया जाता है । एक दिशानिर्देश के रूप में, आकार डेटा संदेह के साथ इलाज किया जाना चाहिए जब कणों से कम से बना रहे हैं ~ २०० पिक्सेल19.

चित्रा जनरेशन
CSV छवि विश्लेषण से उत्पंन फ़ाइलें साफ कर रहे है12 और आसानी से संयुक्त किया जा सकता है और शोधकर्ता पसंदीदा सॉफ्टवेयर पैकेज में विश्लेषण (जैसे seaborn21 के साथ अजगर या 23 ggplot2 के साथ22 dplyr में20 के साथ पांडा के रूप में R में) । हालांकि, सटीक आंकड़ा प्रकार जरूरी अनुसंधान के सवालों और परिणाम के साथ अलग भिंन होगा । एक संभव आंकड़ा का एक उदाहरण नीचे शामिल है (चित्रा 4) और इसी कोड को CSV फ़ाइलों से उत्पंन करने के लिए github पर उपलब्ध है16

Figure 4
चित्रा 4: प्रयोग-विशेष छवि पाइपलाइन द्वारा उत्पादित सीएसवी डेटा से उत्पंन आंकड़ा का उदाहरण । इस उदाहरण में, समय के साथ दो प्रायोगिक रिएक्टरों के बीच कण वितरण प्रदर्शित होते है और शोधकर्ता द्वारा नोट किए गए गुणात्मक मेटाडेटा के साथ संयोजित होते हैं । जनरेटिंग कोड और डेटा के लिए उदाहरण/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि छवि विश्लेषण प्रणाली काफी मजबूत है और QC कदम गरीब छवियों को सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है हटा रहे हैं, नमूना, थाली तैयारी में विशिष्ट मुद्दों पर उचित ध्यान, और छवि अधिग्रहण डेटा की सटीकता और दोनों के अनुपात में सुधार कर सकते है छवियां QC पासिंग ।

नमूना एकाग्रता
एक प्रतिनिधि नमूना मान लिया गया है, सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि पर्याप्त कणों प्रतिनिधि9 और कुशल विश्लेषण के लिए मौजूद हैं, जबकि इतना ध्यान केंद्रित नहीं है कि कणों ओवरलैप ।

यह कुल निलंबित ठोस की एक विस्तृत श्रृंखला पर मिश्रित शराब के लगभग ०.५ से 2 मिलीलीटर से संबंधित है, लेकिन प्रयोग विशेष निर्धारण आवश्यक हो सकता है । पीढ़ी केंद्रित, पीढ़ी-पतला, और उपयुक्त कण सांद्रता के उदाहरण एक संदर्भ के रूप में चित्रा 5 में दिखाए जाते हैं । धुंधला कण एकाग्रता से भी प्रभावित होता है । अधिक कमजोर पड़ने से अत्यधिक दाग, धुँधले कणों में परिणाम कर सकते हैं, जबकि कमजोर पड़ने के कारण इष्टतम सीमा के लिए पर्याप्त कंट्रास्ट के साथ कणों का उत्पादन नहीं हो सकता है ।

Figure 5
चित्रा 5: संदर्भ छवियों कण सांद्रता जो भी ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, स्वीकार्य, और पीढ़ी पतला दिखा । आवर्धन 15x । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

डाई एकाग्रता
दाग की मात्रा नमूना में जोड़ा महत्वपूर्ण है और सही राशि कीचड़ के बीच भिन्न हो सकते हैं । लगभग 5 µ l of 1% (w/v) methylene नीले ०.५ प्रति 2 नमूने के मिलीलीटर ' रक्तस्राव ' के कारण बिना थ्रेसहोल्ड के लिए पर्याप्त विपरीत प्रदान करता है और कण के आकार अस्पष्ट ।

कोई एक आदर्श एकाग्रता नहीं है; इसके विपरीत और स्पष्टता के बीच एक संतुलन चुना जाना चाहिए । चित्रा 6 तीन नमूने में इस tradeoff दिखाता है 5, 25 और ५० µ l के साथ सना हुआ 1% methylene नीले रंग की 2 मिलीलीटर प्रति कीचड़ की । जब इस tradeoff वजनी, सामयिक खराब विषम कण (चित्रा 6a) खराब संपति blobs (चित्रा 6c) से अधिक पसंद है ।

Figure 6
चित्रा 6: बढ़ दाग एकाग्रता कण कंट्रास्ट में सुधार, लेकिन यह भी मनाया सीमा विकृत । आवर्धन 15x । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्लेट भंडारण
स्थिरीकरण के बाद, प्लेटों को प्रशीतन (4 डिग्री सेल्सियस) के तहत कम से 3 दिनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है । यह एक रूढ़िवादी अवधि के दौरान जो यह संभावना नहीं है कि दूषित विकास और डाई प्रसार हो जाएगा है । नीचे वर्णित मुद्दों के किसी भी नहीं दिखा प्लेटें अभी भी 3 दिनों के बाद imaged हो सकता है । जब भी लंबे समय के लिए संग्रहीत, मौजूदा कणों को विकसित करने के लिए जारी रख सकते हैं और दाग की छटा को बनाए रखते हुए अन्य कणों के फोकल विमान में दिखाई देगा, के रूप में चित्रा 7aमें देखा जा सकता है । कवक बीजाणु जैसे सतही दूषित पदार्थों का भंडारण लंबे समय के बाद भी बढ़ सकता है । ये आम तौर पर दाग का रंग नहीं ले जाएगा और एक अलग फोकल विमान में दिखाई देगा, के रूप में चित्रा 7bमें देखा जा सकता है । कुछ मामलों में, यह स्पष्ट नहीं है कि अधिक वृद्धि या दाग की प्रसार हुआ है, जैसे चित्रा 7b के तल में और चित्रा 7cके केंद्र । कारण की परवाह किए बिना, धब्बे जैसे उन संकेत प्लेट अपनी उपयोगी जीवनकाल से परे वृद्ध है

Figure 7
चित्रा 7: संदर्भ छवियों एक प्लेट अपनी उपयोगी जीवनकाल से परे संग्रहीत किया गया है कि संकेतन अधिक वृद्धि illustrating. आवर्धन 15x । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

थाली तैयारी
भौतिक रूप से आगर प्लेट्स-ओवरआल मोटी आगर और अत्यधिक घूमता हुआ तैयार करने से जुड़े दो मुद्दे हैं. पहले मामले (चित्रा 8) में, कणों विभिन्न गहराई पर निलंबित हो जाते हैं, यह मुश्किल ध्यान में कणों के बहुमत के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए बना रही है.

Figure 8
चित्र 8: आगर की अत्यधिक मात्रा का उपयोग कर एक नमूना फोकल विमान की तुलना में मोटा उत्पादन होगा, धुँधली कणों में जिसके परिणामस्वरूप. आवर्धन 15x । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

दूसरे मामले में घूमता हुआ एक गैर-समान वितरण कणों (फिगर 9a) का उत्पादन करता है, प्लेट के विभिन्न वर्गों से परिणाम पक्षपातपूर्ण (फिगर 9b, सी. आम तौर पर, नहीं आगर के 7 मिलीलीटर से अधिक एक १०० mm पेट्री डिश को कवर करने के लिए आवश्यक है और केवल कोमल हाथ गति को समान रूप से पकवान कवर की जरूरत है ।

Figure 9
चित्र 9: पीढ़ी-जोरदार थाली तैयारी के दौरान घूमता गैर-यूनिफ़ॉर्म कण वितरण के रूप में दिखाई देगा (), बड़ा () और छोटे () कण वितरण की दिशा में प्लेट के वर्गों पक्षपातपूर्ण. प्लेट १०० मिमी व्यास, माइक्रोग्राफ बढ़ाया 15x है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सूक्ष्म इमेजिंग
वहां दो प्रमुख छवि अधिग्रहण गुणवत्ता को प्रभावित करने के मुद्दों रहे हैं । पहला मुद्दा यह सुनिश्चित कर रहा है कि अधिकांश कणों के फोकल विमान में हैं । यहां तक कि कम आवर्धन पर, कई सक्रिय कीचड़ कणों के आकार इस तरह है कि मोटे ध्यान के लिए मामूली समायोजन के बिना, कई कणों ध्यान से थोड़ा बाहर हो जाएगा, गलत कण माप शुरू । कोई छवि १००% पूरी तरह से केंद्रित कणों शामिल होंगे; चित्रा 8 और चित्रा 5b गरीब और स्वीकार्य ध्यान के उदाहरण संबंधित हैं ।

जोखिम का स्तर दूसरा प्रमुख मुद्दा है । खराब उजागर छवियों खो डेटा और गरीब विभाजन11में परिणाम । इसके अलावा, डाई के उच्च विपरीत एक संकीर्ण हिस्टोग्राम उत्पादन कर सकते हैं, डेटा के प्रभावी गतिशील रेंज को कम करने । हिस्टोग्राम के ऊपरी और निचले सीमा दोनों गरीब जोखिम को रोकने के लिए एक छवि पर कब्जा करने और गतिशील रेंज में वृद्धि करने से पहले समायोजित किया जा सकता है । अधिक, के तहत, और स्वीकार्य निवेश के उदाहरण चित्रा 10में नीचे शामिल हैं ।

Figure 10
चित्र 10: गरीब और स्वीकार्य छवि जोखिम दिखा संदर्भ छवियां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इस विधि के फायदे हैं कि यह पूरी प्रक्रिया को शामिल विशिष्ट मानदंड प्रदान करता है. इसके अलावा, हम एक सॉफ्टवेयर पाइप लाइन में सहजता के भीतर प्रयोगशाला विश्लेषण प्रदान की है और के बीच तुलनीय प्रयोगशाला डेटा को बढ़ावा देने । इस विधि की प्रमुख सीमा है कि आवश्यकता के सभी कणों को रखने के लिए ध्यान केंद्रित उच्च आवर्धन रोकता है, छोटे मामूली आयामों के साथ कणों के लिए इसकी उपयोगिता सीमित-विशेष रूप से रेशा संरचनाओं. इस विधि के भविष्य के निर्देश उंनत छवि विश्लेषण तकनीक (विशेष रूप से शोर में कमी24,25, उच्च गतिशील रेंज इमेजिंग,26,27स्टैकिंग ध्यान केंद्रित शामिल सकता है, और मशीन सीखने असिस्टेड थ्रेसहोल्ड, विभाजन, और वर्गीकरण28। प्रमुख छवि अधिग्रहण सुधार के लिए यांत्रिक8 चरणों को नियंत्रित करने और ' पूरी थाली ' मोज़ेक अभिलेखागार का उत्पादन सॉफ्टवेयर शामिल होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन CBET १३३६५४४ से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

फिजी, R, और पायथन लोगो के साथ निंनलिखित ट्रेडमार्क नीतियों के अनुसार उपयोग किया जाता है:
अजगर: https://www.python.org/psf/trademarks/
आर: https://www.r-project.org/Logo/ , प्रति के रूप में प्रतिलिपि-द्वारा-SA ४.० लाइसेंस पर सूचीबद्ध: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
फिजी: https://imagej.net/Licensing

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bleach solution Chlorox 31009 For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap Corning 430790 Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask Corning 4980-50 Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle Kimble-Chase 14395-50 Or otherwise sufficient for agar handling
Agar BD 214010 Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software N/A N/A R or Python are suggested
Deionized water N/A N/A Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer N/A N/A Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive Seagate STEB5000100 Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI NIH version 1.51d Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT Open Source version 2.19.1 or later Available at: https://git-scm.com/
Image capture software ToupView version 3.7.5177 Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage OMAX A512 Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue Fisher M291-100 Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera OMAX A35140U Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer OMAX A36CALM1 Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm Fisher FB0875712 1 per sample.
PPE N/A N/A Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro NCSU version 0.2.1 Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope Nikon SMZ-2T Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.

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References

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आकार और सक्रिय कीचड़ कणों के आकार को मापने के एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पाइपलाइन के साथ आगर में मैटीरियल
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Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).More

Weaver, J. E., Williams, J. C., Ducoste, J. J., de los Reyes III, F. L. Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline. J. Vis. Exp. (143), e58963, doi:10.3791/58963 (2019).

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