Dictyostelium discoideum सेल माइग्रेशन, endocytosis, और विकास जैसे जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव है । जीव की उपयोगिता आनुवंशिक हेरफेर की व्यवहार्यता पर निर्भर है । यहां, हम transfect Dictyostelium discoideum कोशिकाओं है कि तरल मीडिया में संवर्धन कोशिकाओं की मौजूदा सीमाओं को दूर करने के लिए तरीके मौजूद हैं ।
Dictyostelium discoideum विकास के दौरान सेल भेदभाव प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक पेचीदा मॉडल जीव है, सेल संकेतन, और अंय महत्वपूर्ण सेलुलर जीव विज्ञान प्रश्न । आनुवंशिक रूप से Dictyostelium कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध प्रौद्योगिकियों अच्छी तरह से विकसित कर रहे हैं । Transfections मुताबिक़ पुनर्संयोजन और सम्मिलनी mutagenesis सहित विभिन्न चयन मार्करों और मार्कर री-साइकलिंग का उपयोग कर किया जा सकता है । यह एक अच्छी तरह से व्याख्या जीनोम द्वारा समर्थित है । हालांकि, इन तरीकों axenic कोशिका तरल संस्कृतियों में बढ़ रही लाइनों के लिए अनुकूलित कर रहे है और गैर axenic जंगली प्रकार की कोशिकाओं है, जो केवल बैक्टीरिया पर फ़ीड को लागू करने के लिए मुश्किल है । उत्परिवर्तनों कि axenic उपभेदों में उपस्थित है परेशान रास संकेतन, अत्यधिक macropinocytosis के कारण खिला के लिए आवश्यक है, और कोशिका प्रवास ख़राब है, जो संकेत transduction और उन उपभेदों में chemotaxis प्रयोगों की व्याख्या को निराधार । पहले आनुवंशिक रूप से हेरफेर गैर axenic कोशिकाओं के प्रयास दक्षता और आवश्यक जटिल प्रायोगिक प्रक्रियाओं का अभाव है । हम एक सरल अभिकर्मक प्रोटोकॉल है कि, पहली बार के लिए, इन सीमाओं पर काबू पाता विकसित किया है । Dictyostelium आणविक आनुवंशिकी के लिए बड़े सुधार की उन श्रृंखला जंगली प्रकार की कोशिकाओं के रूप में आसानी से मानक प्रयोगशाला उपभेदों के रूप में हेरफेर करने की अनुमति । भ्रष्ट संकेत और गतिशीलता प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए फायदे के अलावा, म्यूटेंट कि macropinocytosis आधारित विकास को बाधित अब आसानी से अलग किया जा सकता है. इसके अलावा, पूरे अभिकर्मक कार्यप्रवाह बहुत तेज है, रिकॉमबिनेंट कोशिकाओं है कि दिनों के बजाय हफ्तों में उत्पंन किया जा सकता है के साथ । एक और लाभ यह है कि आणविक आनुवंशिकी और पर्यावरण से हौसले से अलग जंगली प्रकार Dictyostelium नमूनों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । यह इन शोध क्षेत्रों में उपयोग किए गए दृष्टिकोणों का दायरा बढ़ाने में मदद कर सकता है ।
Dictyostelium जीनस मिट्टी रहने वाले सामाजिक अमीबा कि मुख्य रूप से बैक्टीरिया पर फ़ीड कर रहे हैं । जाति Amoebozoa में रखा जा रहा है, प्रजातियों की एक बड़ी संख्या है कि चार अलग पहने1में वर्गीकृत किया जा सकता अलग किया गया है । प्रजातियों Dictyostelium discoideum (discoideum) सेल माइग्रेशन और phagocytosis के रूप में जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव बन गया है । प्रयोगात्मक स्थितियों को नियंत्रित करने और मानकीकरण करने के लिए, axenic कोशिका रेखाओं को विकसित किया गया है जो बैक्टीरिया2के अभाव में जटिल या परिभाषित तरल माध्यमों में वृद्धि करने में सक्षम हैं । विशेष महत्व के Ax2, Ax3, और Ax4 उपभेदों, जो सभी 1970 के दशक में उत्पंन और अंत में एक जंगली अलग NC43से व्युत्पंन थे । आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए उपकरण इन axenic उपभेदों में विकसित किया गया, पहले नॉकआउट में प्रकाशित १९८७4,5में जिसके परिणामस्वरूप । प्रोटोकॉल और विकसित और axenic6,7शर्तों के तहत उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया ।
इन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए जंगली प्रकार discoideum उपभेदों है कि तरल शोरबा में विकसित करने में सक्षम नहीं है कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयास किया गया है । हालांकि, यह पूरी तरह से सफल नहीं हो गया है क्योंकि अभिकर्मक प्रोटोकॉल जटिल है और दक्षता की कमी है, के कारण भाग में बैक्टीरिया की क्षमता के लिए एक सिंक के रूप में कार्य करने के लिए चयनित रिएजेंट8,9. एक परिणाम के रूप में, मूलतः discoideum पर सभी आणविक डेटा एक जंगली प्रकार अलग के वंशज से आता है । हम इस सीमा पर काबू पाने और आनुवंशिक रूप से अपने तरल माध्यम में विकसित करने की क्षमता के discoideum कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए एक विधि विकसित करना चाहता था । इस तरह के एक विधि के लिए की जरूरत है कि यह अतीत में ग्रहण किया गया है कि axenic विकास की अनुमति उत्परिवर्तनों मुख्य रूप से तटस्थ थे और कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान ख़राब नहीं किया था अवलोकन द्वारा समझाया जा सकता है । यह अनुमान केवल आंशिक रूप से सही है । सामांय में, वहां दो उल्लेखनीय अंतर हैं; विभिंन पृथक axenic उपभेदों के बीच पहला, और दूसरा, जब इन axenic उपभेदों गैर के साथ तुलना कर रहे है axenic वंय8,9अलग ।
शायद सबसे महत्वपूर्ण कारक है कुंजी axenic जीन, कुल्हाड़ी बी, कि हाल ही में RasGAP NF1 के रूप में पहचान की गई थी । एक RasGAP के रूप में NF1 के प्रमुख समारोह रास गतिविधि3को नियंत्रित करने के लिए है । सभी axenic उपभेदों में एंजाइम का विलोपन अत्यधिक रास बड़ी सक्रिय रास पैच के गठन के रूप में प्रकट गतिविधि की ओर जाता है । इन बढ़े हुए रास पैच प्लाज्मा झिल्ली में PIP3 के संचय के लिए सीसा । उन संयोग PIP3 और सक्रिय रास के धब्बे दिखने एक परिपत्र असंतोष है कि अंततः बंद कर देता है और10macropinosomes के गठन की ओर जाता है के गठन के लिए एक टेंपलेट हैं । परिणाम macropinocytic गतिविधि में अत्यधिक वृद्धि हुई है । Macropinocytosis एक actin-संचालित प्रक्रिया है । या तो macropinosomes या pseudopods के गठन के लिए cytoskeletal घटकों के लिए एक प्रतियोगिता का परिणाम है । कोशिका व्यवहार पर इसका प्रभाव वनस्पति कोशिकाओं के chemotaxis के लगभग पूर्ण रोकथाम में फोलेट११से परिलक्षित होता है. बड़े पैमाने पर बढ़े PIP3 पैच बहुत लगातार कर रहे हैं । यहां तक कि भूखे कोशिकाओं में, PIP3 पैच रहते हैं और pseudopods के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है, जो शिविर के लिए chemotaxis पर अध्ययन की व्याख्या समस्याओं का कारण बन सकता है.
कुछ मामलों में, NF1 उत्परिवर्तन प्रयोग उपयोगी है । यह हमें एक दूसरी प्रेरणा के लिए एक अभिकर्मक विधि विकसित बैक्टीरियल discoideum कोशिकाओं के विकास के लिए होता है, macropinocytosis दर में वृद्धि के बाद से axenic इस प्रक्रिया के मौलिक पहलुओं की जांच के लिए मूल्यवान कोशिकाओं बनाता है12 . हालांकि, macropinocytosis के लिए आवश्यक जीन में उत्परिवर्तन, जैसे रास और PI3-kinases10, लगभग axenic विकास को समाप्त कर दिया है, यह आवश्यक बनाने के बैक्टीरिया पर विकास के माध्यम से इन कोशिकाओं में हेरफेर । एक और कारण है कि renders बैक्टीरिया आधारित transfections मूल्यवान Dictyostelids के बढ़ते उपयोग के लिए बहु के विकास में सवालों का पता लगाने है सेलुलर13,14, परिजन मांयता15,16, और परोपकारी सेलुलर व्यवहार है, जो मुख्य रूप से नए सिरे से अलग जंगली प्रकार के उपयोग पर निर्भर17अलग । सभी उल्लेख अनुसंधान क्षेत्रों जंगली अलग है, जो गैर axenic और तरल शोरबा में वृद्धि नहीं कर रहे है के आनुवंशिक हेरफेर के लिए कुशल तरीके से सुविधा हो सकती है ।
हमारे प्रोटोकॉल वर्णित सीमाओं पर काबू पाने के लिए अनुमति देते हैं । साथ में ले लिया, बैक्टीरियल हो discoideum कोशिकाओं के साथ आनुवंशिक जोड़तोड़ प्रदर्शन की संभावना सभी Dictyostelium शोधकर्ताओं के लिए लाभ रखती है, भले ही यह तेजी के कारण चयन प्रक्रिया की वृद्धि की गति है axenic मीडिया (10 एच दोहरीकरण समय) में वृद्धि की तुलना में बैक्टीरिया पर अमीबा (4 एच दोहरीकरण समय) की वृद्धि ।
गैर-axenic, वन्य-प्रकार की Dictyostelium कोशिकाओं का उपयोग आणविक अनुसंधान में अब तक बहुत सीमित रहा है. इन उपभेदों के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए उपलब्ध तरीकों विश्वसनीयता और दक्षता23का अभाव है, उनके सामांय गोद लेने को रोकने । उत्पंन सामग्री और प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किसी भी discoideum के लिए तरल माध्यम में विकसित करने की क्षमता के स्वतंत्र तनाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल NC4-व्युत्पन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित है । जंगली से हौसले से अलग उपभेदों के लिए अभिकर्मक क्षमता NC4 से अलग है, जैसा कि हम पहले देखा है और V12M2 और WS21628,9के लिए यहां दिखाए जाते हैं । electroporation स्थितियों में विशेष रूप से लगता है अभिकर्मक क्षमता पर काफी प्रभाव पड़ता है और कुछ उपभेदों के लिए और अधिक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । सामांय में, transfectants की एक पर्याप्त राशि सभी उपभेदों में देखा गया है अब तक परीक्षण, दिखा रहा है कि इन तरीकों व्यावहारिक हैं । NC4-व्युत्पन्न उपभेदों का उपयोग कर प्राप्त की सकारात्मक transfectants की संख्या अन्य गैर-axenic जंगली प्रकार उपभेदों की तुलना में अधिक है, लेकिन सभी मामलों में, transfectants की पर्याप्त संख्या आगे प्रयोगों के लिए अनुमति देने के लिए प्राप्त कर रहे हैं. यह, प्लस हमारे प्रोटोकॉल की सादगी, पहले के प्रयास की तुलना में प्रमुख सुधार है8,9।
इन नए गैर axenic प्रोटोकॉल सभी मानक आनुवंशिक प्रक्रियाओं को कवर और आगे लाभ जोड़ने के लिए, के बाद से transfections तेजी से और कुशलता से समानांतर में प्रदर्शन किया जा सकता है । सकारात्मक क्लोन दिनों के बजाय हफ्तों में प्राप्त किया जा सकता है, के बाद से बैक्टीरिया पर वृद्धि विभाजन समय आधा । नव स्थापित plasmids भी axenic शर्तों के तहत काम करते है और नियमित रूप से दोनों विकास की स्थिति है, जो इस methology22की एक और उंनति है के तहत इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में प्रोटोकॉल में शुरू की, बैक्टीरिया पर चयन के लिए इस्तेमाल किया प्लाज्मिड विशेष आवश्यकताओं कि अभिकर्मक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । विशेष रूप से अभिव्यक्ति और प्रतिरोधक कैसेटों को चलाने वाले प्रवर्तक सफल अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण हैं. अक्सर इस्तेमाल किया act6 (actin 6) प्रतिरोध या अभिव्यक्ति कैसेट ड्राइविंग के लिए24 प्रमोटर दक्षता का अभाव है जब कोशिकाओं बैक्टीरिया पर हो रहे हैं । हमारी प्लाज्मिड प्रणाली में, अत्यधिक सक्रिय act15 (actin 15) प्रवर्तक सभी अभिव्यक्ति कैसेटों को चलाता है, जबकि प्रतिरोधक कैसेट एक coA (coactosin) प्रवर्तक के नियंत्रण में होती हैं, जिनमें से दोनों axenic परिस्थितियों में सक्रिय हैं और बैक्टीरिया पर उगाई कोशिकाओं । रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यकताओं का निर्माण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दस्तक में और नॉक आउट constructs यह हमारे प्लाज्मिड प्रदर्शनों की रिपोर्टर का उपयोग करने के लिए आवश्यक बनाते हैं, लेकिन दुर्भाग्य से पहले से ही बनाया है कि अकुशल act6 प्रमोटर का उपयोग की सीमा वैक्टर का उपयोग करें ।
प्रवर्तक क्षमताएँ transfections के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं जो सही जीनोमिक लोकस में एकल एकीकरण ईवेंट पर निर्भर करती हैं. प्रतिरोध जीन अभिव्यक्ति ड्राइविंग प्रवर्तकों के हमारे सुधार के कारण, पर्याप्त प्रतिरोध प्रोटीन एकल लोकस एकीकरण से उत्पादित है । एक प्रमुख चिंता का विषय जीनोम में कई एकीकरण के पक्ष में था जब hygromycin या G418 का उपयोग कर के रूप में वर्णित है । कई एकीकरण का कोई एहसान अब तक मनाया गया है, के रूप में G418 चयन के लिए पहले की रिपोर्ट पुराने प्रमोटर25सिस्टम का उपयोग कर । इसका मतलब यह है कि दोनों hygromycin और G418 साफ दस्तक-बहिष्कार और दस्तक-ins की पीढ़ी के लिए उपयुक्त चयन मार्करों हैं । दुर्भाग्य से, चयन मार्कर blasticidin गैर axenic शर्तों के तहत काम नहीं करता है । यह हमारी विधि का एक बड़ा नुकसान है, के बाद से blasticidin प्रतिरोध कैसेट नियमित रूप से दस्तक उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया है बाहर डी discoideumमें constructs । constructs कि पहले से ही blasticidin प्रतिरोध कैसेट के साथ उत्पंन की आवश्यकता होगी के लिए व्यावहारिक चयन मार्करों में से एक का उपयोग कर व्युत्पंन होगा । इस सीमा को पार करने की एक और संभावना इस अभिकर्मक प्रोटोकॉल26के साथ हाल ही में स्थापित axenic D. discoideum CRISPR प्रौद्योगिकी गठबंधन है । उपयुक्त की पीढ़ी, एकल गाइड RNAs (sgRNAs) सरल और तेजी से पूरा दस्तक के पुनर्निर्माण से बाहर constructs । भविष्य के निर्देशों के लिए, कई दस्तक-CRISPR/Cas9 का उपयोग कर इस अभिकर्मक प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त बहिष्कार की संभावना अपील है और Dictyostelium समुदाय में कई शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त हो सकता है । तथापि, axenic उगाए गए कक्षों में CRISPR/Cas9 के लिए उपयोग किए गए विस्थापित क्षणिक व्यंजक प्रणाली की कार्य-सावधानीपूर्वक जांच की जानी चाहिए ।
act5 दस्तक प्रणाली प्रस्तुत में डी discoideum में स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए एक विश्वसनीय और सुरक्षित एकीकरण प्रणाली प्रदान करता है, इसी तरह के अंय जीवों22में स्थापित साइटों के लाभ के साथ । यह भी जीनोम में एक एकल एकीकरण घटना पर निर्भर करता है और विभिंन अनुसंधान दिशाओं के लिए कई संभावनाएं प्रदान करता है । act5 प्रवर्तक दृढ़ता से सक्रिय है और लगभग समरूप अभिव्यक्ति की गारंटी देता है27 खेती की शर्तों के स्वतंत्र । फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन आसानी से इस सुरक्षित हेवन लोकस में एकीकृत किया जा सकता है इंजीनियर लक्ष्यीकरण plasmids का उपयोग कर । यह उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, सेल ट्रैकिंग प्रयोजनों के लिए, के रूप में एक मिश्रण प्रयोग में यहां दिखाया गया है । कक्ष न्यूनतम कक्ष-से-कक्ष व्यंजक परिवर्तनशीलता दिखाते हैं, जो स्वचालित कक्ष ट्रैकिंग में सहायता कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात, 5 लोकस अधिनियममें एक वांछित अनुक्रम के सम्मिलन phenotypically तटस्थ28,29प्रकट होता है । के रूप में अभिव्यक्ति एक चयन मार्कर पर निर्भर नहीं है प्रोटीन अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए, के रूप में यादृच्छिक integrants या extrachromosomal वेक्टर असर सेल लाइनों में देखा, act5 प्रणाली बचाव प्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है, के रूप में अच्छी तरह से । चूंकि कक्ष पंक्तियां समरूप हैं, इसलिए सभी कक्षों का विश्लेषण किया जा सकता है । अभिव्यक्ति के लिए एक extrachromosomal प्लाज्मिड का उपयोग करना संभव नहीं है, जिसमें अभिव्यक्ति में काफी विविधता है.
सभी उपभेदों के लिए इन सामान्य सुधार के अलावा, आणविक अनुसंधान के लिए गैर axenic जंगली प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग करने की क्षमता वर्तमान प्रयोगशाला उपभेदों में संचित उत्परिवर्तनों के प्रभाव का एक आकलन की अनुमति देता है । एकाधिक आनुवंशिक व्यवस्था १९७० में Ax2 तनाव के गोद लेने के बाद से पाया गया है, के रूप में पहले प्रकाशित microarray विश्लेषण26द्वारा दिखाया गया है । सिंथेटिक phenotypes इन उत्परिवर्तनों की उपस्थिति की वजह से मनाया जाता है । उदाहरण के लिए, एक रिपोर्ट phg2 उत्परिवर्ती से पता चलता है एक प्रयोगशाला तनाव पृष्ठभूमि में आसंजन में कमी आई और एक और3में वृद्धि हुई आसंजन । इस तरह के परस्पर विरोधी आंकड़ों को अब आम पूर्वज तनाव (इस मामले में, DdB) में प्रयोग को दोहराने से सुलझाया जा सकता है । इस दृष्टिकोण की ताकत को हाल ही में छोटे GTPase ञास30,31के लिए दिखाया गया है ।
किसी भी discoideum तनाव में आनुवंशिक प्रयोगों प्रदर्शन करने की क्षमता है कि जंगली अलग के उपयोग पर निर्भर करता है कि नए अनुसंधान दिशाओं की क्षमता का विस्तार, विशेष रूप से उन सामाजिक विकास, परिजन मांयता शामिल है, और यौन चक्र22।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस विधि और उत्कृष्ट वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता के लिए LMB माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry सुविधाओं के लिए इनपुट के लिए Kay लैब धंयवाद । यह काम मेडिकल रिसर्च काउंसिल ग्रांट MC_U105115237 द्वारा आर. आर. kay, BBSRC (बायोटेक्नोलॉजी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद्) ग्रांट बीबी/K009699/1 से आर. आर. kay, कैंसर रिसर्च यूके ग्रांट A15672 को आर. एच. Insall, वेलकम ट्रस्ट सीनियर फैलोशिप के लिए वित्त पोषित किया गया । 202867/z/16/z जोनाथन आर Chubb करने के लिए, और MRC में LMCB UCL विश्वविद्यालय इकाई को MRC धन (MC_U12266B) ।
Equipment | |||
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R | ThermoScientific | 05-400-002 | |
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor | ThermoScientific | 12823252 | |
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers | Sigma Aldrich | EP6331000025 | |
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules | BioRad | 1652660 | |
Safety Cabinet Foruna – SCANLAF | Labogene | ||
BioPhotometer Plus | Eppendorf | ||
CLSM 710 | Zeiss | ||
Media & Agaroses | |||
LoFlo Medium | Formedium | LF0501 | |
Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | |
Low EEO Agarose | BioGene | 300-200 | |
Purified Agar | Oxoid | LP0028 | |
SM broth | Formedium | SMB0102 | |
2x LB broth | Formedium | LBD0102 | |
Chemicals | |||
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoScientific | S33102 | |
1 Kb Plus DNA Ladder | ThermoScientific | 10787018 | |
1 Kb DNA Ladder | NEB | N3232L | |
HEPES free acid | Sigma Aldrich/Merck | 391340 EMD | |
KH2PO4 | VWR | P/4800/53 | |
Na2HPO4 * 2 H2O | VWR | 10028-24-7 | |
MgCl2 * 6 H2O | Sigma Aldrich/Merck | 5982 EMD | |
CaCl2 * 2 H2O | Sigma Aldrich | 442909 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876 | |
KOH | VWR | 26668.263 | |
Cultur Dishes | |||
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3595 | |
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3516 | |
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 353003 | |
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 | MatTek Corporation | P50G-1.5-30-F | |
Antibiotics | |||
Geneticin G418-sulphate | Gibco by Life Technologies | 11811-023 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
Additional Consumables | |||
2mm gap electroporation cuvettes, long electrode | Geneflow Limited | E6-0062 | |
10 µl Inoculating Loop, Blue 10 Micro L | ThermoScientific | 129399 | |
Spreader, L-shaped, sterile | greiner bio-one | 730190 | |
Combitips advanced 5 ml | Eppendorf BIOPUR | 30089669 | |
Kits | |||
ZR Plasmid Miniprep Classic | Zymoresearch | D4016 | |
Quick DNA Miniprep Kit | Zymoresearch | D3025 | |
Zymoclean DNA Recovery Kit | Zymoresearch | D40002 | |
Enzymes | |||
Restriction enzymes | NEB | ||
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | TakaraBio | R045A |