Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58981
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3, 4,5, 1, 1
1MRC Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 3Cancer Research UK Beatson Institute Glasgow, 4MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 5Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

Dictyostelium-discoideum is een populair model-organisme te bestuderen van complexe cellulaire processen zoals cel migratie, endocytose en ontwikkeling. Het nut van het organisme is afhankelijk van de haalbaarheid van genetische manipulatie. Hier presenteren we methoden om te transfect Dictyostelium discoideum cellen die bestaande van kweken cellen in vloeibare media beperkingen.

Abstract

Dictyostelium-discoideum is een intrigerende modelorganisme voor de studie van cel differentiatie processen tijdens ontwikkeling, cel signalering en andere belangrijke cellulaire biologie vragen. De technologieën die beschikbaar zijn om genetisch te manipuleren Dictyostelium cellen zijn goed ontwikkeld. Transfections kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende selecteerbare merkers en marker opnieuw fietsen, met inbegrip van homologe recombinatie en dat mutagenese. Dit wordt ondersteund door een goed geannoteerde genoom. Echter, deze benaderingen zijn geoptimaliseerd voor een cellijnen groeien in vloeibare culturen en zijn moeilijk toe te passen op niet-een wild-type cellen, die alleen als bacteriën waardplanten. De mutaties die aanwezig in een stammen zijn verstoren Ras signalering, waardoor buitensporige macropinocytosis die nodig zijn voor het voederen en afbreuk doen aan cel migratie, die de interpretatie van signaaltransductie en chemotaxis experimenten in die stammen kunstdiscours. Eerdere pogingen om genetisch te manipuleren niet-een cellen ontberen efficiëntie en vereiste complexe experimentele procedures. We hebben een eenvoudige transfectie protocol dat voor de eerste keer, deze beperkingen overwint ontwikkeld. Deze serie van grote verbeteringen aan Dictyostelium moleculaire genetica toestaan wild-type cellen worden gemanipuleerd net zo gemakkelijk als standaard laboratorium stammen. Naast de voordelen voor de studie van onbeschadigde signalering en motiliteit processen, kunnen mutanten die macropinocytosis gebaseerde groei verstoren nu gemakkelijk geïsoleerd. De gehele transfectie workflow wordt bovendien aanzienlijk versneld, met recombinant cellen die kunnen worden gegenereerd in de dagen in plaats van weken. Een ander voordeel is dat de moleculaire genetica verder kan worden uitgevoerd met vers geïsoleerde wild-type Dictyostelium monsters uit de omgeving. Dit kan helpen om de reikwijdte van de benaderingen die zijn gebruikt in deze onderzoeksgebieden.

Introduction

Het geslacht Dictyostelium zijn bodem-levende sociale amoeba die zich voornamelijk voeden met bacteriën. In de stam van deze berichten wordt geplaatst, zijn een groot aantal soorten geïsoleerd die kunnen worden ingedeeld in vier verschillende clades1. De soorten Dictyostelium discoideum (D. discoideum) uitgegroeid tot een populaire model-organisme om complexe cellulaire processen zoals cel migratie en fagocytose te bestuderen. Om te controleren en standaardiseren van experimentele omstandigheden, een cel lijnen hebben ontwikkeld die kunnen groeien in complexe of gedefinieerde vloeistof in de afwezigheid van bacteriën2. Van bijzonder belang zijn de Ax2, Ax3, en Ax4 stammen, die werden alle gegenereerd in de jaren 1970 en uiteindelijk afgeleid van een enkele wilde isoleren NC43. Hulpmiddelen voor de gentechnologie werden ontwikkeld in deze een stammen, resulterend in het eerste gepubliceerde knock-out in 19874,5. Protocollen werden verder ontwikkeld en geoptimaliseerd voor gebruik onder een voorwaarden6,7.

Aanpassing van deze protocollen bij wild-type D. discoideum stammen die zijn niet in staat om te groeien in vloeibare Bouillon zijn geprobeerd door verschillende laboratoria. Dit is echter niet geworden volledig succesvol omdat de protocollen van de transfectie complex zijn en gebrek aan efficiëntie, gedeeltelijk als gevolg van de capaciteit van de bacteriën om te fungeren als een gootsteen voor de selectieve reagentia8,9. Dientengevolge, afkomstig in wezen alle moleculaire gegevens op D. discoideum van afstammelingen van een één isolaat van de wild-type. We wilden deze beperking ondervangen en ontwikkelen van een methode om genetisch Wijzig D. discoideum cellen onafhankelijk van hun vermogen om te groeien in vloeistof. De noodzaak van een dergelijke methode kan worden verklaard door de observatie dat het werd aangenomen in het verleden dat de mutaties waardoor een groei voornamelijk neutraal waren en deed geen afbreuk doen aan celfysiologie. Deze veronderstelling is slechts gedeeltelijk juist. In het algemeen, zijn er twee opvallende verschillen; eerst, tussen de verschillende geïsoleerd een stammen, en ten tweede, wanneer deze een stammen worden vergeleken met niet-een wild isolaten8,9.

De meest kritische factor is misschien wel het belangrijkste een gen, bijlB, die onlangs werd geïdentificeerd als RasGAP NF1. De belangrijkste functie van NF1 als een RasGAP is te bedwingen Ras activiteit3. De schrapping van het enzym in alle Axenische stammen leidt tot buitensporige Ras activiteit manifesteerde als de vorming van grote actieve Ras patches. Deze uitgebreide Ras patches leiden tot de opeenstapeling van PIP3 in het plasma-membraan. Deze toevallige verschijnen patches van PIP3 en actieve Ras zijn een sjabloon voor de vorming van een circulaire ruffle die uiteindelijk wordt gesloten en leidt tot de vorming van macropinosomes10. Het gevolg is een buitensporige toename van de activiteit van de macropinocytic. Macropinocytosis is een proces van actine-gedreven. Een competitie voor cytoskeletal componenten voor de vorming van macropinosomes of pseudopods is het resultaat. Het effect ervan op het gedrag van de cel wordt weerspiegeld in de bijna volledige preventie van chemotaxis van vegetatieve cellen folaat11. De enorm uitgebreide PIP3 patches zijn zeer persistent. Zelfs in uitgehongerd cellen, de PIP3 patches blijven en pseudopods, die kunnen leiden tot problemen interpreteren studies over chemotaxis naar kamp kunnen worden geïnterpreteerd.

In sommige gevallen is de mutatie NF1 experimenteel handig. Dit leidt ons tot een tweede motivatie voor de ontwikkeling van een methode van de transfectie voor bacterially geteeld D. discoideum cellen, aangezien de verhoging macropinocytosis een cellen waardevol maakt voor het onderzoeken van de fundamentele aspecten van dit proces12 . Mutatie in de genen die nodig zijn voor macropinocytosis, zoals Ras- en PI3-kinases10, hebben echter bijna afgeschaft, een groei, waardoor het noodzakelijk wordt om te manipuleren van deze cellen via de groei van bacteriën. Een andere reden dat bacteriën gebaseerde transfections waardevolle maakt is het toenemende gebruik van Dictyostelids om te vragen in de evolutie van multi buiten13,14, geslacht herkenning15,16, verkennen en altruïstische cellulaire gedrag, die vooral afhankelijk zijn van het gebruik van vers geïsoleerde wild-type isoleert17. Alle genoemde onderzoeksgebieden kunnen worden vergemakkelijkt door efficiënte methoden voor genetische manipulatie van wild isolaten, die niet-Axenische en groeien niet in vloeibare Bouillon.

Onze protocollen toestaan voor het overwinnen van de beperkingen beschreven. Samen genomen, de mogelijkheid van het uitvoeren van genetische manipulaties met bacteriële geteeld D. discoideum cellen wachtruimten voordelen voor alle Dictyostelium onderzoekers, zelfs als het alleen de hogere snelheid van het selectieproces moet sneller groei van de amoebe (4 h verdubbeling keer) op bacteriën in vergelijking met groei in een media (10 h verdubbeling van tijd).

Protocol

1. bereiding van de cellen en materialen

  1. SorMC buffer voorbereiding
    1. 100 mL voor 100 x SorMC (Sorensen buffer met inbegrip van MgCl2 en CaCl2) buffer voor te bereiden door het oplossen van 20,36 g KH2PO4 (15 mM) en 5.47 g nb2HPO4·7 H2O (2 mM) in 100 mL ddH2O water. Roer de oplossing op kamertemperatuur (RT) en breng het volume aan met de dH2O. 100 mL
      Opmerking: De resulterende buffer heeft een pH van 6 en hoeft niet verder aan te passen.
    2. Het produceren van 1000 mL 1 x werkoplossing in ddH2O. toevoegen 50 µL elke MgCl2 en CaCl2 om de eindconcentraties van elk 50 µM. Filter steriliseren de oplossing om met een 0,22 µm filter.
      Opmerking: Altijd toevoegen MgCl2 en CaCl2 aan de buffer 1 x om te voorkomen dat neerslag van de zouten in de 100 x stamoplossing.
    3. U kunt ook bereiden KK2 buffer (2.2 g van KH2PO4 en 0,7 g K2HPO4 voor 1 liter buffer) aangevuld met 50 µM MgCl2 en 50 µM CaCl2 (hierna te noemen de KK2MC). Deze buffer in de gehele gebruiken in plaats van SorMC.
  2. Voorbereiding van bacteriën als voedselbron voor D. discoideum
    1. Gebruik een enkele kolonie van K. aerogenes en enten van 1 L voor LB-medium (lysogenie Bouillon). Gebruik een erlenmeyer van 2 L. Laat bacteriën groeien 's nachts bij 37 ° C met het schudden van 220 toeren per minuut.
      Opmerking: Als grote hoeveelheden bacteriën nodig zijn, gebruik maken van rijkere media zoals 2xTY (gist extract trypton medium) of SOB (super optimale Bouillon) in plaats van LB. In het geval dat het gebruik van K. aerogenes bacteriën is niet toegestaan vanwege beperkende veiligheidsmaatregelen, dan kan de BL21 E. coli in plaats daarvan worden gebruikt.
    2. Oogst de cellen de volgende dag door het draaien van hen naar beneden in twee 500 mL centrifuge buizen bij ~ 6,600 x g gedurende 20 min. Wash bacteriën eenmaal met 500 mL buffer SorMC.
    3. Resuspendeer de pellet in 20 mL SorMC. Controleer de OD-600 (optische dichtheid bij 600 nm) met een fotometer. Met de dezelfde buffer op een600 van de OD van ongeveer 100 verdund.
      Opmerking: K. aerogenes bacteriën zijn moeilijk te pellet, dus een relatief hoge snelheid voor spinnen beneden de bacteriën is noodzakelijk om te voorkomen dat het verlies van voedsel bacteriën. De resulterende bacteriële stockoplossing voor maximaal 4 maanden in de koelkast bij 4 ° C kunnen worden opgeslagen en onderhouden zijn nut als voedselbron voor D. discoideum. 1 L voor overnachting K. aerogenes schorsing gegroeid in LB medium meestal levert 20 mL van een600 van de OD van ongeveer 100.
      Let op: Om ervoor te zorgen dat de bereid bacteriën een monocultuur van K. aerogenes, voert u alle stappen uit onder een kap.
  3. Voorbereiding van H40 electroporation buffer
    1. Voorbereiden van 100 mL van de bufferoplossing, Los 0.952 g HEPES in ddH2O water en voeg 100 µL van MgCl2 van een stamoplossing van 1 M. Aanpassen aan pH 7 met behulp van KOH voor titratie. De buffer met behulp van een 0,22 µm filter of autoclaaf steriliseren. Zuurvrij HEPES en niet het natriumzout gebruiken.
  4. Plasmide voorbereiding volgens protocol van de fabrikant en het gebruik van de kits samengevat in de Tabel van materialenuit te voeren. Gebruik de plasmiden samengevat in tabel 1.
    Opmerking: De kwaliteit van DNA gebruikt voor transfectie is van cruciaal belang. De selectie van D. discoideum transfectants groeien op bacteriën heeft specifieke eisen voor de initiatiefnemers rijden de selectie en expressie cassette (zie discussie).
de naam van de plasmide weerstand/selectie bij bacteriën weerstand/selectie in Dictyostelium Label
extrachromosomal expressie plasmiden
pDM1203 Ampicilin G418 geen
pDM1207 Ampicilin G418 N-terminale GFP
pDM1208 Ampicilin G418 N-terminal mCherry
pPI159 Ampicilin G418 N-terminal mNeon
pPI437 Ampicilin G418 N-terminal mScarlet
pPI54 Ampicilin G418 N-terminal mTurquoise2
pDM1209 Ampicilin G418 C-terminal GFP
pDM1210 Ampicilin G418 C-terminal mCherry
pPI143 Ampicilin G418 C-terminal mNeon
pPI459 Ampicilin G418 C-terminal mScarlet
pPI142 Ampicilin G418 C-terminal mTurquoise2
Shuttle plasmiden
pDM344 Ampicilin geen geen
pDM1019 Ampicilin geen N-terminale GFP
pDM1018 Ampicilin geen N-terminal mCherry
pPI152 Ampicilin geen N-terminal mNeon
pPI418 Ampicilin geen N-terminal mScarlet
pPI150 Ampicilin geen N-terminal mTurquoise2
pDM1021 Ampicilin geen C-terminal GFP
pDM1020 Ampicilin geen C-terminal mCherry
pPI153 Ampicilin geen C-terminal mNeon
pPI457 Ampicilin geen C-terminal mScarlet
pPI151 Ampicilin geen C-terminal mTurquoise2
afleidbare extrachromosomal expressie plasmiden
pDM1038 Ampicilin Hygromycin geen
pDM1047 Ampicilin Hygromycin N-terminale GFP
pDM1046 Ampicilin Hygromycin N-terminal mCherry
pPI450 Ampicilin Hygromycin N-terminal mNeon
pPI452 Ampicilin Hygromycin N-terminal mScarlet
pPI449 Ampicilin Hygromycin N-terminal mTurquoise2
pDM1049 Ampicilin Hygromycin C-terminal GFP
pDM1048 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI470 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI460 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI469 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
veilige haven act5 gericht op plasmiden
pDM1501 Ampicilin Hygromycin geen
pDM1513 Ampicilin Hygromycin N-terminale GFP
pDM1514 Ampicilin Hygromycin N-terminal mCherry
pPI231 Ampicilin Hygromycin N-terminal mNeon
pPI419 Ampicilin Hygromycin N-terminal mScarlet
pPI228 Ampicilin Hygromycin N-terminal mTurquoise2
pDM1515 Ampicilin Hygromycin C-terminal GFP
pDM1516 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI230 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI458 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI229 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
REMI expressie plasmiden
pDM1220 Ampicilin Hygromycin geen
pDM1351 Ampicilin Hygromycin N-terminale GFP
pDM1259 Ampicilin Hygromycin N-terminal mCherry
pPI465 Ampicilin Hygromycin N-terminal mNeon
pPI468 Ampicilin Hygromycin N-terminal mScarlet
pPI466 Ampicilin Hygromycin N-terminal mTurquoise2
pDM1352 Ampicilin Hygromycin C-terminal GFP
pDM1305 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI471 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI467 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI472 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
gericht in frame plasmiden
pDM1355 Ampicilin Hygromycin C-terminal GFP
pPI461 Ampicilin Hygromycin C-terminal mCherry
pPI462 Ampicilin Hygromycin C-terminal mNeon
pPI464 Ampicilin Hygromycin C-terminal mScarlet
pPI463 Ampicilin Hygromycin C-terminal mTurquoise2
knock-out plasmiden
pDM1079 Ampicilin Blasticidin geen
pDM1080 Ampicilin Nourseothricin geen
pDM1081 Ampicilin Hygromycin geen
pDM1082 Ampicilin G418 geen
CRE expressie plasmiden
pDM1483 Ampicilin Nourseothricin geen
pDM1489 Ampicilin Hygromycin geen
pDM1488 Ampicilin G418 geen

Tabel 1: Plasmide lijst voor niet-een transfections.

  1. Dictyostelium cellen voor Transfectie instellen
    1. K. aerogenes groeien tot samenkomst in SM medium (voedselrijke medium) overnachting in RT. culturen kan worden opgeslagen voor tot 2 weken bij 4 ° C.
    2. Voeg ongeveer 400 µL van deze bacteriële suspensie op een bord van SM agar (pepton 10 g/L; gist extract 1 g/L; glucose 10 g/L; KH2PO4 1.9 g/L; K2HPO4 x 3 H2O, 1,3 g/L; MgSO4 watervrij 0.49 g/L; 1,7% agar) en gelijkmatig. Neem een steriel lus en inoculeren met Dictyostelium cellen. Verspreid de cellen op een van de randen van de plaat.
    3. Incubeer de plaat bij 22 ° C gedurende 2 dagen om voldoende groei zones voor Transfectie.
      Opmerking: Clearing platen in plaats daarvan voor Dictyostelium stammen die geen grote groei zones (b.v., Ax3, DH1 of JH10), of voor onervaren onderzoekers, gebruiken. Volg de instructies in stappen 1.5.4 aan 1.5.6 hiervoor.
    4. Neem een steriel lus en inoculeren met Dictyostelium cellen (ongeveer 2-4 x 105 cellen). De cellen omzetten in 800 µL van een dichte K. aerogenes suspensie in SM Mix cellen door pipetteren omhoog en omlaag.
    5. Overdracht van 400 µL, 200 µL, 100 µL en 50 µL op verse SM agar platen. Toevoegen aan elke plaat 400 µL van extra SM K. aerogenes schorsing, gelijkmatig verspreid en droog.
    6. Incubeer de platen bij 22 ° C gedurende ongeveer 2 dagen totdat de platen doorschijnend geworden.
      Opmerking: De bacteriën produceren in eerste instantie een confluente gazon door hun snellere groei, en de amoeben vervolgens "clear" de plaat van de bacteriën. De tijd die nodig is voor dit proces kan verschillen afhankelijk van de achtergrond van de spanning en vermogen van mutantcellen te groeien op de bacteriën.

2. de transfectie van Dictyostelium cellen op basis van bacteriële selectie

Figure 1
Figuur 1 : Workflow voor de transfectie van bacteriën geteelde Dictyostelium cellen. De stappen voor transfectie worden als volgt vermeld. Groeien D. discoideum cellen op een plaat van de SM bezaaid met K. aerogenes bacteriën (rood). Oogsten van cellen alleen uit de voeding voorkant (groen), het vermijden van cellen die al (donkergroen) ontwikkelen. De cellen in H40 wassen. Resuspendeer de cellen met een definitieve dichtheid voor 2-4 x 107 cellen/mL. Meng de celsuspensie met 1-2 µg van DNA. Het mengsel overbrengen in een electroporation cuvette en pulsstand cellen. Overbrengen in de cellen direct na electroporation een schotel met SorMC en bacteriën. De cellen te herstellen voor 5 h alvorens toe te voegen de selecteerbare markering toestaan. Voor extrachromosomal plasmiden, de selectie rechtstreeks toevoegen aan de schotel. Transfectants zijn meestal zichtbaar na ~ 2 dagen. Voor gelineariseerde constructies die naar integratie van de enkel in het genoom streven, drie verdunningen instellen zoals aangegeven en de selectie toevoegen. Bacteriën zijn ontleend aan de OD600 = 100 stamoplossing. Meng de buizen goed en breng de cellen in 96-Wells flat-onderkant weefselkweek platen. Gebruik twee platen per verdunning. Pipetteer 150 µL celsuspensie in elke goed. Het duurt ongeveer 5 dagen totdat strakke kolonies zichtbaar zijn. De rode wells Toon een voorbeeld van de gebruikelijke hoeveelheid met succes getransformeerd cellen verkregen (bovenste deelvenster aangepast ten opzichte van de vorige publicatie22). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Ter voorbereiding van platen met K. aerogenes vering, voeg toe 10 mL SorMC buffer met K. aerogenes bacteriën met een dichtheid van OD600 = 2 (Voeg 200 µL van de bereid OD600 = 100 K. aerogenes stockoplossing voor de gewenste bacteriën concentratie) in een 10 cm Weefselkweek behandeld petrischaal.
    Opmerking: Deze plaat is later moesten cultiveren de transfected cellen van D. discoideum . U kunt ook kan een 6-well-weefselkweek plaat worden gebruikt. In het geval van de transfectie van het extrachromosomal plasmiden is de 6-well-weefselkweek plaat resource-efficiënter. Gebruik van K. aerogenes SorMC 2 mL (OD600 = 2) schorsing per putje.
  2. Voorbereiding van Dictyostelium cellen
    1. Schraap met behulp van een lus van de wegwerp inoculatie 10 µL, cellen uit de groei zones (ongeveer 3 cm) van de cultuur-plaat (rand van het gewiste gebied) of uit te schakelen van de plaat. Pipetteer cellen in een tube van 1,5 mL met 1 mL ijskoud H40 buffer.
      Opmerking: De timing van het oogsten van cellen uit het ontruimen van de platen is van cruciaal belang. Het risico van opbrengst gedeeltelijk ontwikkeld oogst te vroeg opbrengsten te weinig een hoeveelheid cellen, terwijl de oogst aan de verhoging van de late cellen.
    2. Wassen van de cellen door spinnen neer voor 2 min op 1000 x g of flash-spinnen voor 2 s op 10.000 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in H40 buffer met een definitieve dichtheid voor 2-4 x 107 cellen/mL. De cellen koud houden tijdens de hele transfectie procedure. Gebruik een ijswater drijfmest om directe contact van de buizen en ijs.
  3. Electroporation
    1. Voeg 100 µL van de cellen tot een koker met 1-2 µg van DNA. Meng zorgvuldig door pipetteren omhoog en omlaag.
    2. Breng het mengsel cel/DNA in een vooraf gekoeld electroporation cuvette (2 mm verschil).
    3. De cellen met de volgende instellingen van de blokgolf Pulse: 350 V, 8 ms, 2 pulsen en 1 pulsinterval voor s.
      Opmerking: Voeg niet meer dan 2 µg van DNA. Hogere bedragen zijn giftig voor de cellen en afnemen van de transfectie efficiëntie. Het totaal toegevoegd DNA volume mag niet groter zijn dan 5 µL.
    4. Cellen onmiddellijk overbrengen in de eerder bereid 10 cm petrischaal met K. aerogenes SorMC en laat de cellen te herstellen voor 5 h.
      Opmerking: Controleer de cellen in de petrischaal onder een omgekeerde Microscoop. Cellen verschijnt direct na electroporation ronde maar zullen terugkeren naar hun Wortelpotigen vorm na ongeveer 30 minuten, als ze genoeg tijd hebben om goed te hechten aan het oppervlak.
  4. Selectie van transfectants: afhankelijk van of transfectie is bedoeld voor het genereren van een knock-out, knock-in of act5 knock-in of om uit te drukken een fluorescerende verslaggever eiwit uit een extrachromosomal plasmide, uitvoeren van het selectieproces door één van de volgende beschreven methoden.
    Opmerking: In tegenstelling tot axenically volwassen cellen zijn bacterially van volwassen cellen zeer resistent tegen blasticidin. Selectie, daarom wordt altijd uitgevoerd met behulp van G418 of hygromycin (zie discussie).
    1. Knock-outs, knock-ins en act5 knock-ins
      1. De cellen zorgvuldig uit de petrischaal loskoppelen door herhaaldelijk dwingen de vloeistof van een pipet op het oppervlak.
      2. Instellen van drie verdunningen in de SorMC K. aerogenes suspensie (OD600 = 2) en voeg de selecterende stof volgens de gebruikte weerstand (Zie Figuur 1).
      3. Lage verdunning: Meng 9 mL celsuspensie met 20.4 mL van SorMC en 600 µL van K. aerogenes stockoplossing.
      4. Middellange verdunning: Meng 900 µL celsuspensie met 28.5 mL van SorMC en 600 µL van K. aerogenes stockoplossing.
      5. Hoge verdunning: Meng 90 µL celsuspensie met 29.3 mL van SorMC en 600 µL van K. aerogenes stockoplossing.
      6. Voeg 30 µL van selecteerbare marker (100 x stockoplossing).
      7. De voorbereide verdunningen in 96-Wells flat-onderkant weefselkweek platen door pipetting 150 µL celsuspensie over elk putje verdelen.
        Opmerking: Deze procedure is gericht op het scherm enkele klonen in plaats van populaties. De selectie duurt ongeveer 5-7 dagen, afhankelijk van de constructie gebruikt.
    2. Extrachromosomal plasmiden
      1. De selecteerbare markering rechtstreeks toevoegen aan de 10 mL schotel (Zie Figuur 1).
        Opmerking: Behoeft niet instellen verdunningen, aangezien er geen verlangen naar klonale populaties. Het selectieproces voor extrachromosomal plasmiden verwachting sneller naar hoog moleculen aanwezig in D. discoideum cellen. Transfectants kan worden verwacht na 32 h tot 2 dagen.
        Let op: De antibiotica gebruikt als selecteerbaar merker zijn giftig. Draag handschoenen.
  5. Het scherm van de verkregen klonen voor positieve tranfectants. Voor de knock-out of knock-in pogingen, volg de instructies in stap 2.5.1. Controleer de transfectie succes voor extrachromosomal plasmiden met behulp van de instructies in stap 2.5.2.
    1. Uitvoeren voor uitsparingen knock-ins en act5 knock-ins, het eerste scherm via PCR te bevestigen van de integratie van de constructie in de juiste genomic locus.
      Opmerking: Gebruik het om kans te maximaliseren klonale populaties, de hoogste verdunning mogelijk dat de opbrengst van transfectants na selectie. Doel voor platen die een maximale eenderde van putten bezet zijn.
      1. Uit te breiden klonale populaties, overdracht van klonen die zijn opgegroeid na selectie van de 96-Wells-weefselkweek plaat in een 12-well-weefselkweek plaat groeien genoeg cellen voor de isolatie van genomic DNA. Leveren elk putje met 1 mL SorMC K. aerogenes (OD600 = 2) en verse selecteerbare marker.
        Opmerking: 1 dag is meestal voldoende voor een goed geschikt voor DNA isolatie heuvels.
      2. Voor het uitvoeren van mini genomic DNA-isolatie, oogsten van de cellen van een confluente goed en Isoleer genomic DNA met behulp van een mini DNA-extractie kit na instructies van de fabrikant.
      3. Gebruik de geïsoleerde genomic DNA samen met geschikte primers en Taq-polymerase (Zie Tabel van materialen) aan het PCR scherm voor positieve integralen.
        Opmerking: Na de bevestiging van positieve integratie in de juiste genomic locus, moet een zuidelijke vlekkenanalyse worden uitgevoerd. Dit zorgt voor meer vertrouwen dat extra plaatsingskosten gebeurtenissen aspecifieke genomic regio niet hebben plaatsgevonden.
    2. Voor fluorescerende verslaggever eiwitten, visueel identificeren positieve fluorescerende cellen en neem contact op met een fluorescentie Microscoop. Als alternatief, voer een westelijke vlek met geschikte antilichamen voor biochemische identificatie.
PCR programma
stap temperatuur tijd
Eerste denaturatie 94 ° C 30 s
30 cycli 94 ° C 15-30-s
42 ° C 15-60-s
68 ° C 1 min/kb
Final Extension 68 ° C 5 min
Houd 4-10 ° C
Samenstelling van de reactie
component 25 μL reactie eindconcentratie
10 µM voorwaartse Primer 0,5 ΜL 0,2 ΜM
10 µM omgekeerde Primer 0,5 ΜL 0,2 ΜM
Sjabloon DNA variabele (ca. 5 µL) < 1000 ng
2 x Master Mix met standaard Buffer, met inbegrip van de polymerase (zie tabel van materialen) 12.5 ΜL 1 x
Nuclease-gratis water tot 25 µL < 1000 ng

Tabel 2: PCR programma en monster samenstelling voor de amplificatie van D. discoideum genomic DNA.

Representative Results

Extrachromosomal plasmiden worden gebruikt voor verslaggever studies, die gericht zijn op het identificeren van de lokalisatie van bepaalde eiwitten in een cel of veranderingen in de cellulaire structuur van mutantcellen. Voor vele benaderingen, zoals de controle van de celcyclus, is het van cruciaal belang wil twee verslaggevers op hetzelfde moment. Dit is nu mogelijk met behulp van onze dubbele verslaggever extrachromosomal plasmide systeem (tabel 1). Op dag 1, werden cellen transfected alvorens toe te voegen de selecteerbare markering G418 na 5 uur (Figuur 1). In het voorbeeld, NC4 DdB, Ax2 en de onafhankelijk afgeleide wild isolaten V12M2 en WS2162 (aanvullende tabel 1) zijn transfected met de plasmide-pPI289, die codeert voor GFP-TubulinA, een marker voor microtubuli en mCherry-PCNA, een eiwit dat is gebruikt voor de controle van de celcyclus(Figuur 2). Na 32 h, werden de cellen onder de Microscoop waargenomen. De meerderheid van de cellen uitgedrukt beide TL-geëtiketteerden fusie-eiwitten, verslagen consistent met vorige die uitdrukking van twee verslaggevers van de dezelfde plasmide toont vergelijkbare expressie niveaus, wat bijna onmogelijk is bij het gebruik van twee verschillende plasmiden 18,19. Een representatieve cel voor elke regel van de cel (NC4 DdB, Ax2, V12M2 en WS2162) de gewenste dual verslaggever uitdrukken is afgebeeld in Figuur 2B. De efficiëntie van de transfectie worden samengevat in figuur2 C. NC4-afgeleide cellijnen Toon de beste transfectie efficiencyverbeteringen. Echter, cellijnen V12M2 en WS2162, een aanzienlijk hoge aantal transfectants werd behaald.

Figure 2
Figuur 2 : Uitdrukking van een extrachromosomal plasmide. (A) Extrachromosomal plasmiden zijn direct transfected in ronde vorm. Als voorbeeld, is de dubbele verslaggever pPI289 komt te staan. De NgoMIV sites geven het invoegen van de tweede verslaggever in de extrachromosomal expressie plasmide. (B) Z-projectie van een representatieve cel GFP-TubulinA (cytoplasmatische) en mCherry-PCNA (grotendeels nucleaire) voor vijf verschillende wild-type cellijnen gebruikt (NC4 DdB, Ax2, V12M2, WS2162). (C) de transfectie efficiëntie voor de vijf cellijnen afgebeeld in (B) werden berekend. Het gemiddelde van twee experimenten wordt getoond. Foutbalken geven ± SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Integratie van een targeting vector in een opgegeven genomic locus is moeilijker en vereist meer zorgvuldige analyse van de gegenereerde cellijn. In Figuur 3wordt een act5- mCherry-KI in NC4 geprobeerd. Ten eerste moet het plasmide te verhogen van de frequentie van recombinatie gebeurtenissen na transfectie worden linearized. Hiervoor wordt de plasmide pDM1514 gesneden met NgoMIV. Twee bands worden verkregen na het uitvoeren van de digest op een agarose gel. De band 4127 bp bevat de gewenste constructie (Figuur 3). Voor transfectie, het verteerd DNA moet worden geëxtraheerd vanaf de gel en gezuiverd met behulp van een gel extractie kit na instructies van de fabrikant.

Figure 3
Figuur 3 : Voorbereiding op act5 knock-in en DNA voor Transfectie. Een voorbeeld van het gebruik van een handelen5 knock-in de plasmide-pDM1514 wordt weergegeven. De stappen voor de voorbereiding van zijn als volgt vermeld. (A) vóór electroporation, linearize het plasmide met behulp van de aangegeven NgoMIV sites. (B, C) Voer de gesneden plasmide op een agarose gel totdat de twee verwachte bands zijn goed gescheiden. Knip uit de 4127 bp band met de armen recombinatie, mCherry en de weerstand-cassette, en gel extract het DNA. Het DNA is nu klaar voor Transfectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Het gezuiverde DNA werd gebruikt voor Transfectie NC4 cellen. Na 5-6 dagen van selectie, werden klonen verkregen. Representatieve transfectie efficiëntie en de hoeveelheid positieve geïdentificeerde klonen voor verschillende act5 knock-in pogingen zijn samengevat in tabel 3. Twee klonen van de transfectie NC4 werden willekeurig gekozen en geanalyseerd door PCR (Figuur 4A), en beide toonde de voorspelde band patronen van een knock-in verwacht en werden verder gevalideerd met zuidelijke vlekkenanalyse om te zorgen voor een interne integratie in geval van de constructie in het genoom20. De vlek toont een duidelijke interne integratie in de gewenste act5 locus (Figuur 4B). De gegenereerde cellijn van NC4::act5-mCherry kan nu worden gebruikt in experimenten.

Figure 4
Figuur 4 : Validatie van act5- mCherry KIs in NC4. (A) regeling en controle PCRs voor de validatie van positieve integraties in act5 locus. De aangegeven inleidingen werden gebruikt voor het analyseren van twee onafhankelijke klonen en de ouder. Beide klonen Toon de verwachte bands voor de weerstand-cassette en stroomafwaarts (P1) of upstream primer (P2), die niet aanwezig in de ouderlijke stam zijn. De combinatie van de primer (P1/P2) bevestigt de juiste integratie van mCherry en weerstand cassette in de locus act5 . De wild-type NC4 toont de verwachte 2800 bp band, terwijl beide KI klonen deze band ontbreken en in plaats daarvan een PCR product over 1400 basenparen groter tonen. (B) de regeling voor de beperking van de gebruikte digest en Southern blot. Beide klonen knock-in show de kleinere 3400 bp band, die is het resultaat van de integratie van de constructie in de locus handelen5, specifiek de aanvullende Bclik site in de hygromycin weerstand cassette. De wild-type controle toont de verwachte 5.8 kb die voortvloeien uit de twee stroomafwaarts gelegen Bclik sites. De vlek was bijgesneden en verbinding aan de randen voor de duidelijkheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

gerichte constructie in de locus act5 de naam van de plasmide aantal bezette wells aantal geselecteerde klonen Positieve klonen Juiste klonen (%) Dictyostelium stam efficiëntie van de transfectie (transfectants / 2 x 10 ^ 6/1 µg DNA)
LifeAct-mCherry pPI226 7 7 1 14.2 AX2 3.5 x 10 ^ -6
LifeAct-GFP pPI227 12 12 5 41,6 AX2 6 x 10 ^ -6
GFP pDM1513 3 3 2 66,6 AX2 1.5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 3 3 1 33.3 AX2 1.5 x 10 ^ -6
GFP pDM1513 66 9 5 55,5 AX2 3.3 x 10 ^ -5
mCherry pDM1514 221 12 10 83,3 AX2 1.1 x 10 ^ -4
H2B-mCherry pPI420 3 3 1 33.3 AX2 1.5 x 10 ^ -6
H2B-mCherry pPI420 7 7 6 85,7 AX2 3.5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 10 10 7 70 DdB 5 x 10 ^ -6
mCherry pDM1514 240 12 11 91,6 DdB 1.2 x 10 ^ -4
mCherry pDM1514 320 12 12 100 NC4 1.6 x 10 ^ -4

Tabel 3: transfectie efficiënties en het bedrag van de verkregen positieve transfectants voor de generatie van act5 KIs in verschillende stam achtergronden 22 .

De locus van handelen5 biedt relatief homogene uitdrukking van de geïntegreerde verslaggever21. De gegenereerde NC4::act5-mCherry -cellen toestaan mix experimenten met andere act5 knock-modules met behulp van een verschillende fluorescente proteïne zoals GFP worden uitgevoerd. Om te benadrukken het grote voordeel van dit systeem, worden mengen experimenten met Ax2::act5-GFP weergegeven. Als gevolg van het onvermogen om te transfect niet-een wild-type cellen, kon niet dit soort benadering worden uitgevoerd voordat. Mix experimenten zijn een belangrijk instrument voor het analyseren van het gedrag van de cel, omdat zij toestaan dat een directe vergelijking tussen verschillende cellijnen ervaren dezelfde proefomstandigheden. NC4 cellen groeien sneller op bacteriële gazons dan Ax2 cellen (Figuur 5A). Dit kan worden veroorzaakt door een hogere capaciteit om phagocytose van bacteriën of verbeterde mogelijkheden om te bewegen en de chemotaxis naar een bron van voedsel. Met behulp van een geringe agar folaat chemotaxis assay, werd directe vergelijking van een bevolking van NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFP uitgevoerd, waaruit blijkt dat de NC4::act5-mCherry zijn veel efficiënter in folaat sensing. Na 4 uur konden meer cellen van de NC4::act5-mCherry kruipen onder de agarose dan Ax2::act5-GFP cellen (Figuur 5B). Standaard metrics van chemotaxis voor de cellen migreren onder de agarose analyseren bleek dat de NC4::act5-mCherry cellen sneller waren en bleek sterker Chemotactische reactie dan Ax2::act5-GFP cellen (Figuur 5C-E ).

Figure 5
Figuur 5 : Met behulp van handelen5 KIs voor beeld-gebaseerde chemotaxis mix experimenten. (A) NC4::act5-mCherry en het Ax2::act5-GFP uiten van het aangegeven fluorescerende eiwit uit de locus handelen5 werden geanalyseerd voor de mogelijkheid om te groeien op een bacteriële gazon. Na 4 dagen, de diameter van de plaque ontstaan uit eenzame vergulde Dictyostelium cellen werden gemeten. Non-een act5:: NC4 cellen maken aanzienlijk groter plaques dan een Ax2::act5-GFP cellen (± SD, betekenen *** p < 0,0001, n = 3, schaal bar 5 mm). (B) voor gebruik van de onder-agarose folaat chemotaxis assay22 rechtstreeks vergelijken de Chemotactische capaciteiten van de NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFP gebruikt in (A), bacteriën-gegroeid amoeben van beide stammen waren gemengd in een verhouding van 50:50. Cellen mochten kruipen onder de agarose. Na 4 uur, werden cellen die van het verloop van folaat migreren waren beeld met behulp van een confocal microscoop. Het aantal cellen van de NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFP werd vervolgens vastgesteld. NC4::act5-mCherry cellen werden efficiënter in de detectie van folaat. Over 10-fold meer NC4::act5-mCherry cellen werden gevonden in vergelijking met Ax2::act5-GFP cellen (± SD, betekenen *** p < 0,0001, n = 6, schaal bar 100 µm). (C, D) De cellen werden gefilmd voor 60 min, en hun snelheid en Chemotactische index werden berekend. Na de voorselectie van de meest chemotactically responsieve cellen (alleen die gemigreerd onder de agarose), cellen Ax2::act5-GFP bleek lagere waarden voor cel snelheid én chemotaxis. Vijftig cellen per cellijn werden geanalyseerd. (mediaan ± SD, * p < 0,01, n = 3). (E) de tracks van NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFPact5 knock-ins meer dan 60 min., toont het meer gericht verkeer naar de bron van de chemoattractent van de NC4::act5-mCherry -cellen worden uitgezet (mediane ± SD, ** * p < 0,0001, n = 6). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De act5 knock-in cellijnen kunnen ook worden gebruikt voor stroom cytometry. Net als bij de groei van bacteriën, zijn er grote verschillen in ontwikkeling tussen een stammen en niet-een wild-types. Na ontwikkeling, zijn de vruchtlichamen van NC4 cellen ongeveer tweemaal zo groot als die afgeleid van Ax2 cellen. Als cellen worden gemengd, wordt een tussenliggende formaat fruiting body verkregen. Voor het analyseren van de bijdrage van de beide cellijnen meer kwantitatief, werd stroom cytometry gebruikt. Deze analyses bleek duidelijk dat de Midden-en kleinbedrijf vruchtlichamen te wijten aan verschillende niveaus van de bijdrage van beide cellijnen zijn. Terwijl NC4::act5-mCherry cellen tot ongeveer 75% van de gemeten sporen gemaakt, Ax2::act5-GFP bijgedragen slechts 25%, waaruit een potentiële fitness voordeel voor niet-een stammen (Figuur 6). Aangezien de analyse niet de stengel celpopulatie controleert, zijn er twee mogelijkheden om uit te leggen van de onbalans in ontwikkeling tussen Ax2 en NC4. Een mogelijkheid is dat Ax2 cellen dragen vooral aan de stengel celpopulatie, in plaats van het invoeren van de spore-celpopulatie. U kunt ook meer NC4 cellen kunnen invoeren de ontwikkelingstoxiciteit cyclus, met Ax2 relatief vertraagd, en ze zijn bijgevolg niet in staat om bij te dragen in de vergadering van een fruiting body. De mogelijkheid om te transfect niet-een wild-type cellen verder ontwikkelt andere benaderingen en vereenvoudigt aanzienlijk experimentele procedures.

Figure 6
Figuur 6: Act5 KIs toestaan analyse van mix-experimenten met behulp van stroom cytometry. (A) NC4::act5-mCherry en Ax2::act5-GFP afzonderlijk of in een 50:50 mengsel op niet-nutriënt agar platen werden ontwikkeld. NC4::act5-mCherry cellen vormen grotere vruchtlichamen dan Ax2::act5-GFP. De mix geeft in plaats daarvan een tussentijdse grootte (schaal bar 5 mm). De lichte microscopie van confocal fluorescentie suggereert een hoger bedrag van NC4::act5-mCherry sporen in de hoofden van de spore afgeleid van mixen. (B) te kwantificeren deze observatie, de hoeveelheid sporen in geoogste spore hoofden uit het mengen experiment in (A) werden geanalyseerd door stroom cytometry. Ongeveer 75% van de sporen afkomstig is van NC4::act5-mCherry -cellen, met slechts 25% uit Ax2::act5-GFP cellen. (C) vertegenwoordiger verspreiding van sporen van beide cellijnen wordt weergegeven in een stroom cytometry scatter. Ongeveer 0,05% weergeven positieve mCherry en GFP signalen, wat suggereert dat parasexual fusion processen hebben plaatsgevonden of dat er sporen zijn vasthouden aan elkaar Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Cellijn Genetisch achtergrond Referentienummer Gepubliceerd voordat Type
AX2 (Ka) DBS0235521 Bloomfield et al., 2008 wild type
NC4 (S) Bloomfield et al., 2008 wild type
act5::mCherry kloon 5 NC4 HM1912 Paschke et al., 2018 act5 knock-in
act5::GFP kloon 2 AX2 HM1930 Paschke et al., 2018 act5 knock-in
V12M2 Bloomfield et al., 2008 wild type
WS2162 Bloomfield et al., 2008 wild type

Aanvullende tabel 1: verschillende stammen van Dictyostelium studeerde.

Discussion

Het gebruik van niet-Axenische, wild-type Dictyostelium cellen geweest tot nu toe weinig in moleculair onderzoek. Beschikbare methoden voor genetische manipulatie van deze stammen hebben betrouwbaarheid en efficiëntie23, voorkomen van de algemene aanneming ervan ontbrak. De gegenereerde materialen en protocollen die hier gepresenteerd kunnen worden gebruikt voor elke D. discoideum stam onafhankelijk van haar vermogen om te groeien in de vloeistof. Er moet worden opgemerkt dat dit protocol is geoptimaliseerd voor NC4-afgeleide cellijnen. Transfectie efficiëntie voor vers geïsoleerde stammen uit het wild afwijken NC4, als we vóór hebben geconstateerd en hier voor V12M2 en WS21628,9worden weergegeven. De electroporation voorwaarden met name lijken te hebben een aanzienlijke invloed op de efficiëntie van de transfectie en kunnen eisen dat verdere optimalisatie voor sommige stammen. In het algemeen, een voldoende hoeveelheid transfectants waargenomen bij alle stammen getest tot nu toe, waaruit blijkt dat deze methoden werkbaar zijn. Het aantal positieve transfectants verkregen met behulp van NC4 afkomstige stammen is hoger in vergelijking met andere niet-een wild-type strains, maar in alle gevallen, worden voldoende aantal transfectants verkregen als u wilt toestaan voor verdere experimenten. Dit, plus de eenvoud van onze protocol, is de grote verbetering ten opzichte van eerdere pogingen8,9.

Deze nieuwe niet-een protocollen omvatten alle genetische standaardprocedures en toevoegen van verdere voordelen, aangezien het transfections kan worden uitgevoerd snel en efficiënt in parallel. Positieve klonen kunnen worden verkregen in de dagen in plaats van weken, sinds groei op bacteriën helften de tijd van de divisie. De nieuw opgerichte plasmiden ook werken in een omstandigheden en kunnen worden routinematig gebruikt in beide groei-omstandigheden, dat is een ander vooruitgang van deze methology22. Zoals in het protocol is opgenomen, de plasmide gebruikt voor selectie op bacteriën hebben speciale vereisten die zijn cruciaal voor het succes van de transfectie. De initiatiefnemers rijden de expressie en weerstand cassettes zijn met name belangrijk voor succesvolle transfectie. De vaak gebruikte act6 (actine 6) promotor24 voor het besturen van de weerstand of expressie cassettes mist efficiëntie wanneer cellen worden gekweekt op bacteriën. In onze plasmide-systeem rijdt de promotor van de zeer actieve act15 (actine 15) alle expressie cassettes, terwijl de weerstand cassettes onder de controle van de promotor van een coA (coactosin A), zowel zijn van die actief zijn in en een voorwaarden zijn cellen die op bacteriën worden gekweekt. Vereisten voor de expressie van verslaggever construeert evenals knock-in en knock-out constructies nopen tot het gebruiken van onze plasmide repertoire, maar helaas beperkt het gebruik van vectoren al gemaakt die gebruikmaken van de inefficiënte act6 promotor.

Promotor efficiencyeffecten zijn vooral kritiek voor transfections die afhangen van een gebeurtenis van de integratie van de enkel in de juiste genomic locus. Als gevolg van onze verbetering van initiatiefnemers rijden de genexpressie weerstand, wordt voldoende weerstand eiwit geproduceerd uit interne locus integraties. Een belangrijk aandachtspunt was de ten gunste van meerdere integraties in het genoom bij het gebruik van hygromycin of G418 zoals beschreven. Geen ten gunste van meerdere integraties geconstateerd is tot nu toe, zoals eerder gemeld voor G418 selecties met behulp van oudere promotor systemen25. Dit betekent dat zowel hygromycin en G418 zijn geschikt selecteerbare merkers voor de generatie van schone knock-outs en knock-ins. Helaas, de selecteerbare marker-blasticidin werkt niet onder niet-een omstandigheden. Dit is een groot nadeel van onze methode, omdat de blasticidin weerstand cassette routinematig gebruikt is voor het genereren van knock-out constructies in D. discoideum. Constructies die reeds werden gegenereerd met blasticidin weerstand cassettes moet worden rederived met behulp van een van de werkbare selecteerbare merkers. Een andere mogelijkheid om te overwinnen van deze beperking is het combineren van de onlangs opgerichte een D. discoideum CRISPR technologie met deze transfectie protocol26. De generatie van geschikt, één gids RNAs (sgRNAs) is eenvoudiger en sneller dan de wederopbouw van complete knock-out constructies. Voor toekomstige richtingen, de mogelijkheid van meerdere knock-outs te genereren met behulp van CRISPR/Cas9 in combinatie met dit protocol transfectie is aantrekkelijk en kan de weg vrijmaken voor veel onderzoekers in de Gemeenschap Dictyostelium . De uitvoerbaarheid van het systeem van de gevestigde voorbijgaande expressie gebruikt voor CRISPR/Cas9 in een volwassen cellen moet echter zorgvuldig worden onderzocht.

Het act5 knock-in systeem gepresenteerd biedt een betrouwbare en veilige integratie systeem voor het genereren van stabiele cellijnen in D. discoideum, met het voordeel van vergelijkbare sites gevestigd in andere organismen22. Ook hangt af van de gebeurtenis van een interne integratie in het genoom en biedt vele mogelijkheden voor verschillende onderzoek richtingen. De promotor van de act5 is sterk actief en garandeert bijna homogene expressie27 onafhankelijk van de voorwaarden van de teelt. Fluorescerende verslaggever eiwitten kunnen gemakkelijk geïntegreerd worden in deze veilige haven locus met behulp van de gemanipuleerde targeting plasmiden. Dit kan nuttig zijn, bijvoorbeeld voor cel-tracking doeleinden, zoals hier wordt weergegeven in een mix-experiment. De cellen Toon minimal cel-naar-cel expressie variabiliteit, die kan helpen bij het geautomatiseerde cel bijhouden. Nog belangrijker is, verschijnt de invoeging van een gewenste volgorde in de locus handelen5 fenotypische neutrale28,29. Als de expressie niet een selecteerbare marker om eiwituitdrukking, hangt zoals te zien in willekeurige integrants of extrachromosomal vector-bevattende cellijnen, kan het act5 -systeem nuttig zijn voor redding experimenten, ook. Aangezien de cellijnen homogene zijn, kunnen alle cellen worden geanalyseerd. Dit is niet mogelijk met behulp van een extrachromosomal plasmide voor expressie, waarin er aanzienlijke heterogeniteit in expressie is.

Naast deze algemene verbeteringen voor alle stammen maakt de mogelijkheid om niet-een wild-type cellen gebruiken voor moleculair onderzoek een beoordeling van de gevolgen van geaccumuleerde mutaties in huidige laboratorium stammen. Meerdere genetische herschikkingen is gebleken dat sinds de goedkeuring van de Ax2 stam in 1970, zoals blijkt uit de eerder gepubliceerde microarray analyse26. Synthetische fenotypen zijn vanwege de aanwezigheid van deze mutaties waargenomen. Bijvoorbeeld, toont een mutant gerapporteerde phg2 verminderde adhesie in één laboratorium stam achtergrond en verhoogde hechting in nog eens3. Dergelijke tegenstrijdige gegevens kunnen nu worden opgelost door het herhalen van het experiment in de gemeenschappelijke voorouder stam (in dit geval, DdB). De kracht van deze aanpak is onlangs gebleken voor de kleine GTPase RasS30,31.

De mogelijkheid voor het uitvoeren van genetische experimenten in alle discoideum D. stam breidt de mogelijkheden van nieuwe onderzoek richtingen die afhankelijk van het gebruik van wilde isolaten, met name die met betrekking tot de sociale evolutie, geslacht herkenning en de seksuele cyclus22.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgments

De auteurs bedanken het Kay lab voor de inbreng in deze methode en de LMB microscopie en stroom cytometry faciliteiten voor uitstekende wetenschappelijke en technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door Medical Research Council subsidie MC_U105115237 voor R. R. Kay, BBSRC (biotechnologie en biologische Sciences Research Council) subsidie BB/K009699/1 tot en met R. R. Kay, Cancer Research UK toekennen A15672 R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z te Jonathan R Chubb, MRC financiering (MC_U12266B) aan de MRC LMCB Universiteit eenheid aan de UCL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R ThermoScientific 05-400-002
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor ThermoScientific 12823252
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers Sigma Aldrich EP6331000025
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules BioRad 1652660
Safety Cabinet Foruna - SCANLAF Labogene
BioPhotometer Plus Eppendorf
CLSM 710 Zeiss
Media & Agaroses
LoFlo Medium Formedium LF0501
Seakem GTG Agarose Lonza 50071
Low EEO Agarose BioGene 300-200
Purified Agar Oxoid LP0028
SM broth Formedium SMB0102
2x LB broth Formedium LBD0102
Chemicals
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoScientific S33102
1 Kb Plus DNA Ladder ThermoScientific 10787018
1 Kb DNA Ladder NEB N3232L
HEPES free acid Sigma Aldrich/Merck 391340 EMD
KH2PO4 VWR P/4800/53
Na2HPO4 * 2 H2O VWR 10028-24-7
MgCl2 * 6 H2O Sigma Aldrich/Merck 5982 EMD
CaCl2 * 2 H2O Sigma Aldrich 442909
Folic Acid Sigma Aldrich F7876
KOH VWR 26668.263
Cultur Dishes
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3595
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 3516
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated Corning Incorporated 353003
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 MatTek Corporation P50G-1.5-30-F
Antibiotics
Geneticin G418-sulphate Gibco by Life Technologies 11811-023
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1
Additional Consumables
2 mm gap electroporation cuvettes, long electrode Geneflow Limited E6-0062
10 µL Inoculating Loop, Blue 10 Micro L ThermoScientific 129399
Spreader, L-shaped, sterile greiner bio-one 730190
Combitips advanced 5 mL Eppendorf BIOPUR 30089669
Kits
ZR Plasmid Miniprep Classic Zymoresearch D4016
Quick DNA Miniprep Kit Zymoresearch D3025
Zymoclean DNA Recovery Kit Zymoresearch D40002
Enzymes
Restriction enzymes NEB
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer NEB M0482L
T4 DNA Ligase NEB M0202S
PrimeSTAR Max DNA Polymerase TakaraBio R045A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaap, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum. Development. 138 (3), 387-396 (2011).
  2. Sussman, R., Sussman, M. Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).
  3. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), 75 (2008).
  4. Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein. The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).
  5. De Lozanne, A., Spudich, J. A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination. Science. 236, 1086-1091 (1987).
  6. Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).
  7. Knecht, D., Pang, K. M. Electroporation of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).
  8. Wetterauer, B., et al. Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene. Plasmid. 36, 169-181 (1996).
  9. Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains. Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).
  10. Bloomfield, G., et al. Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium. eLife. 4, (2015).
  11. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. eLife. 5, (2016).
  12. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).
  13. Hoeller, O., Kay, R. R. Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients. Current Biology. 17, 813-817 (2007).
  14. Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement. Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).
  15. Schaap, P., et al. Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas. Science. 314, 661-663 (2006).
  16. Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).
  17. Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes. Science. 333 (6041), 467-470 (2011).
  18. Strassmann, J. E., Queller, D. C. Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).
  19. Wolf, J. B., et al. Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success. Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).
  20. Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).
  21. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).
  22. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), 0196809 (2018).
  23. Woznica, D., Knecht, D. A. Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).
  24. Dubin, M., Nellen, W. A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium. Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).
  25. de Hostos, E. L., et al. Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility. Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).
  26. Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium. Scientific Reports. 8 (1), 8471 (2018).
  27. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  28. Rosengarten, R. D., et al. Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum. BMC Genomics. 16, 294 (2015).
  29. Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).
  30. Gebbie, L., et al. Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).
  31. Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).

Tags

Genetica kwestie 143 Dictyostelium transfectie knock-out knock-in extrachromosomal plasmiden act5 overexpressie chemotaxis beweeglijkheid macropinocytosis
Genetische manipulatie van <em>Dictyostelium discoideum</em> cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paschke, P., Knecht, D. A.,… More

Paschke, P., Knecht, D. A., Williams, T. D., Thomason, P. A., Insall, R. H., Chubb, J. R., Kay, R. R., Veltman, D. M. Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58981, doi:10.3791/58981 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter