Dictyostelium discoideum är en populär modellorganism att studera komplexa cellulära processer såsom cellmigration, endocytos och utveckling. Nyttan av organismen är beroende av genomförbarheten av genetisk manipulation. Här presenterar vi metoder för att transfect Dictyostelium discoideum celler som övervinna befintliga begränsningar av odling av celler i flytande media.
Dictyostelium discoideum är en spännande modellorganism för att studera cell differentiering processer under utveckling, cell signalering och andra viktiga cellulära biologi-frågor. Teknikerna som finns att genetiskt manipulera Dictyostelium celler är välutvecklade. Transfections kan utföras med olika valbara markörer och markör åter Cykling, inklusive homolog rekombination och insertionsmutationer. Detta stöds av en väl kommenterad genomet. Men dessa metoder är optimerade för axenic cellinjer som växer i flytande kulturer och är svåra att tillämpa icke-axenic vildtyp cellerna, vilket foder endast på bakterier. De mutationer som finns i axenic stammar stör Ras signalering, orsakar överdriven macropinocytosis krävs för utfodring och försämra cellmigration, som förvirrar tolkningen av signaltransduktion och chemotaxisna experiment i dessa stammar. Tidigare försök att genetiskt manipulera icke-axenic celler har saknat effektivitet och krävs komplexa experimentella procedurer. Vi har utvecklat ett enkelt transfection protokoll som, för första gången, övervinner dessa begränsningar. De serier av stora förbättringar till Dictyostelium molekylär genetik tillåta vildtyp celler att manipuleras så enkelt som standard laboratorie stammar. Utöver fördelarna för att studera okorrumperade signalering och motilitet processer, kan mutanter som stör macropinocytosis-baserade tillväxt nu lätt isolerade. Dessutom är hela transfection arbetsflödet avsevärt snabbare, med rekombinant celler som kan genereras i dagar snarare än veckor. En annan fördel är att molekylär genetik ytterligare kan utföras med nymalen isolerade vildtyp Dictyostelium prover från miljön. Detta kan bidra till att utvidga tillämpningsområdet för metoder som används inom dessa forskningsområden.
Släktet Dictyostelium är jord-levande sociala amöba som främst livnär sig på bakterier. Placeras i stammen Amoebozoa, ett stort antal arter har isolerats som kan grupperas i fyra olika klader1. Arten Dictyostelium discoideum (D. discoideum) har blivit en populär modellorganism att studera komplexa cellulära processer såsom cellmigration och fagocytos. Att styra och standardisera försöksbetingelser, axenic cell linjer har utvecklats som kan växa i komplexa eller definierade flytande medium i avsaknad av bakterier2. Särskilt viktiga är Ax2, Ax3, och Ax4 stammar, som alla genereras på 1970-talet och som ytterst härrör från en enda wild isolera NC43. Verktyg för gentekniken utvecklades i dessa axenic stammar, vilket resulterar i den första publicera knockout i 19874,5. Protokoll var ytterligare utvecklad och optimerad för användning under axenic villkor6,7.
Anpassning av dessa protokoll till vildtyp D. discoideum stammar som inte kan växa i flytande buljong har varit försökt flera laboratorier. Detta har dock inte blivit fullt framgångsrik eftersom protokollen transfection är komplexa och saknar effektivitet, delvis på grund av bakterierna förmåga att agera som en diskbänk för selektiva reagens8,9. Som ett resultat, kommer i huvudsak alla molekylär data på D. discoideum från ättlingar till en enda vildtyp-isolat. Vi ville övervinna denna begränsning och utveckla en metod för att genetiskt modifiera D. discoideum celler oberoende av deras förmåga att växa i flytande medium. Behovet av en sådan metod kan förklaras av observationen att det antogs i det förflutna som de mutationer som ger axenic tillväxt var huvudsakligen neutrala och inte försämrar cellfysiologi. Detta antagande är bara delvis korrekt. I allmänhet finns det två anmärkningsvärda skillnader; först, mellan de olika isolerade axenic stammar, och andra, när dessa axenic stammar är jämfört med icke-axenic vilda isolat8,9.
Den mest kritiska faktorn är kanske den viktigaste axenic gen, yxaB, som identifierades nyligen som RasGAP NF1. NF1 som en RasGAP viktigaste funktion är att hindra Ras aktivitet3. Borttagningen av enzym i alla axenic stammar leder till överdriven Ras aktivitet manifesteras som bildandet av stora aktiva Ras fläckar. Dessa utvidgade Ras patchar leda till ansamling av PIP3 i plasmamembranet. Dessa slump visasende fläckar av PIP3 och aktiv Ras är en mall för bildandet av en cirkulär volang som så småningom stänger och leder till bildandet av macropinosomes10. Följden är en överdriven ökning av macropinocytic aktivitet. Macropinocytosis är en aktin-driven process. En tävling för cytoskeletal komponenter för bildandet av antingen macropinosomes eller pseudopods är resultatet. Dess inverkan på cell beteende återspeglas i nästan fullständig förebyggande av chemotaxisna vegetativa celler till folat11. Den kraftigt utvidgade PIP3 fläckar är mycket långlivade. Även i utsvultna celler, PIP3 patchar kvar och kan misstolkas som pseudopods, vilket kan orsaka problem tolka studier på chemotaxis till lägret.
I vissa fall är NF1 mutationen experimentellt användbar. Detta leder oss till en andra motivation för att utveckla en transfection metod för bacterially odlade D. discoideum celler, eftersom ökningen av macropinocytosis hastighet gör axenic celler värdefull för att undersöka grundläggande aspekter av denna process12 . Mutation i de gener som krävs för macropinocytosis, såsom Ras- och PI3-kinaser10, har dock nästan avskaffat axenic tillväxt, vilket gör det nödvändigt att manipulera dessa celler genom tillväxt på bakterier. En annan anledning som återger bakterier-baserade transfections värdefull är den ökande användningen av Dictyostelids att utforska frågor i utvecklingen av flera cellularitet13,14, kin erkännande15,16, och altruistiska cellulära beteende, vilket främst beror på användning av nymalen isolerade vildtyp isolerar17. Alla nämnda forskningsområden kan underlättas genom effektiva metoder för genetisk manipulering av vilda isolat, som är icke-axenic och växer inte i flytande buljong.
Våra protokoll möjliggör att övervinna beskrivna begränsningar. Tillsammans, möjlighet att utföra genetiska manipulationer med bakteriell växt D. discoideum celler rymmer fördelar för alla Dictyostelium forskare, även om det är bara ökad hastighet av urvalsprocessen beror på snabbare tillväxten av amöban (4 h fördubbling tid) på bakterier jämfört med tillväxt i axenic media (10 h fördubbling tid).
Användning av icke-axenic, vildtyp Dictyostelium celler har varit mycket begränsad hittills i molekylär forskning. Tillgängliga metoder för genetisk modifiering av dessa stammar har saknat tillförlitlighet och effektivitet23, hindrar deras allmänna antagandet. De genererade material och protokoll som presenteras här kan användas för någon D. discoideum stam oberoende av dess förmåga för att växa i flytande medium. Det bör nämnas att detta protokoll är optimerad för NC4-derived cellinjer. Transfection effektivitetsvinster för färska isolerade stammar från vilt skiljer sig från NC4, så vi har iakttagits före och visas här för V12M2 och WS21628,9. Elektroporation villkoren i synnerhet verkar ha ett avsevärt inflytande på transfection effektivitetsvinster och kan kräva ytterligare optimering för vissa stammar. I allmänhet, en tillräcklig mängd av transfectants har observerats i alla stammar testat hittills visar att dessa metoder är fungerande. Antalet positiva transfectants som erhållits med NC4-derived stammar är högre jämfört med andra icke-axenic vildtyp-stammar, men i alla fall, erhålls tillräckligt antal transfectants för att tillåta att ytterligare experiment. Detta, plus enkelheten i våra protokoll, är det stor förbättring jämfört med tidigare försök8,9.
Dessa nya icke-axenic protokoll täcka alla genetiska standardförfaranden och lägga till ytterligare fördelar, eftersom transfections kan utföras snabbt och effektivt parallellt. Positiva kloner kan erhållas i dagar i stället för veckor, eftersom tillväxt på bakterier halvor division tiden. De nyinrättade plasmidsna också arbeta under axenic förhållanden och kan rutinmässigt användas under båda tillväxt villkorar, som är en annan befordran av denna metodik22. Införts i protokollet plasmiden används för selektion på bakterier har särskilda krav som är avgörande för framgången för transfection. I synnerhet är tillskyndarna körning uttrycket och motstånd korgarna viktiga för framgångsrik transfection. Används ofta act6 (aktin 6) arrangören24 för körning motstånd eller uttryck korgarna saknar effektivitet när cellerna odlas på bakterier. I vårt plasmid system kör högaktiv act15 (aktin 15) arrangören alla uttryck kassetter, medan motstånd kassetterna är under kontroll av en coA (coactosin A) arrangören, som båda är aktiva under axenic förhållanden och celler odlas på bakterier. Krav för uttrycket av reporter konstruerar samt inpressning och knock-out konstruktioner gör det nödvändigt att använda vår plasmid repertoar, men tyvärr begränsar användningen av vektorer som redan skapats som använder ineffektiva act6 arrangören.
Arrangören effektivitetsvinsterna är särskilt kritiska för transfections som beror på en enda integration händelse till den rätta genomisk locus. På grund av vår förbättring av initiativtagare körning uttrycket motstånd genen, produceras tillräckligt motstånd med protein från single locus integrationer. Ett stort bekymmer var den gynnar av flera integrationer i genomet när du använder hygromycin eller G418 som beskrivs. Ingen gynnar av flera integrationer har observerats hittills, som tidigare rapporterats för G418 val med hjälp av äldre arrangören system25. Detta innebär att både hygromycin och G418 är lämplig valbara markörer för generering av ren knock-outs och knock-ins. Tyvärr, den valbara markör blasticidin fungerar inte på icke-axenic villkor. Detta är en stor nackdel med vår metod, eftersom blasticidin motstånd kassett används rutinmässigt för att generera knock-out konstruktioner i D. discoideum. Konstruktioner som genererades redan med blasticidin motstånd kassetter kommer att behöva vara rederived med en av de fungerande valbara markörerna. En annan möjlighet att övervinna denna begränsning är att kombinera den nyligen inrättade axenic D. discoideum CRISPR teknik med denna transfection protokoll26. Generering av lämplig, enda guide RNAs (sgRNAs) är enklare och snabbare än återuppbyggnaden av fullständig knock-out konstruktioner. För framtida inriktningar, möjligheten att generera flera knock-outs med hjälp av CRISPR/Cas9 kombinerat med detta transfection protokoll är tilltalande och kan bana väg för många forskare inom gemenskapens Dictyostelium . Användbarheten av den etablerade övergående uttryck system för CRISPR/Cas9 i axenic odlade celler bör dock undersökas noggrant.
Act5 inpressning systemet presenteras erbjuder en pålitlig och säker integration system för generering av stabil cellinjer i D. discoideum, med fördelen av liknande platser i andra organismer22. Det också beror på en enda integration händelse i genomet och erbjuder många möjligheter till olika forskningsinriktningar. Act5 arrangören är starkt aktiva och garanterar nästan homogent uttryck27 oberoende av odling villkor. Fluorescerande reporter proteiner kan enkelt integreras i denna fristad locus använder de bakåtkompilerade inriktning plasmidsna. Detta kan vara användbart, exempelvis för cell-spårning ändamål, som visas här i en mix experiment. Cellerna visar minimal cell till cell uttryck variationer, som kan bistå i automatiserade cell tracking. Ännu viktigare, visas införandet av en önskad sekvens till det agera5 locus fenotypiskt neutrala28,29. Som uttrycket inte beror på en valbar markör att upprätthålla proteinuttryck, som sett i slumpmässiga integrants eller extrachromosomal vector-bärande cellinjer, kan act5 systemet vara användbar för räddning experiment, samt. Eftersom cellinjer är homogen, kan alla celler analyseras. Detta är inte möjligt med en extrachromosomal plasmid för uttryck, där det finns betydande olikheter i uttrycket.
Förutom dessa allmänna förbättringar för alla stammar kan förmågan att använda icke-axenic vildtyp celler för molekylär forskning en bedömning av effekterna av ackumulerade mutationer i nuvarande laboratorie stammar. Flera genetiska rearrangements har hittats sedan antagandet av Ax2 stammen 1970, som framgår av tidigare publicerade microarray analyser26. Syntetiska fenotyper observeras på grund av förekomsten av dessa mutationer. En rapporterad phg2 mutant visar exempelvis minskad friktion i ett laboratorium stam bakgrund och ökad vidhäftning i ytterligare3. Sådana motstridiga uppgifter kan nu lösas genom att upprepa experimentet i gemensamma förfader stam (i detta fall, DdB). Styrkan i detta synsätt har nyligen visat för de små GTPase RasS30,31.
Förmågan att utföra genetiska experiment i någon D. discoideum stam expanderar potentialen i nya forskningsinriktningar som beror på användning av vilda isolat, särskilt de som rör sociala evolution, kin erkännande och den sexuella cykel22.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Kay lab för indata till denna metod och LMB mikroskopi och flöde flödescytometri faciliteter för utmärkt vetenskapligt och tekniskt stöd. Detta arbete finansierades av medicinska forskningsrådet grant MC_U105115237 R. R. Kay, BBSRC (bioteknik och biologiska Sciences Research Council) grant BB/K009699/1 R. R. Kay, Cancer Research UK bevilja A15672 till R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z till Jonathan R Chubb och MRC finansiering (MC_U12266B) till MRC LMCB universitet enheten vid UCL.
Equipment | |||
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R | ThermoScientific | 05-400-002 | |
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor | ThermoScientific | 12823252 | |
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers | Sigma Aldrich | EP6331000025 | |
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules | BioRad | 1652660 | |
Safety Cabinet Foruna – SCANLAF | Labogene | ||
BioPhotometer Plus | Eppendorf | ||
CLSM 710 | Zeiss | ||
Media & Agaroses | |||
LoFlo Medium | Formedium | LF0501 | |
Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | |
Low EEO Agarose | BioGene | 300-200 | |
Purified Agar | Oxoid | LP0028 | |
SM broth | Formedium | SMB0102 | |
2x LB broth | Formedium | LBD0102 | |
Chemicals | |||
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoScientific | S33102 | |
1 Kb Plus DNA Ladder | ThermoScientific | 10787018 | |
1 Kb DNA Ladder | NEB | N3232L | |
HEPES free acid | Sigma Aldrich/Merck | 391340 EMD | |
KH2PO4 | VWR | P/4800/53 | |
Na2HPO4 * 2 H2O | VWR | 10028-24-7 | |
MgCl2 * 6 H2O | Sigma Aldrich/Merck | 5982 EMD | |
CaCl2 * 2 H2O | Sigma Aldrich | 442909 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876 | |
KOH | VWR | 26668.263 | |
Cultur Dishes | |||
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3595 | |
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3516 | |
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 353003 | |
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 | MatTek Corporation | P50G-1.5-30-F | |
Antibiotics | |||
Geneticin G418-sulphate | Gibco by Life Technologies | 11811-023 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
Additional Consumables | |||
2mm gap electroporation cuvettes, long electrode | Geneflow Limited | E6-0062 | |
10 µl Inoculating Loop, Blue 10 Micro L | ThermoScientific | 129399 | |
Spreader, L-shaped, sterile | greiner bio-one | 730190 | |
Combitips advanced 5 ml | Eppendorf BIOPUR | 30089669 | |
Kits | |||
ZR Plasmid Miniprep Classic | Zymoresearch | D4016 | |
Quick DNA Miniprep Kit | Zymoresearch | D3025 | |
Zymoclean DNA Recovery Kit | Zymoresearch | D40002 | |
Enzymes | |||
Restriction enzymes | NEB | ||
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | TakaraBio | R045A |