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Biochemistry

साइट-निर्देशित Mutagenesis इन विट्रो में और Vivo प्रयोगों उदाहरण में आरएनए बातचीत के साथ ई कोलाई

Published: February 5, 2019 doi: 10.3791/58996
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

Summary

साइट निर्देशित mutagenesis एक तकनीक को deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) में विशिष्ट उत्परिवर्तनों परिचय प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे साइट करने के लिए-एक 2 कदम और 3 कदम पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) आधारित दृष्टिकोण है, जो ब्याज की किसी भी डीएनए टुकड़ा करने के लिए लागू है के साथ mutagenesis का निर्देशन किया ।

Abstract

साइट निर्देशित mutagenesis एक तकनीक के डीएनए में विशिष्ट उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए छोटे गैर कोडिंग ribonucleic एसिड (sRNA) अणुओं और लक्ष्य दूत RNAs (mRNAs) के बीच बातचीत की जांच का इस्तेमाल किया है । इसके अलावा, साइट निर्देशित mutagenesis आरएनए के लिए विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों को मैप करने के लिए प्रयोग किया जाता है । उत्परिवर्तनों के एक 2 कदम और 3 कदम पीसीआर आधारित परिचय वर्णित है । यह दृष्टिकोण सभी प्रोटीन-आरएनए और आरएनए-आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए प्रासंगिक है । संक्षेप में, तकनीक वांछित उत्परिवर्तन (ओं) के साथ प्राइमर डिजाइनिंग पर निर्भर करता है, और पीसीआर के 2 या 3 कदम के माध्यम से उत्परिवर्तन के साथ एक पीसीआर उत्पाद synthesizing । इसके बाद क्लोनिंग के लिए पीसीआर प्रोडक्ट का इस्तेमाल किया जाता है । यहां, हम वर्णन कैसे साइट प्रदर्शन करने के लिए दोनों 2 और 3 कदम दृष्टिकोण को sRNA, McaS, और mRNA, csgD, आरएनए-आरएनए और आरएनए-प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए उत्परिवर्तनों परिचय के साथ mutagenesis का निर्देशन किया । हम आरएनए बातचीत की जांच करने के लिए इस तकनीक लागू; हालांकि, तकनीक सभी mutagenesis अध्ययन करने के लिए लागू है (जैसे, डीएनए प्रोटीन बातचीत, एमिनो एसिड प्रतिस्थापन// यह गैर प्राकृतिक ठिकानों के अलावा उत्परिवर्तन के किसी भी प्रकार का परिचय संभव है, लेकिन तकनीक केवल लागू है अगर एक पीसीआर उत्पाद बहाव आवेदन (जैसे, क्लोनिंग और आगे पीसीआर के लिए टेंपलेट) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

डीएनए अक्सर सेल के सभी संरचनाओं इसके डीएनए के अनुक्रम में इनकोडिंग रहे हैं के बाद से एक जीवित कोशिका के खाका के रूप में जाना जाता है । सटीक प्रतिकृति और डीएनए मरंमत तंत्र सुनिश्चित करें कि उत्परिवर्तनों के केवल बहुत कम दर हो, जो कोडित जीन के सही कार्यों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । डीएनए अनुक्रम के परिवर्तन डीएनए (प्रतिलेखन कारकों और प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा मांयता) के साथ शुरू विभिन्न स्तरों पर क्रमिक कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं, तो आरएनए (आधार जोड़ी complementarity और माध्यमिक संरचना परिवर्तन) और/या प्रोटीन (अमीनो एसिड प्रतिस्थापन, विलोपन, परिवर्धन या फ्रेम-पाली) । जबकि कई उत्परिवर्तनों जीन समारोह काफी प्रभावित नहीं है, डीएनए में कुछ उत्परिवर्तनों भारी निहितार्थ हो सकते हैं । इस प्रकार, साइट निर्देशित mutagenesis सभी स्तरों पर विशिष्ट डीएनए साइटों के महत्व का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक लक्षित mutagenesis विशिष्ट उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण । प्रोटोकॉल दो अलग पीसीआर रणनीतियों पर निर्भर करता है: एक 2 कदम या एक 3-कदम पीसीआर । 2-कदम पीसीआर अगर वांछित उत्परिवर्तन के करीब है या तो 5 ' अंत या ब्याज के डीएनए के 3 ' अंत (< 200 आधार जोड़े (बीपी) के अंत से) और 3 कदम पीसीआर सभी मामलों में लागू है ।

2-कदम पीसीआर दृष्टिकोण में, 3 प्राइमरों डिजाइन किए हैं, जिसमें प्राइमरों के एक सेट के लिए ब्याज (प्राइमरों 1 और 3, आगे और रिवर्स, क्रमशः) के डीएनए बढ़ाना डिज़ाइन किया गया है, और एक ही किताब उत्परिवर्तन शामिल बनाया गया है । इस उत्परिवर्तन शुरू प्राइमर (प्राइमर 2) एक रिवर्स अभिविंयास अगर उत्परिवर्तन है 5 ' अंत और एक आगे अभिविंयास के करीब है अगर उत्परिवर्तन ' 3 अंत के करीब है चाहिए । पहली पीसीआर चरण में, प्राइमर 1 + 2 या 2 + 3 क्रमशः 5 ' अंत या 3 ' अंत करने के लिए करीब एक छोटा सा टुकड़ा को परिलक्षित करता है । परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पाद तो प्राइमर 1 या 3 के साथ कदम दो में एक किताब के रूप में प्रयोग किया जाता है, इस प्रकार ब्याज के डीएनए में उत्परिवर्तन के साथ एक पीसीआर उत्पाद में जिसके परिणामस्वरूप (आंकड़ा 1a) ।

3-चरण पीसीआर में 4 प्राइमरों डिजाइन किए हैं, जिसमें प्राइमरों के एक सेट के लिए ब्याज (प्राइमरों 1 और 4, आगे और रिवर्स, क्रमशः) के डीएनए बढ़ाना डिज़ाइन किया गया है और प्राइमरों का एक सेट अतिव्यापी complementarity के साथ विशिष्ट उत्परिवर्तनों को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है (प्राइमरों 2 और 3, रिवर्स और आगे, क्रमशः) । चरण में एक और दो, प्राइमरों 1 + 2 और 3 + 4 बढ़ाना 5 ' और 3 ' अंत । चरण तीन में, परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों से कदम एक और दो के रूप में उपयोग किया जाता है टेंपलेट्स और प्राइमरों के साथ प्रवर्धित 1 + 4 । इस प्रकार, परिणामी पीसीआर उत्पाद वांछित उत्परिवर्तन (आंकड़ा 1b) के साथ ब्याज की डीएनए है ।

जबकि रूपांतरित डीएनए किसी भी बहाव आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे फिर से एक क्लोनिंग वेक्टर में डीएनए गठबंधन । क्लोनिंग वैक्टर के उपयोग के कई फायदे है जैसे क्लोनिंग और विशिष्ट प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की सुविधाओं के आधार पर सदिश की आसानी के रूप में । इस सुविधा को अक्सर आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए प्रयोग किया जाता है । आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए एक और तकनीक एक और आरएनए1,2 या प्रोटीन3,4के साथ परिसर में आरएनए की संरचनात्मक जांच है । हालांकि, संरचनात्मक जांच केवल इन विट्रो में किया जाता है, जबकि साइट-निर्देशित mutagenesis और बाद में क्लोनिंग vivo में बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं ।

साइट निर्देशित mutagenesis बड़े पैमाने पर यहां प्रस्तुत के रूप में आरएनए संपर्क अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, 2-या 3-चरणीय पीसीआर के संबंध में प्रमुख विधि डीएनए के किसी भी टुकड़े पर लागू होती है, और इस प्रकार केवल आरएनए-इंटरैक्शन अध्ययनों तक ही सीमित नहीं है ।

उदाहरण देना करने के लिए तकनीक और इसके संभव का उपयोग करता है, के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्रों के लक्षण वर्णन के बाद transcriptional विनियमन के mRNA, csgD, के ई कोलाई (ई. कोलाई) किया जाता है । ई. कोलाई में, csgD एक प्रोटीन के साथ सहयोग में छोटे गैर कोडिंग आरएनए, McaS, द्वारा लक्षित है, Hfq, csgD2,4,5के प्रोटीन दमन करने के लिए । तकनीक csgD और McaS के बीच आधार बाँधना क्षेत्र के लिए उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और csgDके Hfq बंधन साइट के लिए । प्राप्त डीएनए तो एक वेक्टर में बाद में प्रयोगों के लिए उपयुक्त क्लोन है । तकनीक के बहाव अनुप्रयोगों में vivo और इन विट्रो प्रयोगों में दोनों शामिल हैं । उदाहरण के लिए, एक पश्चिमी दाग परख और 2 उदाहरण का उपयोग कर vivo में विशेषता है एक electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA) का उपयोग कर इन विट्रो में विशेषता है । दोनों ही मामलों में, यह कैसे साइट निर्देशित mutagenesis अंय तकनीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए ब्याज की एक जीन के बारे में जैविक निष्कर्ष सचित्र है ।

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Protocol

1. वेक्टर चयन

  1. के साथ बहाव प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक सदिश चुनें । किसी भी वेक्टर इस 2-और 3-कदम पीसीआर विधि के लिए लागू है ।
  2. सदिश की पसंद के आधार पर, क्लोनिंग के लिए उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइमों का चयन करें ।

2. साइट निर्देशित mutagenesis के लिए प्राइमरी डिजाइन

  1. 2-कदम या 3 कदम पीसीआर रणनीति के बीच तय (2-कदम केवल परिवर्तन के लिए है < ब्याज के डीएनए के या तो अंत से 200 बीपी) । 2-चरण पीसीआर के लिए, चरण २.२ पर जाएं और 3-चरणीय पीसीआर के लिए २.३ चरण पर जाएं ।
  2. 2-कदम पीसीआर के लिए डिजाइन प्राइमर ।
    1. डिजाइन प्राइमर 1 और 3 के लिए ब्याज के डीएनए बढ़ाना और एक 5 ' के साथ बदस्तूर है कि 4 न्यूक्लियोटाइड शामिल है (जैसे, अतत या AGCT) प्रासंगिक प्रतिबंध मांयता आवश्यक साइट के बाद चुना सदिश में क्लोन करने के लिए ।
    2. डिजाइन प्राइमर 2 के लिए वांछित साइट (ओं) में उत्परिवर्तन (ओं) परिचय और दोनों पक्षों पर 10-15 पूरक न्यूक्लियोटाइड के साथ उत्परिवर्तन पार्श्व । अगर उत्परिवर्तन ' 3 अंत में शुरू की है 5 ' अंत या आगे में शुरू की है तो प्राइमर रिवर्स बनाओ ।
  3. 3-कदम पीसीआर के लिए डिजाइन प्राइमर ।
    1. डिजाइन प्राइमर 1 और 4 के लिए ब्याज के डीएनए बढ़ाना और एक 5 ' के साथ जारी रखना है कि 4 न्यूक्लियोटाइड (जैसे, अतत या AGCT) प्रासंगिक प्रतिबंध मांयता आवश्यक साइट के बाद चुना सदिश में क्लोन करने के लिए ।
    2. डिजाइन प्राइमर 2 और 3 के लिए वांछित साइट (ओं) में उत्परिवर्तन (ओं) परिचय और दोनों पक्षों पर 10-15 पूरक न्यूक्लियोटाइड द्वारा उत्परिवर्तन पार्श्व । प्राइमर 2 और 3 रिवर्स पूरक हैं ।

3. क्लोनिंग के लिए जंगली प्रकार डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन

नोट: पीसीआर पर जानकारी के लिए,6देखें ।

  1. पीसीआर प्रदर्शन6 प्राइमरों का प्रयोग 1 + 2 (2-कदम पीसीआर) या 1 + 4 (3-कदम पीसीआर) और उपयोग जंगली प्रकार डीएनए टेंपलेट के रूप में पीसीआर उत्पाद प्राप्त करने के लिए I. 1 टेबलमें पीसीआर प्रोग्राम का प्रयोग करें ।
  2. agarose जेल ट्रो द्वारा पीसीआर बिछाना ।
    1. एक agarose जेल समाधान करें (2%) agarose के प्रति 2 ग्राम को जोड़कर १०० एमएल का 1x Tris-एसीटेट-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (ताे) बफर । एक माइक्रोवेव ओवन में उबलते द्वारा agarose भंग । डीएनए धुंधला डाई ethidium ब्रोमाइड जोड़ें (के लिए एक अंतिम एकाग्रता ~ ०.५ µ g/एमएल) दृश्य के लिए agarose जेल समाधान के लिए ।
    2. कास्ट agarose जेल, यह एक ट्रो इकाई में जगह है, और लोड पीसीआर नमूनों (डीएनए लोड हो रहा है डाई के साथ मिश्रित) और ज्ञात आकार के एक डीएनए सीढ़ी । ४५ मिनट के लिए ७५ डब्ल्यू पर नमूने भागो, या जब तक बैंड पर्याप्त रूप से अलग कर रहे हैं, और एक अल्ट्रा वायलेट (यूवी) मेज पर या एक जेल इमेजिंग प्रणाली के साथ बैंड कल्पना ।
  3. एक जेल निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) के साथ पीसीआर उत्पाद शुद्ध और एक spectrophotometer (सामग्री की तालिका) के साथ शुद्ध डीएनए की एकाग्रता को मापने ।
  4. -20 ° c पर शुद्ध डीएनए स्टोर (Tris-EDTA (ते) बफर-दीर्घकालिक भंडारण) या 4 ° c (डीएच2ओ में-अल्पावधि भंडारण) चरण 5 में इस्तेमाल किया जब तक ।

4. पीसीआर परिचय साइट-डीएनए में उत्परिवर्तनों का निर्देश दिया

  1. 2-चरणीय पीसीआर के लिए पीसीआर (3-चरण पीसीआर के लिए ४.२ चरण देखें)
    1. पीसीआर प्रदर्शन6 प्राइमरों का प्रयोग 1 + 2 यदि उत्परिवर्तनों में है 5 ' अंत या 2 + 3 यदि उत्परिवर्तनों 3 ' अंत में कर रहे है और एक टेंपलेट के रूप में जंगली प्रकार के डीएनए का उपयोग करने के लिए पीसीआर उत्पाद द्वितीय प्राप्त ( 1 टेबल देखें पीसीआर कार्यक्रम के लिए) ।
    2. agarose जेल ट्रो द्वारा मांय पीसीआर के रूप में कदम 3.2.1 और 3.2.2 ।
    3. एक जेल निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) के साथ पीसीआर उत्पाद शुद्ध और एक spectrophotometer (सामग्री की तालिका) के साथ शुद्ध डीएनए की एकाग्रता को मापने ।
    4. -20 डिग्री सेल्सियस (ते बफर में) या 4 ° c (डीएच2O में) में इस्तेमाल किया जब तक चरण 5 में शुद्ध डीएनए की दुकान ।
    5. पीसीआर6 के साथ प्राइमर के रूप में पीसीआर उत्पाद द्वितीय का प्रयोग 3 प्राइमर के साथ एक साथ यदि उत्परिवर्तनों 5 ' अंत में या 1 प्राइमर अगर उत्परिवर्तनों 3 ' अंत में है और टेंपलेट के रूप में जंगली प्रकार के डीएनए का उपयोग करें पीसीआर उत्पाद III प्राप्त करने के लिए (पीसीआर कार्यक्रम के लिए 1 टेबल देखें) ।
    6. agarose जेल ट्रो द्वारा मांय पीसीआर के रूप में कदम 3.2.1 और 3.2.2 ।
    7. एक जेल निष्कर्षण किट (सामग्री की मेज) और एक spectrophotometer (सामग्री की तालिका) के साथ शुद्ध डीएनए के उपाय एकाग्रता के साथ पीसीआर उत्पाद को शुद्ध ।
    8. -20 डिग्री सेल्सियस (ते बफर में) या 4 ° c (डीएच2O में) चरण 5 तक शुद्ध डीएनए की दुकान ।
  2. 3-स्टेप पीसीआर के लिए पीसीआर
    1. पीसीआर6 प्राइमरों का उपयोग करते हुए 1 + 2 और 3 + 4 अलग प्रतिक्रियाओं में और पीसीआर उत्पाद द्वितीय और तृतीय प्राप्त करने के लिए टेम्पलेट के रूप में जंगली प्रकार डीएनए का उपयोग (पीसीआर कार्यक्रम के लिए 1 टेबल देखें) ।
    2. मान्य पीसीआर द्वारा agarose जेल ट्रो के रूप में चरण 3.2.1 और 3.2.2.
    3. एक जेल निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) के साथ पीसीआर उत्पादों को शुद्ध और एक spectrophotometer (सामग्री की तालिका) के साथ शुद्ध डीएनए की एकाग्रता को मापने ।
    4. -20 ° c (ते बफर में) या 4 ° c (डीएच2O में) पर शुद्ध डीएनए की दुकान ।
    5. प्रदर्शन पीसीआर6 प्राइमरों का उपयोग कर 1 + 4 और पीसीआर उत्पाद चतुर्थ प्राप्त करने के लिए (एक ही प्रतिक्रिया में) (पीसीआर कार्यक्रम के लिए टेबल 1 देखें) टेम्पलेट्स के रूप में दोनों के लिए एक ही कार्रवाई के रूप में द्वितीय और तृतीय के 2-5 एनजी का उपयोग करें ।
    6. agarose जेल ट्रो द्वारा मांय पीसीआर के रूप में कदम 3.2.1 और 3.2.2 ।
      नोट: यह असामांय नहीं है कई गलत बैंड मिल (कभी कम टेंपलेट का उपयोग करके कम किया जा सकता है) । हालांकि, गलत पीसीआर उत्पादों को नजरअंदाज किया जा सकता है अगर सही ढंग से आकार बैंड उत्पाद और जेल निकाली गई है ।
    7. यदि सही है, तो एक जेल निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) और एक spectrophotometer (सामग्री की तालिका) के साथ शुद्ध डीएनए के उपाय एकाग्रता के साथ पीसीआर उत्पाद को शुद्ध ।
    8. -20 डिग्री सेल्सियस (ते बफर में) या 4 ° c (डीएच2O में) चरण 5 तक शुद्ध डीएनए की दुकान ।

5. जंगली प्रकार के और उत्परिवर्ती संस्करण (एस) डीएनए के चुना वेक्टर में पुनर्संयोजन

नोट: निम्न चरणों पर विवरण के लिए, देखें7.

  1. डाइजेस्ट शुद्ध पीसीआर उत्पादों मैं और III (से 2-चरण पीसीआर) और/या IV (3 से कदम पीसीआर) प्रासंगिक प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर ।
    1. में 20 µ एल 1x पाचन बफर के 1 µ एल के साथ प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम, डाइजेस्ट २०० ३७ डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर उत्पाद के एनजी 30-60 मिनट के लिए ।
  2. जेल द्वारा शुद्ध पचता पीसीआर उत्पाद-निष्कर्षण एक जेल निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर, एक spectrophotometer (सामग्री की तालिका) के साथ शुद्ध डीएनए के डीएनए एकाग्रता को मापने, और में-20 डिग्री सेल्सियस (ते बफर में) या 4 डिग्री सेल्सियस (डीएच 2 में स्टोर ओ) जब तक ५.६ कदम के लिए इस्तेमाल किया ।
  3. डाइजेस्ट शुद्ध वेक्टर प्रासंगिक प्रतिबंध एंजाइमों के साथ और क्षारीय फॉस्फेट के साथ इलाज के लिए वेक्टर पुनः बंधाव घटनाओं में कमी । पीसीआर प्रोडक्ट्स को क्षारीय फॉस्फेट के साथ न मानें ।
    1. में 30 µ एल 1x पाचन बफर के 1 µ एल के साथ प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम और 1 µ एल के alkaline फॉस्फेट, डाइजेस्ट १,००० एनजी के लिए ३७ ° c पर 30-60 मिनट के लिए ।
  4. बर्बाद डीएनए से अलग पचा वेक्टर (जैसे, बिना खतना के वेक्टर और कट-बाहर डीएनए) agarose जेल ट्रो का उपयोग कर के रूप में कदम 3.2.1 और 3.2.2 ।
  5. शुद्ध पचा वेक्टर जेल द्वारा-निष्कर्षण एक जेल निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर, एक spectrophotometer (सामग्री की तालिका) के साथ शुद्ध डीएनए के डीएनए एकाग्रता को मापने, और में-20 डिग्री सेल्सियस (ते बफर में) या 4 डिग्री सेल्सियस (डीएच2में) की दुकान जब तक ५.६ चरण के लिए उपयोग किया ।
  6. Ligate 2 तालिकामें निर्दिष्ट प्रतिक्रियाओं के साथ पचा वेक्टर में पीसीआर उत्पादों पचा लिया ।
  7. 16 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे या रात के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  8. बंधाव प्रतिक्रियाओं के साथ प्राप्तकर्ता तनाव (जैसे, ई. कोलाई K12) रूपांतरण ।
    1. बढ़ने के लिए तनाव आयुध डिपो६००= 0.3-0.5 और एक 1 मिलीलीटर संस्कृति हस्तांतरण के रूप में कई १.५ मिलीलीटर ट्यूबों ligase प्रतिक्रियाओं के रूप में ।
    2. 5 मिनट के लिए ३,५०० x g पर स्पिन और supernatant त्यागें ।
    3. परिवर्तन बफर के २०० μL में कोशिकाओं resuspend (०.१ ग्राम/एमएल पॉलीथीन ग्लाइकोल ३३५०, 5% dimethyl सल्फेट और 20 मिमी MgCl2) के साथ lysogeny शोरबा (पौंड) के 10 मिलीलीटर ।
    4. बंधाव प्रतिक्रिया जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों जगह है ।
    5. ४२ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए हीट शॉक ।
    6. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए पौंड की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और phenotypic की अनुमति दें एंटीबायोटिक प्रतिरोध की अभिव्यक्ति के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस से कम ४५ मिनट ।
    7. 5 मिनट के लिए ३,५०० x g पर कक्षों को स्पिन करें, supernatant के 1 मिलीलीटर को छोड़ें, और शेष supernatant में कक्षों को पुनर्स्थगित करें ।
    8. प्लेट उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ प्लेटों पर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  9. डीएनए डालने के सफल एकीकरण के साथ transformants बंदरगाह वैक्टर की पहचान (उदाहरण के लिए, पीसीआर द्वारा सदिश का उपयोग कर-और डालने के विशिष्ट प्राइमरों) ।
  10. सैंज अनुक्रमण द्वारा डीएनए के अनुक्रम मान्य ।
    चेतावनी: ५.९ चरण के लिए उपयोग के रूप में sequencing के लिए एक ही प्राइमरों का उपयोग न करें ।

6. में इन विट्रो और/या vivo प्रयोगों में के लिए निर्माण वैक्टर का उपयोग

  1. vivo प्रयोग में
    नोट: यह एक सदिश का उपयोग करने के लिए जंगली प्रकार/रूपांतरित आरएनए व्यक्त करने के बाद transcriptional विनियमन विशेषता का एक उदाहरण है । पश्चिमी सोख्ता पर अधिक जानकारी के लिए,8देखें ।
    1. हो जाओ ई. कोलाई K12 उपभेदों उचित माध्यम में निर्मित वैक्टर के साथ और प्रेरित अभिव्यक्ति यदि आवश्यक हो । केंद्रापसारक द्वारा फसल नमूने ।
    2. सोडियम dodecyl सल्फेट के लिए नमूने तैयार-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) 1x एसडीएस नमूना बफर में सेल छर्रों भंग करके (६२.५ mM Tris-एचसीएल पीएच ६.८, २.५% एसडीएस, ०.००२% bromophenol नीला, 5% β-mercaptoethanol, 10% ग्लिसरॉल) और 5 के लिए ९५ ° c पर फोड़ा न्यूनतम.
      नोट: यह एक जेल कास्ट या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जेल का उपयोग करने के लिए संभव है । उत्तरार्द्ध चित्रा 3 (सामग्री की मेज) में प्रस्तुत परिणामों में इस्तेमाल किया गया था ।
    3. लोड 10 अलग कुओं में प्रत्येक नमूने के7 कोशिकाओं (एक प्रोटीन सीढ़ी शामिल हैं), और २०० V पर जेल चलाने जब तक प्रोटीन (लगभग ४५ मिनट) अलग कर रहे हैं ।
    4. दाग एक फाइबर-झिल्ली पर अर्द्ध शुष्क स्थानांतरण द्वारा ८० mA पर प्रोटीन 1 एच के लिए ।
    5. प्रोटीन का एक मिश्रण के साथ झिल्ली ब्लॉक (जैसे, 5% दूध पाउडर 1x के बीच में भंग 20-Tris-बफर खारा (TTBS) बफर) ।
    6. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (1x TTBS बफर में भंग) कि ब्याज के प्रोटीन लक्ष्य (जैसे, GFP-, झंडा, या अपने प्रोटीन टैग) और कोमल आंदोलन के साथ 1 एच के लिए मशीन ।
    7. 10 मिनट के लिए 1x TTBS में धो झिल्ली असीम एंटीबॉडी को दूर करने के लिए । दोहराएं और दो बार ।
    8. माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (1x TTBS बफर में भंग) कि प्राथमिक एंटीबॉडी लक्ष्य और पता लगाने के लिए अनुमति (जैसे, सहिजन peroxidase (एचआरपी)-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी. कोमल आंदोलन के साथ 1 एच के लिए मशीन ।
    9. 10 मिनट के लिए 1x TTBS में झिल्ली धो असीम एंटीबॉडी हटाने के लिए । दोहराएं और दो बार ।
    10. एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संगत तकनीक के साथ झिल्ली कल्पना (उदाहरण के लिए, एक luminol-व्युत्पंन chemiluminescence के साथ मशीन के बाद इमेजिंग द्वारा, अगर एक एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया गया था) ।
  2. इन विट्रो प्रयोग
    नोट: यह एक के लिए एक टेम्पलेट के रूप में वेक्टर का उपयोग करने का एक उदाहरण है इन विट्रो में आरएनए की प्रतिलेखनी आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए. EMSA पर अधिक जानकारी के लिए,9देखें ।
    1. इन विट्रो में एक T7 का उपयोग कर टेप करें इन विट्रो प्रतिलेखन किट (सामग्री की तालिका) और वैक्टर के रूप में 5 कदम से टेंपलेट्स ।
    2. एक ४.५% 7 एम यूरिया denaturing जेल पर पृष्ठ द्वारा अलग आरएनए टेप, और डायलिसिस ट्यूब (सामग्री की तालिका) के साथ इलेक्ट्रो रेफरेंस द्वारा जेल से सीधे आरएनए निकालने.
    3. लेबल आरएनए (जैसे, γ-३२पी-टी-4-polynucleotide कळेनासे (सामग्री की तालिका) का उपयोग एटीपी के साथ radiolabeling और कॉलम (सामग्री की तालिका) के साथ फिर से शुद्ध ।
      चेतावनी: रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करने से पहले, स्थानीय विकिरण सुरक्षा अधिकारी के साथ परामर्श करें ।
    4. एक 1x बाध्यकारी बफर में अलग प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन की बढ़ती सांद्रता के साथ लेबल-आरएनए मिश्रण (20 मिमी Tris, पीएच 8, १०० मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2, 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी)).
      नोट: प्रस्तुत परिणामों में (चित्रा 4), radiolabeled csgD mRNA के 2 एनएम 0 से 2 µ एम Hfq प्रोटीन (मोनोमर एकाग्रता) के एक ढाल के साथ मिलाया गया था ।
    5. एक गैर denaturing polyacrylamide जेल पर संकरण मिश्रण लोड हो रहा है और २०० V पर १.५ ज के लिए जेल चलाने से पहले संकरण करने के लिए प्रोटीन और आरएनए की अनुमति दें ।
    6. कदम 6.1.3 से लेबलिंग के साथ संगत तकनीक के साथ जेल कल्पना । (जैसे, phosphoimaging द्वारा यदि radiolabeling लागू किया गया था) ।
    7. एक इमेजिंग प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ स्थानांतरित कर दिया बैंड के सापेक्ष तीव्रता यों तो और एक ग्राफ और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके एक वक्र (sigmoidal) डेटा के लिए फिट । फिट वक्र के आधार पर, पृथक्करण स्थिरांक (Kd) मान सॉफ़्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से निर्धारित किए जा सकते हैं ।

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Representative Results

csgD के बाद transcriptional विनियमन के बारे में आरएनए बातचीत की जांच करने के लिए , एक डबल वेक्टर सेटअप चुना गया था: एक csgD mRNA और एक और छोटे गैर कोडिंग आरएनए, McaS व्यक्त करने के लिए व्यक्त करने के लिए । csgD pBAD33 में क्लोन किया गया था, जो प्लाज्मिड प्रतिरोध के साथ एक arabinose inducible मध्यम प्रतिलिपि क्लॉरॅंफेनिकोल है और McaS मिनी R1 pNDM220 में क्लोन किया गया था, जो एक isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible कम कॉपी प्लाज्मिड के साथ एम्पीसिलीन प्रतिरोध. जंगली प्रकार की csgD था पीसीआर 1a और 4a (4a एक झंडा अनुक्रम शामिल है) के लिए पीसीआर उत्पाद आइए उपज का उपयोग कर परिवर्धित, जबकि जंगली प्रकार McaS पीसीआर प्राइमर 1b और 4B का उपयोग कर पीसीआर उत्पाद आईबी उपज को परिलक्षित किया गया । 3-चरण पीसीआर रणनीति csgD और McaS के अनुमानित आधार युग्मन क्षेत्र में प्रतिस्थापन शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। दो पहले कदम में, पीसीआर उत्पादों आईआईए और IIIA प्राइमरों 1a + 2a, और 3 ए + 4a, क्रमशः का उपयोग संश्लेषित किया गया । तीसरे चरण में पीसीआर प्रोडक्ट IVA को पीसीआर प्रॉडक्ट्स आईआईए और IIIA के रूप में टेम्प्लेट और 1a और 4a को प्राइमरी (फिगर 2a) के रूप में इस्तेमाल कर संश्लेषित किया गया । इसी प्रकार, पूरक साइट-निर्देश उत्परिवर्तनों McaS में शुरू किए गए थे, प्राइमरों 1b, b बी, बी और 4B का उपयोग करने के लिए पीसीआर उत्पादों IIB, IIIB पहले दो चरणों में और तीसरे चरण में IVB (चित्रा 2a) उपज । pBAD33 और पीसीआर प्रोडक्ट्स आइए और IVA दोनों BamHI और PstI के साथ पच गए और पच गए आइए और IVA को पचा ligated में pBAD33 थे. परिणामस्वरूप निर्माण pBAD-csgDझंडा और pBAD-csgD63-66FLAG (स्थिति 63-66 पर transcriptional शुरू साइट के सापेक्ष रूपांतरित) नाम थे । pNDM220 और पीसीआर उत्पाद आईबी और IVB को AatII और BamHI से पच रहे थे और पच आईबी और IVB को पच ligated में pNDM220 थे । परिणामी निर्माण pNDM-mcaS और pNDM-mcaS42-45 (transcriptional प्रारंभ साइट के सापेक्ष स्थिति 42-45 पर रूपांतरित) नाम दिया गया ।

उत्परिवर्तनों के प्रभाव परख करने के लिए, ई. कोलाई pBAD-csgDझंडा या pBAD-csgD63- 66FLAG और pNDM220, pNDM-mcaS या pNDM-mcaS42-45 बंदरगाह M9 में बड़े हो गए थे न्यूनतम ०.२% ग्लिसरॉल के साथ पूरक के माध्यम से आयुध डिपो ४५० में से ०.४. pNDM से अभिव्यक्ति-वैक्टर तो 1 मिमी arabinose के अलावा pBAD-वैक्टर के 5 मिनट प्रेरण द्वारा पीछा IPTG के अलावा 10 मिनट के लिए प्रेरित किया गया था । इस बिंदु पर, नमूनों काटा गया और पश्चिमी दाग विश्लेषण काटा नमूनों के साथ प्रदर्शन किया गया । जंगली प्रकार McaS की अभिव्यक्ति जबकि जंगली प्रकार के CsgD का अनुवाद रोकता है, या तो CsgD या McaS में उत्परिवर्तनों का परिचय मनाया दमन समाप्त । तथापि, जब उत्परिवर्तनों दोनों CsgD में पूरक है और CsgD के McaS शोधों दमन बहाल है (चित्रा 3;2से संशोधित) । इस प्रकार, साइट-उत्परिवर्तन दृष्टिकोण निर्देशित परिकल्पना है कि इस क्षेत्र में McaS और csgD आधार जोड़े का समर्थन करता है ।

pBAD33 वेक्टर vivo प्रयोग में के लिए चुना गया था, और भी साइट शुरू करने के लिए उपयोग किया गया था-उत्परिवर्तन का निर्देशन करने के लिए Hfq-csgD mRNA इन विट्रो में बंधन की जांच । साइट-उत्परिवर्तनों का निर्देशन 2-कदम पीसीआर रणनीति बदल प्राथमिक और/या माध्यमिक संरचनाओं के साथ csgD उत्परिवर्ती RNAs उत्पंन जब प्रतिलिखित के साथ पेश किया गया । प्राइमरों 1 + 2c, 2d, 2E, 2F या 2 जी को बढ़ाना और csgD के 5 ' अंत में उत्परिवर्तनों परिचय इस्तेमाल किया गया । परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों (IIC, IID, आईआईई, IIF और IIG) के रूप में इस्तेमाल किया गया प्राइमर 3 के साथ टेंपलेट्स बढ़ाना और पूरे csgD डीएनए (चित्रा 2 बी) को उत्परिवर्तनों परिचय । परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों (IIIC, आईआईआईडी, IIIE, IIIF और IIIG) pBAD33 में क्लोन के रूप में ऊपर वर्णित किया गया । इन विट्रो टेप में T7 आरएनए के साथ लिखित थे-पोलीमरेज़: पहला, पीसीआर उत्पादों के साथ संश्लेषित किया गया प्राइमरी 5 ए, 5C, 5d, 5E, 5F या 4 + 6 5 के रूप में निर्माण वैक्टर का उपयोग कर टेंपलेट । परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों T7 आरएनए-पोलीमरेज़ के लिए टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया गया. इन विट्रो में लिखित csgD जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती RNAs शुद्ध, radiolabeled और शुद्ध Hfq की सांद्रता बढ़ाने के साथ मिश्रित थे । गैर denaturing जैल और visualized पर संकरण प्रतिक्रियाओं चला रहे थे । वृद्धि हुई कश्मीरडीउत्परिवर्ती alleles के मूल्यों को साबित करता है कि Hfq म्यूटेंट को कम कुशलता से बांधता है । इसके अलावा, Hfq csgD पर कई बाध्यकारी साइटों जो 3 जंगली प्रकार आरएनए के लिए मनाया पाली द्वारा दिखाया गया है । हालांकि, केवल 2 बाध्यकारी साइटों अलग उत्परिवर्ती RNAs के लिए मनाया जाता है (4चित्रा;4से संशोधित) । इस प्रकार, साइट-उत्परिवर्तन दृष्टिकोण निर्देशित प्राथमिक और/या csgD mRNA है कि Hfq की पूरी बाध्यकारी के लिए महत्वपूर्ण है की माध्यमिक संरचनाओं की पहचान करता है ।

एक साथ ले लिया, यह साइट प्रदर्शन करने के लिए संभव है-एक 2 या 3-बहाव परख के साथ संयोजन में कदम पीसीआर दृष्टिकोण mutagenesis के बाद transcriptional स्तर पर जीन विनियमन के बारे में जैविक निष्कर्ष बनाने के साथ ही प्रोटीन-आरएनए बातचीत .

चरण तापमान समय
प्रारंभिक विकार 98 ° c 2 min
विकार 98 ° c 10 एस
एनीलिंग 55 ° c 10 एस
एक्सटेंशन 72 ° c 15 एस
(30 चक्र)
अंतिम विस्तार 72 ° c 5 min
पकड़ 4 ° c

तालिका 1: पीसीआर प्रोग्राम

अभिकर्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया २० fmol प्रतिक्रिया १०० fmol प्रतिक्रिया
10x ligase बफर 2 µ l 2 µ l 2 µ l
पचा वेक्टर डीएनए 10 fmol 10 fmol 10 fmol
पचा गए पीसीआर प्रोडक्ट 0 fmol 20 fmol १०० fmol
एच२ओ से 19 µ l से 19 µ l से 19 µ l
Ligase 1 µ l 1 µ l 1 µ l

तालिका 2: बंधाव प्रतिक्रियाओं

प्राइमरी का नाम अनुक्रम के लिए इस्तेमाल किया-उत्परिवर्तनों
2-1a या 3-1a GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA
TGTAATCCATTAGT		 2-और 3- csgD पर दौर पीसीआर
2-३ ए या 3-4a CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC 2-और 3- csgD पर दौर पीसीआर
3-2a CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC 3-दौर csgD पर पीसीआर-विकल्प 4 nt
3 ए GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG 3-दौर csgD पर पीसीआर-विकल्प 4 nt
3-1b CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA
GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC		 McaS पर 3 राउंड पीसीआर
3-4B AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC McaS पर 3 राउंड पीसीआर
3-2 बी CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC 3-दौर McaS पर पीसीआर-विकल्प 4 nt
3-बी GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG 3-दौर McaS पर पीसीआर-विकल्प 4 nt
2-2c CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG 2-दौर csgD पर पीसीआर-11 nt हटाता है
2-2d CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG 2-दौर csgD पर पीसीआर-विकल्प 4 nt
2-2E CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG 2-दौर csgD पर पीसीआर-11 nt हटाता है
2-2F GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG 2-दौर csgD पर पीसीआर-9 nt और स्थानापन्नों 7 nt हटाता है
2-2g CTGCTGTGTGTAGTAATसीसीATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG 2-दौर csgD पर पीसीआर-9 nt और स्थानापन्नों 7 nt हटाता है
5A GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC T7 पीसीआर
5C GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG T7 पीसीआर
5D GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC T7 पीसीआर
5E GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC T7 पीसीआर
5f GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG T7 पीसीआर
5G GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG T7 पीसीआर
6 GTATGACCATGAATACTATGG T7 पीसीआर

तालिका 3: साइट के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों-निर्देशित mutagenesis और T7 टेम्पलेट संश्लेषण
बोल्ड: प्रतिबंध एंजाइम मांयता साइटें (BamHI, PstI और AatII)
रेखांकित: न्यूक्लियोटाइड उत्परिवर्तनों

Figure 1
चित्रा 1: साइट के लिए पीसीआर रणनीति-निर्देश mutagenesis । एक) तीन प्राइमरों 2-कदम पीसीआर दृष्टिकोण में उपयोग के लिए साइट परिचय उत्परिवर्तनों ब्याज की एक जीन को दिया जाता है । प्राइमरों 1 और 3 जीन (पीसीआर उत्पाद मैं) को प्रवर्धक, जबकि प्राइमर 2 विशिष्ट उत्परिवर्तनों का परिचय (*) । प्राइमर जोड़े 1 + 2 के लिए ब्याज की डीएनए के या तो अंत में एक छोटे टुकड़े को संश्लेषित पीसीआर उत्पाद द्वितीय (चरण 1) को परिवर्धित । परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पाद तो अस्तर 3 के साथ एक किताब के रूप में प्रयोग किया जाता है पीसीआर उत्पाद III के साथ संश्लेषित करने के लिए निर्देशित उत्परिवर्तन शामिल (चरण 2) । ख) चार प्राइमरों 3 कदम पीसीआर दृष्टिकोण में उपयोग किया जाता है के लिए साइट परिचय उत्परिवर्तनों ब्याज की एक जीन को निर्देश दिया । प्राइमरों 1 और 4 जीन (पीसीआर उत्पाद मैं), जबकि प्राइमरों 2 और 3 प्रवर्धित विशिष्ट उत्परिवर्तनों का परिचय (*) । प्राइमर जोड़े 1 + 2 और 3 + 4 पीसीआर के दो पहले कदम में उपयोग किया जाता है पीसीआर उत्पाद द्वितीय और तृतीय (चरण 1 & 2) संश्लेषित करने के लिए । तीसरे चरण में, पीसीआर उत्पाद द्वितीय और III के साथ टेंपलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है प्राइमर जोड़ी 1 + 4 साइट के साथ पीसीआर उत्पाद IV को निर्देशित उत्परिवर्तन शामिल (चरण 3) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: साइट से पीसीआर उत्पादों-निर्देश mutagenesis । पीसीआर पाठ में वर्णित के रूप में प्राइमरों और टेंपलेट्स के साथ प्रदर्शन किया गया । पीसीआर उत्पाद ethidium ब्रोमाइड (~ ०.५ µ g/एमएल) के साथ 1 µ जी डीएनए सीढ़ी मिश्रण (सामग्री की तालिका) के साथ एक 2% agarose जेल पर चला रहे थे । सही आकार बैंड एक लाल वर्ग के साथ चिह्नित कर रहे हैं । A) सबसे पीसीआर प्रतिक्रियाओं में सही आकार का केवल एक बैंड दिखाई देता है । हालांकि, पीसीआर रिएक्शन IVB में दो दिखने वाले बैंड्स हैं जिनमें से टॉप बैंड (सिर्फ ३०० बीपी से ऊपर) की लंबाई सही है । जैसी कि उम्मीद थी, पीसीआर प्रॉडक्ट्स की लम्बाई का योग II और IIIC की लंबाई के बराबर पीसीआर प्रॉडक्ट्स I और IV (A: csgD पीसीआर उत्पाद, बी: McaS पीसीआर उत्पाद, मैं: जंगली प्रकार csgD/McaS का उपयोग कर प्रवर्धित प्राइमर 1a/बी + 4a/बी, द्वितीय + III: मध्यवर्ती पीसीआर उत्पाद प्रवर्धित प्राइमरों का प्रयोग 1a/b + 2a/b और 3 ए/बी + 4a/बी, क्रमशः, चतुर्थ: रूपांतरित पीसीआर उत्पाद मध्यवर्ती पीसीआर उत्पादों II और III के साथ टेम्पलेट्स के रूप में ए. बी./ सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं में सही आकार का केवल एक बैंड दिखाई दे रहा है । इस मामले में, पीसीआर उत्पादों द्वितीय के लगभग सभी अणुओं पीसीआर प्रतिक्रियाओं iii के लिए जोड़ा पीसीआर उत्पाद iii संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया । केवल पीसीआर IIIE के लिए है पीसीआर प्रोडक्ट आईआईई अभी भी दृश्यमान (IA: जंगली प्रकार csgD पीसीआर उत्पाद प्रवर्धित प्राइमर 1a + 3 ए का उपयोग, IIC-जी: मध्यवर्ती पीसीआर उत्पादों प्राइमर 1a + 2c का उपयोग कर परिवर्धित-जी, IIIC-जी: रूपांतरित पीसीआर उत्पादों पीसीआर उत्पादों के साथ प्राइमर 3 ए का उपयोग कर परिवर्धित और IIC-जी के रूप में टेंपलेट्स) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: vivo में प्रयोग के साथ साइट-निर्देशित csgD और McaS म्यूटेंट. संकेत वैक्टर के पश्चिमी दाग विश्लेषण बंदरगाह । उपभेदों घातीय चरण के लिए बड़े हो गए थे और 1 मिमी IPTG (McaS) 1 मिमी arabinose (csgD) के साथ 5 मिनट प्रेरण द्वारा पीछा के साथ 10 मिनट के लिए प्रेरित किया । α-फ्लैग एंटीबॉडी को निशाना बनाने के लिए किया गया फ्लैग-टैग CsgD और α-GroEL एंटीबॉडी गृह व्यवस्था प्रोटीन GroEL (पतला १०,००० और ५०,००० बार, क्रमशः) को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । माउस और खरगोश एचआरपी-संयुग्मित एंटीबॉडी माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया (२,००० बार पतला) । यह आंकड़ा2से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: इन विट्रो में साइट के साथ प्रयोग-निर्देशित csgD म्यूटेंट. EMSA इन विट्रो में लिखित csgD वाइल्ड टाइप (WT) और उत्परिवर्ती (पैनल सी-जी) RNAs के साथ Hfq बाइंडिंग के संबंध में । csgD alleles (WT और उत्परिवर्ती सी-जी) को radiolabeled किया गया और 0, ०.२५, ०.५, 1 या 2 µ m monomeric Hfq के साथ मिलाया गया । नॉन-संकरण denaturing जैल पर polyacrylamide प्रतिक्रियाओं को चलाया गया । स्थानांतरित किए गए बैंड के सापेक्ष तीव्रता quantified और एक अवग्रह वक्र डेटा के लिए फिट किया गया था । पृथक्करण स्थिरांक (Kd) मान SigmaPlot का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे । यह आंकड़ा4से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

साइट निर्देशित mutagenesis विभिंन अनुप्रयोगों की एक व्यापक सरणी है, और यहां, एक vivo में और एक विट्रो प्रयोग में से प्रतिनिधि परिणाम कैसे जैविक तकनीक का उपयोग कर निष्कर्ष बनाने के लिए के उदाहरण के रूप में शामिल थे । साइट निर्देशित mutagenesis लंबे समय तक आरएनए बातचीत अध्ययन के लिए स्वर्ण मानक किया गया है । तकनीक की ताकत बहाव परख और प्रयोगों के साथ प्रासंगिक उत्परिवर्तनों शुरू करने के संयोजन में निहित है (जैसे, पश्चिमी दाग या EMSA) विशिष्ट डीएनए साइटों और जीन उत्पादों के कार्यों में उनके महत्व के बारे में निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए सवाल. जब साइट करना तय-mutagenesis निर्देशित, प्राइमरों के डिजाइन ध्यान से तकनीक से सबसे अधिक लाभ की योजना बनाई जानी चाहिए (उदाहरण के लिए जो साइटों को रूपांतरित करना); हो सही रखता है और प्रतिबंध साइटों को शामिल यकीन है और ध्यान भजन किताब/

इस प्रोटोकॉल में वर्णित वास्तविक mutagenesis पीसीआर पर निर्भर करता है । प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है इसलिए इस के लिए शर्तें । वहां पीसीआर के अनुकूलन के कई तरीके हैं, 2 मिलीग्राम की ढाल सहित+ सांद्रता, DMSO एकाग्रता और एनीलिंग कदम के तापमान । अधिक जानकारी के लिए,3देखें । पीसीआर ही प्रतिक्रिया के अनुकूलन के अलावा, दो बातें यकीन है कि जब साइट कर रही है-mutagenesis निर्देश: उच्च गुणवत्ता टेंपलेट्स और ध्यान से डिजाइन प्राइमर बनाने लायक हैं ।

पीसीआर के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले टेम्पलेट अक्सर एक असफल और सफल पीसीआर के बीच फर्क पड़ता है । जबकि डीएनए टेम्पलेट, शुद्ध डीएनए (जीनोमिक-, वेक्टर-या पीसीआर-डीएनए) प्रदान करने के लिए एक सेल lysate का उपयोग करना संभव है हमेशा बेहतर है । इसके अलावा, जब यह टेंपलेट की राशि की बात आती है, अक्सर कम अधिक है; खासकर 3-चरणीय पीसीआर (step 4.2.5) के अंतिम चरण में । उदाहरण के लिए, यदि आवश्यक हो तो इष्टतम खोजने के लिए टेंपलेट की एक 10x कमजोर पड़ने की श्रृंखला की कोशिश करो ।

इष्टतम प्राइमर डिजाइन ब्याज और पोलीमरेज़ के डीएनए की विशेषताओं पर निर्भर करता है । जब भी संभव हो, हमेशा के अनुसार प्राइमर डिजाइन की कोशिश करो । हालांकि, कई मामलों में प्राइमर एक विशिष्ट साइट पर डिजाइन किया जाना चाहिए और इसलिए विशिष्ट मानदंडों के अनुसार डिजाइन नहीं किया जा सकता है । उन मामलों में, इसके बजाय पीसीआर शर्तों के अधिक अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है (पीसीआर6पर ऊपर देखें और प्रोटोकॉल), लेकिन सही शर्तों के साथ भी मुश्किल पीसीआर आमतौर पर सफल रहे हैं ।

साइट-निर्देशित mutagenesis के लिए कई वैकल्पिक तरीके उपलब्ध हैं, जैसे Kunkel की विधि10, पूरे प्लाज्मिड mutagenesis11, कैसेट mutagenesis12, डी नोवो जीन संश्लेषण और CRISPR13,14।

है Kunkel विधि और पूरे प्लाज्मिड mutagenesis पहले से ही एक प्लाज्मिड में किया जा रहा है ब्याज के डीएनए पर निर्भर करता है (वेक्टर) और एक एकल किनारा या रूपांतरित डीएनए के दोहरे किनारा, क्रमशः संश्लेषित करने के लिए प्राइमरों का उपयोग. दोनों तकनीकों में, पूरे प्लाज्मिड संश्लेषित किया जा रहा है और परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया, जबकि 2 या 3-कदम पीसीआर केवल ब्याज की डीएनए टुकड़ा संश्लेषित करता है । 2-या 3-कदम पीसीआर का नुकसान यह है कि ब्याज के डीएनए में दो बार संश्लेषित किया जाना चाहिए, उसमें उत्परिवर्तनों का खतरा बढ़ रहा है । दूसरी ओर, प्लाज्मिड को संश्लेषित करने की नहीं है, इस प्रकार उत्परिवर्तनों के जोखिम को कम करने के बजाय यहां । इसके अलावा, 2-या 3-कदम पीसीआर, एक जंगली प्रकार संस्करण का उपयोग कर एक वेक्टर में पहले से क्लोन की जरूरत नहीं है, इस प्रकार कई दिनों से क्लोनिंग समय कम ।

कैसेट mutagenesis को प्राइमरों या polymerases के इस्तेमाल पर भरोसा नहीं है. इसके बजाय, एक छोटे डीएनए टुकड़ा डी नोवो संश्लेषित और प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग के साथ ब्याज के डीएनए में शामिल है । इस विधि, तथापि, लक्षित साइट है, जो हमेशा मौजूद नहीं है के पास उपयुक्त प्रतिबंध साइटों की उपस्थिति पर निर्भर करता है । इस दृष्टिकोण भी जंगली प्रकार संस्करण की आवश्यकता है वेक्टर में पहले से क्लोन, 2-या 3-कदम पीसीआर विधि की तुलना में क्लोनिंग समय में वृद्धि ।

डी नोवो जीन संश्लेषण की कम लागत के साथ (बड़े डीएनए टुकड़े), यह तेजी से करने के लिए वांछित अनुक्रम वाणिज्यिक आदेश द्वारा उत्परिवर्तनों परिचय सस्ती होता जा रहा है । इस विधि है, तथापि, अभी भी महंगा उल्लेख अंय तरीकों की तुलना में । डी नोवो संश्लेषण लेखन के समय लगभग यहां प्रस्तुत विधि से 3 गुना अधिक महंगा है ।

एक और उभरते विकल्प जीनोम परिवर्तन के लिए उच्च प्रत्याशित CRISPR विधि है । इस विधि eukaryotic कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया अन्य तकनीकों की तुलना में अत्यधिक कुशल और अनुकूलनीय है. हालांकि, रिश्तेदार आसानी और बैक्टीरिया के रूप में सरल जीव में क्लोनिंग के लिए कई उपलब्ध तकनीकों के साथ, CRISPR शायद ही कभी पारंपरिक क्लोनिंग की तुलना में अधिक उपयुक्त है । इस प्रकार, CRISPR की उपयोगिता अधिकांशतः अध्ययन किए जाने वाले जीव पर निर्भर करती है.

जब साइट करने के लिए चुनते-निर्देशित mutagenesis, यह ध्यान से डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है; दोनों के साथ बहाव अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से वास्तविक तकनीक का संबंध था । 2 और 3-चरण पीसीआर विधि यहां वर्णित लगभग किसी भी उत्परिवर्तन अध्ययन के लिए लागू है और इसके कम लागत के साथ यह किसी भी प्रयोगशाला बजट के लिए उपयुक्त है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक दक्षिणी डेनमार्क ओपन एक्सेस पॉलिसी अनुदान के विश्वविद्यालय को धंयवाद देना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GroEL antibody produced in rabbit Merck G6532 Primary antibody
Azure c200 Azure NA Gel imaging workstation
Custom DNA oligo Merck VC00021
DeNovix DS-11 DeNovix NA Spectrophotometer for nucleic acid measurements
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Scientific R0611
Ethidium bromide solution 1 % Carl Roth 2218.1
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix Fermentas SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi Gerard Biotech TO12 Dialysis tubes for electro elution
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell Bio-Rad 1704406 Horizontal electrophoresis system
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Merck F3165 Primary antibody
Mouse Immunoglobulins Dako Cytomation P0447 HRP conjucated secondary antibody
NucleoSpin miRNA Macherey Nagel 740971 RNA purification
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Scientific NP0323BOX Bis-Tris gels for protein separation
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S DNA polymerase
PowerPac HC High-Current Power Supply Bio-Rad 1645052
Rabbit Immunoglobulins Dako Cytomation P0448 HRP conjucated secondary antibody
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
SigmaPlot Systat Software Inc NA Graph and data analysis software tool
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096 PCR machine
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Ligase
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201S
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) Thermo Scientific B49

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References

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जैव रसायन अंक १४४ Mutagenesis Mutagenic विश्लेषण स्थल-निर्देशन EMSA पश्चिमी दाग आरएनए-आरएनए इंटरैक्शन आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन oligonucleotide-निर्देशित Mutagenesis डुअल प्लाज्मिड
साइट-निर्देशित Mutagenesis इन विट्रो में और Vivo प्रयोगों उदाहरण में आरएनए बातचीत के साथ <em>ई कोलाई</em>
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Andreassen, P. R., Pettersen, J. S., … More

Andreassen, P. R., Pettersen, J. S., Jørgensen, M. Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (144), e58996, doi:10.3791/58996 (2019).

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