Summary
サイト指示された突然変異誘発は、デオキシリボ核酸 (DNA) の特定の突然変異を導入する技術です。このプロトコルは、2 ステップでサイト指示された突然変異誘発を行う方法をについて説明し、3 ステップのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ベースのアプローチは、興味の DNA のフラグメントに適用可能であります。
Abstract
サイト指示された突然変異誘発は小さな非コーディング リボ核酸 (スルナ) 分子と対象のメッセンジャー Rna (Mrna) の相互作用を調査するため DNA の特定の突然変異を導入するための技術です。さらに、サイト指示された突然変異誘発は RNA 特定の蛋白質の結合サイトにマップされます。突然変異の 2 ステップ、3 ステップ PCR によって基づく概要を説明しています。アプローチはすべての蛋白質と核酸と RNA 相互作用の研究に関連します。一言で言えば、テクニックが必要な遺伝と突然変異を PCR の製品を合成 PCR の 2 または 3 の手順をプライマーの設計に依存します。PCR の製品は、クローニングのため使用されます。ここでは、両方の 2 と 3 のステップ アプローチ、スルナ、岩国、mRNA、 csgD RNA、RNA 蛋白質の相互作用を調査するために突然変異を導入するとサイト指示された突然変異誘発を実行する方法をについて説明します。RNA の相互を調査するこの手法を適用します。しかし、技術は、すべての突然変異誘発の研究 (DNA 蛋白質の相互作用、アミノ酸置換/削除/追加など) に適用されます。非天然基地を除いて突然変異のあらゆる種類を導入することが可能だが、テクニックは下流のアプリケーション (例えば、クローニングとさらに PCR のテンプレート) の PCR の製品を使用できる場合のみ。
Introduction
DNA は、セルのすべての構造は、DNA のシーケンスにエンコードから、一般に、生きている細胞の設計図と呼ばれます。正確なレプリケーションおよび DNA 修復機構は、唯一の非常に低率の突然変異が発生し、コード化された遺伝子の正しい機能を維持するために不可欠であるを確認します。DNA シーケンスの変更は、RNA (塩基対の相補性と二次構造変化) やタンパク質 (アミノ酸、DNA (転写因子と制限酵素によって認識)、始まるさまざまなレベルで連続的な機能に影響を及ぼす酸の置換、削除、追加またはフレーム シフト)。多くの突然変異は遺伝子の機能を大きく影響しません、DNA の変異の巨大な影響があります。したがって、サイト指示された突然変異誘発は、すべてのレベルで特定の DNA のサイトの重要性を研究するための貴重なツールです。
このプロトコルでは、特定の突然変異を導入するために使用対象となる突然変異誘発方法について説明します。プロトコルは、2 つの PCR 戦略: 2 ステップ、3 ステップ PCR。2 ステップ PCR は望ましい突然変異が 5' 端または興味の DNA の 3' 末端に近い場合は該当する (< 端から 200 塩基対 (bp)) と 3 ステップ PCR はすべての場合に適用されます。
2 ステップ PCR のアプローチで 3 プライマーを (プライマー 1 と 3、前方および逆引き、それぞれ)、興味の DNA を増幅するプライマーの 1 つのセットを設計、単一のプライマーは突然変異を組み込む設計されています。3' 端に近い場合は突然変異変異を 5' 末端と前方方向に近い場合 (プライマー 2) プライマーの導入変異が逆向きに必要です。最初の PCR のステップでは、プライマー 1 + 2 または 2 + 3 はそれぞれ 5' 末端もしくは 3' 末端、近くの小さな断片を増幅します。結果として得られる PCR の製品はプライマー 1 または 3、(図 1 a) の興味の DNA の変異を PCR の製品の結果を 2 つの手順でプライマーとして使用されます。
3 ステップ PCR のプライマーの 1 つのセットは (プライマー 1 と 4 は、前方および逆引き、それぞれ) 興味の DNA を増幅するため設計されています 4 プライマーが設計されています、相補性を重複で特定の突然変異を組み込むように、プライマーの 1 つのセット(プライマー 2 と 3 は逆し、転送、それぞれ)。手順 1 と 2、1 + 2、3 + 4 のプライマーが 5' と 3' 端を増幅します。ステップ 3 で結果として得られる PCR の製品からステップ 1 と 2 つのテンプレートとして使用し 1 + 4 のプライマーで増幅します。したがって、結果として得られる PCR の製品は望ましい突然変異 (図 1 b) と興味の DNA です。
変異する DNA は、任意のダウン ストリーム アプリケーションの使用できますが、このプロトコルはクローニング ベクトルに DNA を再結合する方法について説明します。クローニングの使用クローン作成の容易さなどいくつかの利点がありますとベクターの機能に応じて実験用途。この機能は RNA 相互作用研究のためよく使用されます。RNA 相互作用研究のための別のテクニックは別 RNA1,2または蛋白質3,の4との複合体の RNA の構造を探るします。ただし、構造プローブのみ実行される体外サイト指示された突然変異誘発と後続のクローニングが生体内での相互作用研究の許可。
サイト指示された突然変異誘発は、ここで示す RNA 相互作用研究のため広く使用されています。ただし、キーメソッドについて 2- または 3 ステップ PCR は DNA のどの部分に適用され、従って RNA 相互作用の研究だけでなく限られました。
技術とその用途を例示、 csgD、 エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) の mRNA の転写後調節に重要な領域の評価を使用します。エシェリヒア属大腸菌、csgDで狙われてる小さな非コーディングの RNA、岩国、Hfq、CsgD2,4、5の発現を抑制する蛋白質と協力。技術を使用して、 csgDと、岩国基地ペアリング地域とcsgDの Hfq 結合部位に変異を導入します。得られた DNA は、その後の実験に適したベクターにクローンを作成します。技術の下流のアプリケーションには、生体内および生体外での実験が含まれます。図では、例 1 の西部のしみのアッセイを用いた生体内の特徴は、例 2 は電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA) を使用して生体外の特徴です。両方のケースでそれは図解方法サイト指示された突然変異誘発は興味の遺伝子の生物学的結論を出すために他の技術との組み合わせで使用できますです。
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Protocol
1. ベクトルの選択
- 下流の実験を実行するベクトルを選択します。任意のベクトルは、この 2 と 3 ステップ PCR 法に適用されます。
- ベクトルの選択に基づき、適切な制限の酵素のクローニングのためを選択します。
2. プライマー設計は、サイトを指示しました。
- 2 段または 3 段のいずれかの PCR 戦略の間に決定 (2 ステップは、突然変異だけ < 200 興味の DNA の両端から bp)。2 ステップ PCR のステップ 2.2 に移動し、3 ステップ PCR ステップ 2.3 を参照してください。
- 2 ステップ PCR のためのプライマーを設計します。
- 軒の出を 1 と 3 と 5' 興味の DNA を増幅するプライマーの設計には、選択したベクトルにクローンを作成する必要に関連する制限の認識サイトが続く 4 ヌクレオチド (例えば、ATAT や agct 2008 年 7) が含まれています。
- 目的のサイトで遺伝を紹介し、フランクの両側に 10-15 相補的なヌクレオチドと突然変異 2 プライマーを設計します。プライマーの 5' 端に突然変異が導入された場合は逆を行うまたは 3' 端に突然変異が導入された場合の転送。
- 3 ステップ PCR のためのプライマーを設計します。
- 軒の出を 1 と 4 と 5' 興味の DNA を増幅するプライマーの設計には、選択したベクトルにクローンを作成する必要に関連する制限の認識サイトが続く 4 ヌクレオチド (例えば、ATAT や agct 2008 年 7) が含まれています。
- 2、目的サイトで遺伝を紹介し、両側に 10-15 相補的なヌクレオチドによる突然変異の側面 3 プライマーを設計します。プライマー 2 と 3 が逆に補完。
3. 野生型 DNA のクローニングのための pcr
注: PCR の詳細については、6を参照してください。
- 1 + 2 (2 ステップ PCR) または 1 + 4 (3 ステップ PCR) のプライマーを用いて PCR6を実行し、表 1に PCR プログラム PCR 製品 I. 使用を入手する野生型 DNA をテンプレートとして使用します。
- Agarose のゲルの電気泳動で PCR を検証します。
- 1 x トリス酢酸エチレンジアミン酸 (EDTA) (妙) バッファーの 100 mL あたり寒天 2 g を追加することによって、agarose のゲル溶液 (2%) を作る。電子レンジで沸騰させることによって、アガロースを溶解します。臭化エチジウム DNA 染色染料を追加 (の最終的な集中に 〜 0.5 μ G/ml) に agarose のゲルの可視化のためのソリューション。
- Agarose のゲルをキャスト、電気泳動部に配置し、負荷 (DNA 読み込み染料と混合) PCR サンプルとサイズがわかっている DNA の梯子。バンド適切に区切られ、紫外線 (UV) テーブルでまたはイメージング システム ゲルのバンドを可視化するまで、75 W、45 分間またはサンプルを実行します。
- ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品の浄化し、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の濃度を測定します。
- 使用されるステップ 5 まで (トリス EDTA (TE) バッファー-長期ストレージ) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O-短期記憶) で浄化された DNA を格納します。
4 PCR、DNA のサイト指示された突然変異を導入するには
- 2 ステップ PCR のための PCR (3 ステップ PCR のステップ 4.2 を参照)
- 突然変異は、5' 端または 2 + 3 の突然変異が、3' 場合は、終了し、野生型 DNA の PCR の製品 II を取得するテンプレートとして使用する場合、1 + 2 のプライマーを用いて PCR6を実行 (PCR プログラムのテーブル 1を参照)。
- 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロース電気泳動で PCR を検証します。
- ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品の浄化し、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の濃度を測定します。
- ストアは、-20 ° c (TE バッファー) でまたは (dH2O) の 4 ° C で使用されるステップ 5 まで DNA を精製しました。
- PCR6突然変異が、5' 末端もしくはプライマー 1 突然変異 3' 末端にあり、野生のタイプ III の PCR の製品を取得するテンプレートとして DNA を使用して場合 II プライマー 3 と一緒にプライマーとして PCR の製品を使用してを実行 (PCR プログラムのテーブル 1を参照)。
- 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロース電気泳動で PCR を検証します。
- ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品の浄化し、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の濃度を測定します。
- 精製した DNA をステップ 5 まで (TE バッファー) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O) の店。
- 3 ステップ PCR のための PCR
- 別の反応で 1 + 2、3 + 4 のプライマーを用いて PCR6を実行し、野生型 DNA を PCR の製品を取得するテンプレートとして使用する II および III (PCR プログラムのテーブル 1を参照)。
- 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロース電気泳動で Pcr を検証します。
- ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品の浄化し、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の濃度を測定します。
- ストアは、(TE バッファー) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O) の DNA を精製しました。
- 1 + 4 のプライマーを用いて PCR6を実行し、(同じ反応) でテンプレートとして両方の PCR の製品は II および III の 2-5 ng を使用して PCR 製品 IV (PCR プログラムのテーブル 1を参照)。
- 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロース電気泳動で PCR を検証します。
注: 珍しくない (時々 減らせる少ないテンプレートを使用して) いくつかの不正なバンドを取得します。ただし、不適切な PCR の製品は正しく大きさで分類されたバンドはゲル抽出と場合無視できます。 - 正しい場合は、ゲル抽出キット (材料表) の PCR の製品を浄化し、分光光度計 (材料表) で浄化された DNA の濃度を測定します。
- 精製した DNA をステップ 5 まで (TE バッファー) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O) の店。
5. 野生型と選択したベクターに DNA の突然変異のバージョンの再結合
注: 次の手順の詳細については、7を参照してください。
- ダイジェスト PCR 産物を精製は、I と III (2 ステップ PCR) から IV (3 ステップ PCR) から関連する制限酵素の使用および/または。
- 各制限の酵素、30-60 分の 37 ° C で PCR の製品のダイジェスト 200 ng の 1 μ L 消化バッファー x 1 の 20 μ L で。
- ゲル抽出キット (資材表) を用いたゲル抽出による消化液の PCR の製品を浄化する、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の DNA 濃度の測定、-20 ° c (TE バッファー) でまたは (dH2 で 4 ° C 保存O) ステップ 5.6 に使用されるまで。
- 精製されたベクター関連の制限の酵素と消化し、ベクトル再イベントを減少するアルカリホスファターゼを扱います。アルカリホスファターゼと PCR の製品を扱うことはありません。
- 消化バッファーを各制限酵素の 1 μ、1 μ L アルカリホスファターゼ、30-60 分の 37 ° C でベクターのダイジェスト 1,000 ng の x 1 の 30 μ L で。
- 廃棄物の DNA (ノーカット ベクトルとカットされた DNA など) から別の消化ベクトル 3.2.1、3.2.2 ステップのようにアガロースゲル電気泳動を使用して。
- ゲル抽出キット (資材表) を用いたゲル抽出によって消化されたベクトルを浄化、分光光度計 (材料表) の浄化された DNA の DNA 濃度の測定 (TE バッファー) に-20 ° c または 4 ° C (dH2O) で保存までステップ 5.6 を使用しました。
- 表 2に指定された反応と消化のベクトルに消化液の PCR の製品を縛る。
- 2 h または 16 ° C で一晩室温でインキュベートします。
- ライゲーション反応を受信者ひずみ (例えば、エシェリヒア属大腸菌K12) を変換します。
- 外径600株を成長 = 0.3-0.5 と転送 1 mL 文化リガーゼの反応として多くの 1.5 mL チューブに。
- 3,500 x gで 5 分で回転し、上澄みを廃棄します。
- 200 μ L の変換バッファー (0.1 グラム/mL のポリエチレング リコール 3350、5% ジメチル硫酸塩および 20 mM MgCl2ホストゲノム スープ (LB) の 10 mL) で細胞を再懸濁します。
- Ligation の反作用を追加し、30 分間氷の上にチューブを置きます。
- 42 ° c. で 2 分間熱衝撃を与える
- 1.5 mL チューブにポンドの 1 つの mL を追加し、37 ° C で少なくとも 45 分の抗生物質耐性の形質発現を許可
- 3,500 x gで 5 分で細胞をスピン、培養上清 1 mL を破棄し、残りの上清に細胞を再懸濁します。
- 適切な抗生物質で板の細胞をプレートし、37 ° C で一晩インキュベート
- 形質転換体 (例えば、ベクトルと挿入特定のプライマーを用いた PCR) によって DNA 挿入の統合の成功とベクトルをかくまっているを識別します。
- サンガーによる DNA のシーケンスの検証シーケンス。
注意: は、5.9 のステップのシーケンスの同じプライマーを使用しないでください。
6. 生体外でまたは生体内で実験のため構築されたベクトルを使用して
- 生体内で実験
注: これは野生型・変異 RNA 転写後調節の特徴を表現するベクトルの使用例です。西部にしみが付くことの詳細は、「8」を参照してください。- 適切な培地で構築されたベクトルを持つ大腸菌K12 株を成長し、必要な場合は、式を誘導します。サンプルを遠心分離によって収穫します。
- SDS のサンプルバッファー x 1 の細胞ペレットを溶解することによりナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 用のサンプルを準備 (62.5 mM トリス塩酸 pH 6.8, 2.5% SDS 0.002% ブロモフェノールの青、5% β-メルカプトエタノール、10% グリセロール) と 5 95 ° C で沸騰分。
注: それはゲルをキャストまたは市販プレキャスト ゲルを使用することが可能です。後者の結果は、図 3 (材料表) の提示で使用されました。 - 個別の井戸 (蛋白質の梯子を含む)、各サンプルの 107ロードセルし、タンパク質分離 (約 45 分) まで 200 V でゲルを実行します。
- 80 でセミドライ転送によるセルロース膜にタンパク質のしみ 1 h mA。
- 膜蛋白質 (例えば、5%-粉ミルク 1 x Tween 20 含有トリス緩衝生理食塩水 (TTBS) バッファーに溶解) の混合物をブロックします。
- 一次抗体 (1 x TTBS バッファーに溶解) (例えば、GFP、旗、または HIS タグ付きタンパク質) の興味の蛋白質をターゲットし、穏やかな攪拌で 1 時間インキュベートを追加します。
- 非連結の抗体を削除する 10 分の 1 x TTBS で膜を洗浄します。2 回以上を繰り返し。
- 一次抗体を対象とする (1 x TTBS バッファーに溶解) 二次抗体を追加し、検出を可能にする (例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)-標識二次抗体。穏やかな攪拌で 1 時間インキュベートします。
- 非連結の抗体を削除する 10 分の 1 x TTBS の膜を洗浄します。2 回以上を繰り返し。
- (例えば、HRP 標識二次抗体を使用していた場合ルミノール由来の化学発光イメージング培養後) によって二次抗体と互換性のある技術と膜を視覚化します。
- In vitro 実験
注: これは RNA 蛋白質の相互作用を特徴付けるための RNA 生体外のトランスクリプションのためのテンプレートとしてベクトルを使用しての例です。EMSA の詳細は、「9」を参照してください。- テンプレートとして試験管内転写キット (材料表) のステップ 5 からベクトル T7 を使用して生体外のトラン スクリプトを確認します。
- 7 M の 4.5% 尿素変性ゲルのページによって RNA 転写産物を分離し、ゲルから直接透析チューブ (材料表) 電気溶出によって RNA を抽出します。
- RNA のラベル (例えば、γ-32P ATP とカイネティックス T4 ポリヌクレオチド キナーゼ (資材表) を使用して、列 (テーブルの材料) で再び浄化します。
注意: 放射性物質を扱う前に局所放射線安全担当者とご相談ください。 - 結合バッファー (トリス、pH 8、100 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mM ジチオトレイトール (DTT) 20 mM) x 1 の別の反応中のタンパク質の濃度の増加と標識 RNA をミックスします。
注: 結果が発表される (図 4)、2 で 0 に 2 μ M Hfq 蛋白質 (モノマー濃度) のグラデーションと mRNA が混在した標識の csgD の nM。 - タンパク質と RNA 非変化のポリアクリルアミドゲルの交配の組合せをロードする前に交配させるし、200 V で 1.5 h のためのゲルを実行するを許可します。
- 6.1.3 のステップからラベリングと互換性のある手法でゲルを視覚化します。(例えば、によって phosphoimaging カイネティックスを適用した場合)。
- イメージング処理プログラムでシフトのバンドの相対強度を定量化し、グラフを使用してデータに曲線 (字) およびデータ解析ソフトウェア (材料表) に適合。近似曲線に基づき、解離定数 (Kd) はソフトウェアで自動的に決定されることができます。
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Representative Results
CsgD、二重ベクトル セットアップが選ばれたの転写後調節に関する RNA 相互作用を調査する: csgDを表現する 1 つ mRNA、別の小さな非コーディングの RNA、岩国を表現します。csgDはクロラムフェニ コール耐性とアラビノース誘導媒体コピーのプラスミッドである pBAD33 に複製され、岩国はイソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 誘導低コピー プラスミドであるミニの R1 pNDM220 に複製されたとアンピシリン抵抗。野生型csgDは PCR によって増幅されるプライマー 1 a と 4 a を使用して (4 a にはフラグ シーケンスが含まれています) 野生型岩国は PCR によって増幅される PCR 製品 IB を行うプライマー 1 b と 4 b を使用して PCR 製品 IA を生成します。3 ステップ PCR 戦略を用いてcsgDと岩国.の予測ベース ペアリング領域置換を導入2 つの最初の手順で IIA と IIIA の PCR の製品はプライマー 1 a +、2 a と 3 a 4 a をそれぞれ使用して合成しました。3 番目のステップで IVA の PCR の製品はプライマー (図 2 a) として 4 a と 1 a テンプレートとして IIA と IIIA の PCR の製品を使用して合成しました。同様に、補完サイト指示された突然変異は、PCR の製品 IIB、最初の 2 つの手順で iiib 期と IVB (図 2 a) の 3 番目のステップで行うプライマー 1 b、2 b、3 b、4 b を使用して岩国に導入されました。pBAD33 と IA とイヴァの PCR の製品が病原と PstI 消化され、消化の IA および IVA 消化 pBAD33 に結紮しました。結果として得られる構造は、pBAD csgDフラグと pBAD csgD63 66FLAG (転写開始部位を基準位置 63 66 に変異) にちなんで名付けられました。pNDM220 と IB と IVB の PCR の製品が AatII と病原消化され、消化の IB と IVB 消化 pNDM220 に結紮しました。結果として得られる構造は、pNDM 岩国と pNDM 岩国42 45 (転写開始部位を基準位置 42 45 に変異) にちなんで名付けられました。
OD 0.2% グリセロールを添加した M9 最小媒体で栽培されたpBAD csgDフラグまたは pBAD csgD63 66FLAG pNDM220、pNDM 岩国または pNDM 岩国42 45をかくまっている大腸菌の突然変異の効果を分析するには450 0.4。PNDM ベクトル式は、1 mM アラビノース添加による 1 mM 5 分 pBAD ベクトルの誘導に続いて IPTG の添加により 10 分の誘導されました。この時点で、サンプルを採取し、収穫されたサンプルと西部のしみの分析を行った。野生型岩国の式には、野生型 CsgD の翻訳が防止されます、CsgD または McaS で突然変異の導入は観察された抑圧を軽減します。しかし、CsgD の CsgD と岩国の並進運動弾圧の突然変異を補完するときは復元 (図 3;2から変更)。したがって、サイト指示された突然変異方法仮説に、岩国とcsgD塩基対でこの地域をサポートしています。
PBAD33 ベクトル生体内で実験のために選ばれ、も、csgD を Hfq バインドを調査するサイト指示された突然変異を導入するために使用された mRNA の in vitro。サイト指示された突然変異、 csgD変異株 Rna 転写されるとき変更のプライマリまたはセカンダリ構造を生成する 2 ステップ PCR 戦略導入されました。プライマー 1 + 2 C、2 D、2 e、2 階または 2 G 増幅し、5' 端に変異を導入するに使用されたcsgD.結果として得られる PCR の製品 (IIC、IID、IIE、IIF、IIG) は増幅し、全体のcsgD DNA (図 2 b) に突然変異を導入するプライマー 3 のテンプレートとして使用されました。結果として得られる PCR の製品 (IIIC、iiid 戦車砲塔、IIIE、IIIF、IIIG) は、前述のよう pBAD33 に複製しました。In vitro における成績証明書 T7 RNA ポリメラーゼが転写された: 最初に、PCR の製品はテンプレートとして構築されたベクトルを使用してプライマー 5 a、5 C、5 D、5 e、5 階または 5 + 6 で合成するしました。結果として得られる PCR の製品は、T7 RNA ポリメラーゼのためのテンプレートとして使用されました。In vitro 転写csgD野生型および変異 Rna 精製 Hfq の精製、標識および混合の濃度を上げるだった。ハイブリダイゼーション反応は、非変性ゲル上で実行され、可視化します。増加 Kd-突然変異体の対立遺伝子の値 Hfq は、変異体をより効率的にバインドされていることを証明します。さらに、Hfq は、野生型 RNA の 3 つのシフトによって示されているcsgDのいくつかの結合サイトを持っています。異なる変異 Rna のみ 2 の結合部位を観察するただし、(図 4の4から変更)。したがって、サイト指示された突然変異方法識別csgDのプライマリまたはセカンダリの構造が Hfq の完全な結合に重要な mRNA。
一緒に取られて、それは蛋白質と核酸の相互作用と同様に、転写レベルでの遺伝子発現制御に関する生物学的結論を出すために下流の試金との組み合わせで 2 または 3 ステップ PCR によるサイト指示された突然変異誘発を行うことが可能.
| ステップ | 温度 | 時間 |
| 初期変性 | 98 ° C | 2 分 |
| 変性 | 98 ° C | 10 s |
| アニール | 55 ° C | 10 s |
| 拡張機能 | 72 ° C | 15 s |
| (30 サイクル) | ||
| 最終的な拡張 | 72 ° C | 5 分 |
| ホールド | 4 ° C |
表 1: PCR プログラム
| 試薬 | 制御反応 | 20 fmol 反応 | 100 fmol 反応 |
| リガーゼ バッファー x 10 | 2 Μ L | 2 Μ L | 2 Μ L |
| ベクター DNA を消化 | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| 消化液の PCR の製品 | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| H2O | 19 μ L に | 19 μ L に | 19 μ L に |
| リガーゼ | 1 Μ L | 1 Μ L | 1 Μ L |
表 2: ライゲーション反応
| プライマー名 | シーケンス | 変異の使用 | ||
| 2-1 a または 3-1 a | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2-、3 - PCR のラウンドcsgD | ||
| 2-3 a または 3-4 a | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2-、3 - PCR のラウンドcsgD | ||
| 3-2 A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | csgD -の 3 ラウンド PCR 代替 4 nt | ||
| 3-3 A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | csgD -の 3 ラウンド PCR 代替 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
岩国の 3 ラウンド PCR | ||
| 3-4B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 岩国の 3 ラウンド PCR | ||
| 3-2 B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 岩国-で 3 ラウンド PCR 代替 4 nt | ||
| 3-3 B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 岩国-で 3 ラウンド PCR 代替 4 nt | ||
| 2-2 C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | csgD -に 2 ラウンド PCR 削除 11 nt | ||
| 2-2 D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | csgD -に 2 ラウンド PCR 代替 4 nt | ||
| 2 2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | csgD -に 2 ラウンド PCR 削除 11 nt | ||
| 2-2 F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | csgD -に 2 ラウンド PCR 削除 9 nt および代替 7 nt | ||
| 2-2 G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | csgD -に 2 ラウンド PCR 削除 9 nt および代替 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5 C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5 D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5 G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
サイト指示された突然変異誘発と T7 テンプレート合成用テーブル 3: プライマー
太字: 制限酵素認識部位 (病原、PstI と AatII)
下線: 遺伝子変異
図 1: サイト指示された突然変異誘発 PCR 戦略。A) 3 つのプライマーは、興味の遺伝子をサイト指示された突然変異を導入する 2 ステップ PCR 方法で使用されます。遺伝子を増幅するプライマー 1 と 3 (PCR の製品私)、プライマー 2 特定の突然変異 (*) を紹介します。プライマー 1 + 2 は興味の PCR の製品 II (ステップ 1) を合成する DNA のどちらかの端の小さな断片を増幅させます。結果として得られる PCR の製品は、株式会社監督サイト変異 (ステップ 2) III の PCR の製品を合成するプライマー 3 と一緒にプライマーとして使用されます。B) 4 つのプライマーは、興味の遺伝子をサイト指示された突然変異を導入する 3 ステップ PCR 方法で使用されます。1 と 4 のプライマー増幅遺伝子 (PCR の製品私)、プライマーを 2、3 紹介特定の突然変異 (*)。プライマー 1 + 2、3 + 4、PCR の製品を合成する PCR の最初 2 つの手順で使用される II および III (手順 1 と 2)。3 番目のステップでは、II と III の PCR の製品は PCR 製品 IV をサイト指示された突然変異組み込まれて (ステップ 3) で合成するプライマー 1 + 4 のテンプレートとして使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: サイト指示された突然変異誘発 PCR 産物。プライマーとテキストで説明するようにテンプレート Pcr を行った。PCR の製品は、エチジウム ブロマイドで 2% の agarose のゲルで実行された (〜 0.5 μ G/ml) DNA の梯子の 1 μ g (材料表) のミックスします。正しいサイズのバンドは、赤い正方形が表示されます。A) ほとんどの PCR の反作用では、適切なサイズのだけ 1 つのバンドが表示されます。ただし、PCR 反応 IVB にするの 2 つの目に見えるバンドはトップのバンド (300 以上だけ bp) 正しい長さを持ちます。予想通り、II, IIIC の PCR の製品の長さの合計が PCR の製品の長さに I と IV (a: csgD PCR の製品、b: 岩国 PCR プロダクト、プライマー 1 a ・ B + 4 a ・ B、II + III を使用して増幅された i: 野生型csgD/McaS: PCR の製品を中間プライマー 1 a ・ B + 2 a ・ B ・ 3 a ・ B + 4 a ・ B をそれぞれ使用して増幅された IV: 変異の PCR の製品はプライマー 1 a ・ B + 4 a ・ B II および III は、中間の PCR の製品を用いたテンプレートとして増幅される)。すべての PCR の反作用では、正しいサイズのだけ 1 つのバンドが表示されます。この場合、PCR の反作用 III に II が追加された PCR の製品のほぼすべての分子は、III の PCR の製品を合成する使用されました。PCR IIIE はまだ目に見える IIE の PCR の製品のためだけ (IA: 野生型csgD PCR の製品はプライマー 1 a + 3 a、中間の PCR の製品はプライマー 1 a を使用して増幅された IIC g: を使用して増幅された + 2 C G、IIIC g: 変異 PCR 増幅プライマー 3 a を用いた PCR の製品 IA 製品テンプレートとして IIC G)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: サイト監督 csgD と岩国の変異体と生体内で実験。指定されたベクトルをかくまっている系統の西部のしみの分析。株指数段階に成長し、1 mM アラビノース (csgD) で 5 分誘導に続いて 1 mM IPTG (岩国) と 10 分のために誘導されます。タグ付きのフラグ CsgD を対象とする α フラグ抗体を用い、α GroEL 抗体はハウスキーピング蛋白 GroEL (それぞれ 10,000 と 50,000 時間を希釈) を対象に使われました。マウスおよびウサギの HRP 標識抗体は、二次抗体 (2,000 倍希釈) として使用されました。この図は2から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: In vitro実験csgDサイト指示された突然変異体では。の in vitro 転写 csgD 野生型 (WT) の Hfq バインド関連変異体 (パネル C G) Rna EMSA。CsgDの対立遺伝子 (WT と変異体 C G) 標識、混合 0、0.25、0.5、1 または 2 μ M 単量体 Hfq ハイブリダイゼーション反応は非変化のポリアクリルアミドゲルで実行されました。シフトのバンドの相対強度の定量化し、シグモイド曲線をデータにフィットしました。解離定数 (Kd) は、SigmaPlot を用いていた。この図は、4から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
サイト指示された突然変異誘発、さまざまなアプリケーションの広範な配列がありここでは、典型的な結果を in vivo と in vitro の実験からの手法を用いて生物学的結論の作り方の例として含まれていた。サイト指示された突然変異誘発は長い RNA 相互作用研究の黄金の標準をされています。技術の強みは下流の試金との遺伝子産物の機能の DNA の特定のサイトとその重要性についての結論を描画するための実験 (例えば、西部のしみまたは EMSA) 関連する変異導入の組み合わせで質問です。技術からほとんどを得るためにプライマーの設計を慎重に計画する必要がありますサイト指示された突然変異誘発を行うに決定するとき (例えば変異するサイト);必ず正しいオーバー ハングし制限のサイト/プライマー/テンプレートの特性に注意を払います。
このプロトコルで記述されている実際の突然変異誘発 PCR に依存しています。プロトコルの最も重要な部分は従ってこれのための条件です。Mg2 +濃度、DMSO 濃度およびアニーリング ・ ステップの温度の勾配を含む PCR の最適化のいくつかの方法があります。詳細については、3を参照してください。以外にも PCR の反作用自体の最適化、2 つは確かサイト指示された突然変異誘発を行うときを作る価値がある、: 高品質のテンプレートおよび注意深く設計されたプライマー。
失敗と成功の PCR の間違いになりますしばしば PCR のため高品質のテンプレートを持ちます。細胞ライセートを使用して DNA のテンプレートを提供することが可能ですが、精製した DNA (ゲノム-、ベクトルまたは PCR DNA) は望ましい常に。さらに、テンプレートの量に関しては、多くの場合少ないです。特にに 3 ステップ PCR (ステップ 4.2.5) の最後のステップ。たとえば、必要な場合に最適なを検索するテンプレートの 10 倍希釈系列をみてください。
最適なプライマー デザインの関心とポリメラーゼ DNA の特性によって異なります。可能な限り、いつもそれに応じてプライマーを設計してください。しかし、多くの場合プライマーは特定のサイトで設計する必要があります、したがって、特定の条件に従っては設計できない場合があります。これらのケースより多くを行う必要がある場合があります、PCR の最適化条件 (上で見なさい、PCR6プロトコル) の代わりに、適切な条件さえ困難な PCRs は通常成功。
いくつかの代替方法のサイト指示された突然変異誘発がクンケルの方法10、全プラスミド変異11、カセット変異12、de novo 遺伝子合成 CRISPR13,14など、使用できます。
クンケルのメソッド全体プラスミドの突然変異誘発プラスミド (ベクトル) で既にされている興味の DNA に依存しているし、変異 DNA の二本鎖を一本鎖をそれぞれ合成するプライマーを使用します。両方の技術で全体のプラスミドは、2 または 3 段階の PCR は唯一興味の DNA の部分を合成するのに対し合成と変換されています。興味の DNA する必要がありますされる合成と 2 回、そこに突然変異の危険性を増加の欠点の 2- または 3 ステップ PCR です。その一方で、プラスミッドはありません合成される従って代わりにここでの突然変異の危険性を下げます。さらに、2- または 3-ステップ PCR を使用して、野生型のバリアント型必要はありません事前にベクターにクローニングするため数日でクローン作成時間を押えてします。
カセット変異は、プライマーまたはポリメラーゼの使用には依存しません。小さい DNA のフラグメントは、デノボ合成し、制限酵素の使用の興味の DNA に組み込まれています。このメソッドは、ただし、適切な制限が常に存在しない対象のサイトに近いサイトの存在に依存しています。この方法も 2 または 3 ステップ PCR 法と比較してクローン作成時間を増加、あらかじめベクターにクローニングするため野生型のバリアント型が必要です。
De novo 遺伝子合成 (DNA のフラグメント) の価格の低下、それはますます商業的目的のシーケンスの順序によって突然変異を導入する手頃な価格になっています。このメソッドは、しかし、まだ高価に記載されている他の方法を比較します。De novo の書き込みの時点で合成がここで紹介した方法よりも約 3 倍高価です。
もう一つの新たなオプションは、ゲノム障害の待望の CRISPR 方法です。このメソッドは非常に効率的です、真核細胞に使用される他の技術と適応比較します。しかし、相対的な容易さと細菌として単純な有機体のクローニングのための多くの利用可能な技術、CRISPR は従来のクローン作成よりも稀。したがって、CRISPR の有用性は、ほとんど研究されている生物に依存します。
サイト指示された突然変異誘発を行うを選択すると、それを慎重に設計することが重要です。両方に関して下位アプリケーションも実際の手法が使用されます。ここで説明した 2 と 3 ステップ PCR 法はほとんどすべての突然変異の研究に該当して低コストで、研究室の予算に適しています。
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Disclosures
著者は競争の興味を宣言しません。
Acknowledgments
著者は、南デンマーク大学オープン アクセス ポリシー付与を感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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