Summary
Site-directed mutagenese er en teknik, der anvendes til at indføre specifikke mutationer i deoxyribonukleinsyre (DNA). Denne protokol beskriver, hvordan at gøre site-directed mutagenese med en 2-trins og 3-trins Polymerasekædereaktionen (PCR) baseret tilgang, der finder anvendelse på enhver DNA fragmenter af interesse.
Abstract
Site-directed mutagenese er en teknik, der anvendes til at indføre specifikke mutationer i DNA til at undersøge samspillet mellem små ikke-kodende ribonukleinsyre (sRNA) molekyler og target messenger RNA'er (mRNAs). Desuden, bruges site-directed mutagenese til at knytte specifikke protein bindingssteder til RNA. En 2-trins og 3-trins PCR baseret indførelsen af mutationer er beskrevet. Metoden er relevant for alle protein-RNA og RNA-RNA interaktion undersøgelser. Kort sagt, afhængig teknikken design primere med den ønskede mutation(s), og gennem 2 eller 3 trin af PCR syntetisere en PCR produkt med mutationen. PCR-produktet bruges derefter til kloning. Vi beskriver her, hvordan du udfører site-directed mutagenese med både 2 - og 3-trins tilgang til at indføre mutationer af sRNA, McaS og mRNA, csgD, at undersøge RNA-RNA og RNA-protein interaktioner. Vi anvender denne teknik for at undersøge RNA interaktion; teknikken er dog gældende for alle mutagenese undersøgelser (fx DNA-protein interaktioner, aminosyre substitution/sletning/tilføjelse). Det er muligt at indføre nogen form for mutation bortset fra ikke-naturlige baser, men teknikken er kun gældende, hvis en PCR produkt kan bruges til efterfølgende anvendelse (fx, kloning og skabelon for yderligere PCR).
Introduction
DNA er ofte omtales som blueprint af en levende celle, da alle strukturer i cellen er kodet i rækkefølgen af sit DNA. Nøjagtig replikering og DNA reparation mekanismer sikre, at kun meget lave takster for mutationer opstår, som er afgørende for at opretholde korrekte funktioner af kodede gener. Ændringer i DNA-sekvens kan påvirke hinanden følgende funktioner på forskellige niveauer, startende med DNA (anerkendelse af transkriptionsfaktorer og restriktionsenzymer), derefter RNA (base-pair komplementaritet og sekundær struktur ændringer) og/eller protein (aminosyrer syre erstatninger, udeladelser, tilføjelser eller ramme-Skift). Mens mange mutationer ikke påvirker genfunktion betydeligt, kan nogle mutationer i DNA har enorme konsekvenser. Således, site-directed mutagenese er et værdifuldt redskab til at studere betydningen af specifikke DNA websteder på alle niveauer.
Denne protokol beskriver en målrettet mutagenese fremgangsmåde bruges til at indføre specifikke mutationer. Protokollen er baseret på to forskellige PCR strategier: en 2-trins eller en 3-trins PCR. 2-trins PCR er gældende, hvis den ønskede mutation er tæt på enten 5'-enden eller 3'-enden af DNA af interesse (< 200 basepar (bp) fra slutningen) og 3-trins PCR kan anvendes i alle tilfælde.
I 2-trins PCR tilgang, 3 primere er designet, hvor ét sæt primere er designet til at forstærke DNA af interesse (primere 1 og 3, frem og bak, henholdsvis), og en enkelt primer er udviklet til at inkorporere mutationen. Mutationen at indføre primer (primer 2) bør have en omvendt orientering, hvis mutationen er tæt på 5'-enden og et fremadrettet retning hvis mutationen er tæt på 3'-enden. I det første skridt i PCR forstærker primer 1 + 2 eller 2 + 3 et lille fragment tæt på 5' enden eller 3' enden, henholdsvis. Den resulterende PCR produkt bruges derefter som en primer i trin to med primer 1 eller 3, hvilket resulterer i en PCR produkt med en mutation i DNA af interesse (figur 1A).
I 3-trins PCR, 4 primere er designet, hvor ét sæt primere er designet til at forstærke DNA af interesse (primere 1 og 4, frem og bak, henholdsvis) og ét sæt primere er udviklet til at inkorporere bestemte mutationer med overlappende komplementaritet (primere 2 og 3, vende og fremad, henholdsvis). I trin et og to, primere 1 + 2 og 3 + 4 forstærke 5' og 3' enden. I trin tre, de deraf følgende PCR produkter fra trin et og to er brugt som skabeloner og forstærket med primere 1 + 4. Den resulterende PCR produkt er således DNA af interesse med den ønskede mutation (figur 1B).
Mens muteret DNA kan bruges til enhver downstream, beskriver denne protokol, hvordan du re kombinere DNA i en kloning vektor. Anvendelse af kloning vektorer har flere fordele som brugervenlighed kloning og særlige eksperimentelle programmer afhængigt af funktioner af vektoren. Denne funktion anvendes ofte til RNA interaktion undersøgelser. En anden teknik til RNA interaktion undersøgelser er strukturelle sondering af RNA i kompleks med en anden RNA1,2 eller protein3,4. Imidlertid udføres strukturelle sondering kun in vitro-mens site-directed mutagenese og efterfølgende kloning mulighed for interaktion undersøgelser in vivo.
Site-directed mutagenese har været flittigt brugt til RNA interaktion undersøgelser, som præsenteres her. Imidlertid den vigtigste metode med hensyn til 2 - eller 3-trins PCR gælder for ethvert stykke DNA, og derfor ikke kun begrænset til RNA-interaktion undersøgelser.
For at illustrere teknikken og dens anvendelsesmuligheder, bruges karakterisering af regioner vigtigt for post-transcriptional regulering af mRNA, csgD, af Escherichia coli (E. coli). I E. coli, csgD er målrettet af de små ikke-kodende RNA, McaS, i samarbejde med et protein, regulering, at undertrykke protein-udtryk for CsgD2,4,5. Teknikken bruges til at indføre mutationer i base-parring regionen mellem csgD og McaS og at bindingssted regulering af csgD. Fremstillet DNA er derefter klones til en vektor egnet til efterfølgende forsøg. Downstream anvendelser af teknikken omfatter både in vivo og in vitro-eksperimenter. For illustration, eksempel 1 er karakteriseret in vivo, ved hjælp af en western blot analysen og eksempel 2 er kendetegnet i vitro ved hjælp af en elektroforese mobilitet Skift assay (EMSA). I begge tilfælde er det illustreret hvor site-directed mutagenese kan bruges i kombination med andre teknikker til at gøre biologisk konklusioner om et gen af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vektor udvalg
- Vælg en vektor til at udføre downstream eksperimenter med. Enhver vektor er gældende for denne 2 - og 3-trins PCR metode.
- Baseret på valg af vektor, vælge passende restriktionsenzymer for kloning.
2. primer design for websted instrueret mutagenese
- Vælge mellem enten 2-trins eller 3-trins PCR strategi (2-trin er kun for mutationer < 200 bp fra begge ender af DNA af interesse). For 2-trins PCR, gå til trin 2.2 og 3-trins PCR gå til trin 2.3.
- Design primere for 2-trins PCR.
- Design primer 1 og 3 til at forstærke DNA af interesse og med en 5' overhæng der indeholder 4 nukleotider (fx ATAT eller AGCT) efterfulgt af den relevante begrænsning genkendelsessekvens nødvendigt at klone i den valgte vektor.
- Design primer 2 at indføre mutation(s) på den ønskede kvadratnetsreference og flanke mutation med 10-15 supplerende nukleotider på begge sider. Gøre primeren omvendt hvis mutationen er indført på 5'-enden eller videresende hvis mutationen er indført på 3'-enden.
- Design primere for 3-trins PCR.
- Design primer 1 og 4 til at forstærke DNA af interesse og med en 5' overhæng der indeholder 4 nukleotider (fx ATAT eller AGCT) efterfulgt af den relevante begrænsning genkendelsessekvens nødvendigt at klone i den valgte vektor.
- Design primer 2 og 3 for at indføre mutation(s) på ønskede kvadratnetsreference og flankere mutationen af 10-15 supplerende nukleotider på begge sider. Primer 2 og 3 er omvendt komplementære.
3. PCR-amplifikation af vildtype DNA for kloning
Bemærk: Yderligere oplysninger om PCR, se6.
- Udføre PCR6 ved hjælp af primere 1 + 2 (2-trins PCR) eller 1 + 4 (3-trins PCR) og bruge vildtype DNA som skabelon til at opnå PCR produkt I. Brug programmet PCR i tabel 1.
- Validere PCR ved agarosegelelektroforese gelelektroforese.
- Gøre en Agarosen gel løsning (2%) ved at tilføje 2 g af Agarosen pr. 100 mL af 1 x Tris-acetat-ethylendiamintetra syre (EDTA) (TAE) buffer. Opløse Agarosen ved kogning i en mikrobølgeovn. Tilføj DNA-farvning farvestof ethidiumbromid (til en endelig koncentration på ~ 0,5 µg/mL) til Agarosen gel løsning til visualisering.
- Støbt agarosegel, placere den i en elektroforese enhed og indlæse PCR prøver (blandet med DNA lastning farvestof) og en DNA ladder af kendt størrelse. Køre prøver på 75 W for 45 min, eller indtil bands er adskilt tilstrækkeligt, og visualisere bands på en ultraviolet (UV) tabel eller med en gel imaging system.
- Rense PCR produktet med en gel udvinding kit (Table of Materials) og måle koncentrationen af oprenset DNA med et spektrofotometer (Tabel af materialer).
- Gemme oprenset DNA ved-20 ° C (i Tris-EDTA (TE) buffer-lang sigt opbevaring) eller 4 ° C (i dH2O-kort sigt opbevaring) indtil brugte i trin 5.
4. PCR at indføre site-directed mutationer i DNA
- PCR for 2-trins PCR (Se trin 4.2 for 3-trins PCR)
- Udføre PCR6 ved hjælp af primere 1 + 2 Hvis mutationer er i 5'-enden eller 2 + 3 Hvis mutationerne er i 3' ende og bruge vildtype DNA som en skabelon til at opnå PCR produkt II (Se tabel 1 for PCR program).
- Validere PCR ved agarosegelelektroforese gelelektroforese som i trin 3.2.1 og 3.2.2.
- Rense PCR produktet med en gel udvinding kit (Table of Materials) og måle koncentrationen af oprenset DNA med et spektrofotometer (Tabel af materialer).
- Butik renset DNA ved-20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O) indtil brugte i trin 5.
- Udføre PCR6 ved hjælp af PCR produkt II som primer sammen med primer 3 Hvis mutationer er i 5' enden eller primer 1 Hvis mutationerne er i 3'-enden og bruge vildtype DNA som skabelon for at opnå PCR produkt III (Se tabel 1 for PCR program).
- Validere PCR ved agarosegelelektroforese gelelektroforese som i trin 3.2.1 og 3.2.2.
- Rense PCR produkt med en gel udvinding kit (Table of Materials) og måle koncentrationen af oprenset DNA med et spektrofotometer (Tabel af materialer).
- Butik renset DNA ved-20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O) indtil trin 5.
- PCR for 3-trins PCR
- Udføre PCR6 ved hjælp af primere 1 + 2 og 3 + 4 i separate reaktioner og bruge vildtype DNA som skabelon til at opnå PCR produkt II og III (Se tabel 1 for PCR program).
- Validere PCR'er ved agarosegelelektroforese gelelektroforese som i trin 3.2.1 og 3.2.2.
- Rense PCR produkter med en gel udvinding kit (Table of Materials) og måle koncentrationen af oprenset DNA med et spektrofotometer (Tabel af materialer).
- Butik renset DNA ved-20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O).
- Udføre PCR6 ved hjælp af primere 1 + 4 og bruge 2-5 ng af begge PCR produkter II og III som skabeloner (i den samme reaktion) at opnå PCR produkt IV (Se tabel 1 for PCR program).
- Validere PCR ved agarosegelelektroforese gelelektroforese som i trin 3.2.1 og 3.2.2.
Bemærk: Det er ikke usædvanligt at få flere forkerte bands (kan undertiden reduceres ved hjælp af mindre skabelon). Dog kan de forkerte PCR produkter ignoreres hvis korrekt størrelse bandet er skåret ud og gel-uddraget. - Hvis korrekte, rense PCR produkt med en gel udvinding kit (Table of Materials) og måle koncentrationen af oprenset DNA med et spektrofotometer (Tabel af materialer).
- Butik renset DNA ved-20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O) indtil trin 5.
5. rekombination af vildtype, og mutant versioner af DNA i den valgte vektor
Bemærk: Yderligere oplysninger om følgende trin, se7.
- Digest renset PCR produkter I og III (fra 2-trins PCR) og/eller IV (fra 3-trins PCR) ved hjælp af de relevante restriktionsenzymer.
- I 20 µL 1 x fordøjelsen buffer med 1 µL af hver begrænsning enzym, digest 200 ng af PCR produkt ved 37 ° C i 30-60 min.
- Rense fordøjet PCR produkt ved gel-ekstraktion ved hjælp af en gel udvinding kit (Table of Materials), måle DNA koncentrationen af oprenset DNA med et spektrofotometer (Tabel af materialer), og opbevar ved-20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2 O) indtil bruges til trin 5.6.
- Fordøje renset vektor med relevante restriktionsenzymer og behandle med alkalisk fosfatase at mindske vektor re ligatur begivenheder. Ikke behandle PCR produkter med alkalisk fosfatase.
- I 30 µL 1 x fordøjelsen buffer med 1 µL af hver begrænsning enzym og 1 µL alkalisk fosfatase, digest 1.000 ng af vektor ved 37 ° C i 30-60 min.
- Separat fordøjet vektoren fra affald DNA (fx uncut vektor og cut-out DNA) ved hjælp af Agarosen gelelektroforese som i trin 3.2.1 og 3.2.2.
- Rense fordøjet vektor af gel-udvinding ved hjælp af en gel udvinding kit (Table of Materials), måle DNA koncentration af oprenset DNA med et spektrofotometer (Tabel af materialer), og opbevar ved-20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O) indtil bruges til trin 5.6.
- Ligate fordøjet PCR produkter til fordøjet vektor med de reaktioner, der er angivet i tabel 2.
- Inkuber ved stuetemperatur i 2 timer eller natten over ved 16 ° C.
- Omdanne modtager stamme (fx E. coli K12) med ligatur reaktioner.
- Vokse stamme til OD600= 0,3-0,5 og overføre en 1 mL kultur så mange 1,5 mL rør som ligase reaktioner.
- Spin på 3.500 x g i 5 min og kassér supernatanten.
- Resuspend celler i 200 μl af transformation buffer (10 mL af lysogeny bouillon (LB) med 0,1 g/mL polyethylenglycol 3350, 5% dimethyl sulfat og 20 mM MgCl2).
- Tilføje ligatur reaktion, og placere rør på is i 30 min.
- Heat-shock for 2 min på 42 ° C.
- Der tilsættes 1 mL af LB til 1,5 mL rør, og tillade fænotypiske udtryk for antibiotikaresistens i mindst 45 minutter ved 37 ° C.
- Spin celler på 3.500 x g i 5 min, kassere 1 mL af supernatanten, og resuspend celler i de resterende supernatanten.
- Plade celler på plader med passende antibiotika, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Identificere transformants husly vektorer med vellykket integration af DNA Indsæt (f.eks. ved PCR ved hjælp af vektor og insert specifikke primere).
- Validere sekvens af DNA af sanger sekvensering.
Forsigtig: Brug ikke de samme primere til sekvensering som anvendes til trin 5.9.
6. ved hjælp af konstruerede vektorer for in vitro-og/eller in vivo forsøg
- In vivo eksperiment
Bemærk: Dette er et eksempel på brugen af en vektor udtrykke vildtype/muteret RNA til at karakterisere post-transcriptional forordning. Du kan finde flere oplysninger på western blotting,8.- Vokse E. coli K12 stammer med beregnede vektorer i passende medium og inducerer udtryk, hvis det kræves. Høst prøver ved centrifugering.
- Forberede prøverne for sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) ved at opløse celle pellets i 1 x SDS prøvebuffer (62.5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5% SDS, 0,002% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol, 10% glycerol) og kog ved 95 ° C i 5 min.
Bemærk: Det er muligt at kaste en gel eller bruge en kommercielt tilgængelig færdigstøbte gel. Sidstnævnte blev brugt i resultaterne præsenteres i fig. 3 (Tabel af materialer). - Indlæse 107 celler af hver prøve i separate brønde (omfatter en protein stige), og køre gel på 200 V indtil proteiner er adskilt (ca 45 min).
- DUP proteiner på en cellulose-membran af halvtør overførsel på 80 mA i 1 time.
- Blokere membran med en blanding af proteiner (f.eks. 5% mælk-pulver opløses i 1 x Tween 20-Tris-bufferet saltvand (TTBS) buffer).
- Tilføj primære antistof (opløst i 1 x TTBS buffer) at målrette protein af interesse (f.eks. normal god landbrugspraksis-, FLAG- eller HIS-mærkede protein) og Inkuber i 1 time med blid agitation.
- Vask membran i 1 x TTBS i 10 min at fjerne ubundne antistoffer. Gentag to gange mere.
- Tilføje sekundær antistof (opløst i 1 x TTBS buffer), som er rettet mod de primære antistoffer og give mulighed for detektion (fx peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundære antistoffer. Inkuber i 1 time med blid agitation.
- Vask membranen i 1 x TTBS i 10 min at fjerne ubundne antistoffer. Gentag to gange mere.
- Visualisere membran med en teknik, der er kompatible med de sekundære antistoffer (fx ved imaging efter inkubering med en luminol-afledte kemiluminescens, hvis en HRP-konjugerede sekundær antistof blev brugt).
- In vitro-eksperiment
Bemærk: Dette er et eksempel på anvendelse af vektoren som en skabelon for in vitro-transskription af RNA til at karakterisere RNA-protein interaktioner. For yderligere detaljer om EMSA, se9.- Gøre in vitro-udskrifter ved hjælp af en T7 i vitro transskription kit (Table of Materials) og vektorer fra trin 5 som skabeloner.
- Adskille RNA udskrifter af side på en 4,5% 7 M urinstof denatureringen gel, og udtrække RNA direkte fra gel ved electro eluering med dialyse rør (Tabel af materialer).
- Label RNA (f.eks. radiolabeling med γ -32P-ATP ved hjælp af T4-polynucleotide kinase (Table of Materials) og rense igen med kolonner (Tabel af materialer).
Forsigtig: Før arbejdet med radioaktivt materiale, rådføre sig med den lokale stråling sikkerhedsansvarlige. - Bland mærket RNA med stigende koncentration af protein i separate reaktioner i en 1 x binding buffer (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)).
Bemærk: I præsenteres resultaterne (figur 4), 2 nM radiolabeled csgD mRNA blev blandet med en gradient af 0-2 µM regulering protein (monomer koncentration). - Tillad proteiner og RNA til at krydse sig før pålæsning hybridisering mix på en ikke-denatureringen polyacrylamid gel og køre gel til 1,5 time på 200 V.
- Visualisere gel med en teknik, der er kompatibel med mærkning fra trin 6.1.3. (fx ved phosphoimaging hvis radiolabeling blev anvendt).
- Kvantificere den relative intensitet af de skiftede bands med en billedbehandling forarbejdning program og passer til en kurve (sigmoide) til data ved hjælp af en graf og data analyse software (Tabel af materialer). Baseret på den indbyggede kurve, kan dissociation konstant (Kd) bestemmes automatisk med softwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At undersøge RNA interaktioner med hensyn til post-transcriptional regulering af csgD, en dobbelt vektor setup blev valgt: en til at udtrykke csgD mRNA og en anden til at udtrykke de små ikke-kodende RNA, McaS. csgD er klonet i pBAD33, som er en arabinose inducerbar medium-kopi plasmid med chloramphenicol modstand og McaS blev klonet i mini R1 pNDM220, som er en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducerbar lav kopi plasmid med ampicillin-resistensen. Vildtype csgD var PCR forstærket ved hjælp af primere 1A og 4A (4A omfatter en FLAG-sekvens) at give PCR produkt IA, mens vildtype McaS var PCR forstærket ved hjælp af primere 1B og 4B til udbytte PCR produkt IB. 3-trins PCR strategi blev brugt til at indføre udskiftninger i regionen forudsagte base-parring af csgD og McaS. I de to første skridt, blev PCR produkter IIA og IIIA syntetiseret ved hjælp af primere 1A + 2A og 3A + 4A, henholdsvis. I det tredje trin, blev PCR produkt IVA syntetiseret ved hjælp af PCR produkter IIA og IIIA som skabelon og 1A og 4A som primere (figur 2A). På samme måde, supplerende site-directed mutationer blev indført i McaS, ved hjælp af primere 1B, 2B, 3B og 4B til udbytte PCR produkter IIB, IIIB i de første to trin og IVB i det tredje trin (figur 2A). pBAD33 og PCR produkter IA og IVA var fordøjet med både BamHI og PstI og fordøjet IA og IVA var forbundet til nedbrudte pBAD33. Deraf følgende konstruktioner blev opkaldt pBAD-csgDFLAG og pBAD-csgD63-66FLAG (muteret på position 63-66 i forhold til webstedet transcriptional start). pNDM220 og PCR produkter IB og IVB var fordøjet med AatII og BamHI og fordøjet IB og IVB var forbundet til fordøjet pNDM220. Deraf følgende konstruktioner blev opkaldt pNDM-mcaS og pNDM-mcaS42-45 (muteret på position 42-45 i forhold til transcriptional startstedet).
For at assay effekten af mutationerne, blev E. coli stammer husly pBAD-csgDFLAG eller pBAD-csgD63-66FLAG og pNDM220, pNDM-mcaS eller pNDM-McaS42-45 dyrket i M9 minimal medium suppleret med 0,2% glycerol til OD 450 af 0,4. Udtryk fra pNDM-vektorer blev derefter induceret i 10 minutter ved tilsætning af 1 mM IPTG efterfulgt af 5 min induktion af pBAD-vektorer ved tilsætning af 1 mM arabinose. På dette tidspunkt prøver blev høstet og western blot analyse blev udført med de høstede prøver. Mens udtryk for vildtype McaS forhindrer oversættelse af vildtype CsgD, lindrer indførelse af mutationer i enten CsgD eller McaS den observerede undertrykkelse. Men når mutationerne er suppleret i både CsgD og McaS translationel undertrykkelse af CsgD er gendannet (figur 3; ændret fra2). Således, den site-directed mutationsmønstre tilgang støtter hypotesen at McaS og csgD basepar på denne region.
PBAD33 vektor blev valgt in vivo eksperimentet, og blev også brugt til at indføre site-directed mutation til at undersøge regulering-binding til csgD mRNA in vitro. Site-directed mutationer blev introduceret med 2-trins PCR strategi til at generere csgD mutant RNA'er med ændrede primære og/eller sekundære strukturer når transskriberet. Primere 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F eller 2G blev brugt til at forstærke og indføre mutationer til 5'-enden af csgD. De resulterende PCR produkter (IIC, IID, IIE, IIF og IIG) blev brugt som skabeloner med primer 3 til at forstærke og indføre mutationer til den hele csgD DNA (figur 2B). De resulterende PCR produkter (IIIC, IIID, IIIE, IIIF og IIIG) blev klonet i pBAD33 som beskrevet ovenfor. In vitro afskrifter blev transskriberet med T7-RNA-polymerase: først, PCR produkter blev syntetiseret med primere 5A, 5C, 5D, 5E, 5F eller 5 g + 6 ved hjælp af de beregnede vektorer som skabelon. De resulterende PCR produkter blev brugt som skabeloner for T7-RNA-polymerase. In vitro-transskriberet csgD vildtype og mutant RNA'er blev renset, radiolabeled og blandet med stigende koncentrationer af renset regulering. Hybridisering reaktioner var kører på ikke-denatureringen geler og visualiseret. Den øgede Ku-værdier for de mutante alleler beviser, at regulering binder mindre effektivt til mutanter. Regulering har desuden adskillige bindingssteder på csgD som er vist ved de 3 Skift observeret for vildtype RNA. Dog kun 2 bindingssteder er observeret for de forskellige mutant RNA'er (figur 4ændres fra4). Således, det site-directed mutationsmønstre tilgang identificerer primære og/eller sekundære strukturer af csgD mRNA, der er vigtige for komplet binding af regulering.
Taget sammen, er det muligt at udføre site-directed mutagenese med en 2 - eller 3-trins PCR tilgang i kombination med downstream assays til at gøre biologisk konklusioner om genregulering på post-transcriptional niveau samt protein-RNA interaktioner .
| Trin | Temperatur | Tid |
| Indledende denaturering | 98° C | 2 min |
| Denaturering | 98° C | 10 s |
| Udglødning | 55° C | 10 s |
| Udvidelse | 72° C | 15 s |
| (30 cykler) | ||
| Endelige udvidelse | 72° C | 5 min |
| Hold | 4 ° C |
Tabel 1: PCR program
| Reagens | Kontrol reaktion | 20 fmol reaktion | 100 fmol reaktion |
| 10 x ligase buffer | 2 ΜL | 2 ΜL | 2 ΜL |
| Fordøjet vektor DNA | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Fordøjet PCR produkt | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| H2O | Til 19 µL | Til 19 µL | Til 19 µL |
| Ligase | 1 ΜL | 1 ΜL | 1 ΜL |
Tabel 2: Ligatur reaktioner
| Primer navn | Sekvens | Anvendes til - mutationer | ||
| 2-1A eller 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - og 3-runde PCR på csgD | ||
| 2-3A eller 3-4A | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - og 3-runde PCR på csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3-runde PCR på csgD – erstatter 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3-runde PCR på csgD – erstatter 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3-runde PCR på McaS | ||
| 3-4B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3-runde PCR på McaS | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 3-runde PCR på McaS – erstatter 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3-runde PCR på McaS – erstatter 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD – sletter 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD – erstatter 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD – sletter 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD – sletter 9 nt og stedfortrædere 7 nt | ||
| 2-2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD – sletter 9 nt og stedfortrædere 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tabel 3: Primere bruges til site-directed mutagenese og T7 skabelon syntese
Fed: begrænsning enzym anerkendelse websteder (BamHI, PstI og AatII)
Understreget: nukleotid mutationer
Figur 1: PCR strategi for site-directed mutagenese. A) tre primere bruges i 2-trins PCR tilgang til at indføre site-directed mutationer til et gen af interesse. Primere 1 og 3 forstærker genet (PCR produkt jeg), mens primer 2 introducerer specifikke mutationer (*). Primer par 1 + 2 forstærker et lille fragment i begge ender af DNA af interesse at syntetisere PCR produkt II (trin 1). Den resulterende PCR produkt bruges derefter som en primer med primer 3 for at syntetisere PCR produkt III med websted instrueret mutation indarbejdet (trin 2). B) fire primere bruges i 3-trins PCR tilgang til at indføre site-directed mutationer til et gen af interesse. Primere 1 og 4 forstærker genet (PCR produkt jeg), mens primere 2 og 3 introducerer specifikke mutationer (*). Primer par 1 + 2 og 3 + 4 anvendes i de to første trin i PCR til at syntetisere PCR produkt II og III (trin 1 & 2). I det tredje trin anvendes PCR produkter II og III som skabelon med primer par 1 + 4 for at syntetisere PCR produkt IV med site-directed mutationen indarbejdet (trin 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: PCR produkter fra site-directed mutagenese. PCR'er blev udført med primere og skabeloner som beskrevet i teksten. PCR produkter blev kørt på en 2%-agarosegel med ethidiumbromid (~ 0,5 µg/mL) med 1 µg af DNA ladder mix (Tabel af materialer). Korrekte størrelse bands er markeret med en rød firkant. A) i de fleste PCR reaktioner ses kun et band af den korrekte størrelse. PCR reaktion IVB har imidlertid to synlige bands som det øverste bandet (lige over 300 bp) har den korrekte længde. Som forventet, summen af længden af PCR produkter II og IIIC lig med længden af PCR produkter I og IV (A: csgD PCR produkter, B: McaS PCR produkter, I: vildtype csgD/McaS forstærkes ved hjælp af primere 1A/B + 4A/B, II + III: mellemliggende PCR produkter forstærket ved hjælp af primere 1A/B + 2A/B og 3A/B + 4A/B, henholdsvis, IV: muterede PCR produkt forstærkes ved hjælp af primere 1A/B + 4A/B med de mellemprodukter PCR II og III som skabeloner). I alle PCR reaktioner ses kun et band af den korrekte størrelse. I dette tilfælde blev næsten alle molekyler af PCR produkter II tilføjes PCR reaktioner III brugt til at syntetisere PCR produkter III. Kun for PCR IIIE er PCR produkt IIE stadig synlige (IA: vildtype csgD PCR produkt forstærkes ved hjælp af primer 1A + 3A, IIC-G: mellemprodukter PCR forstærket ved hjælp af primer 1A + 2 C-G, IIIC-G: muteret PCR produkter forstærkes ved hjælp af primer 3A med PCR produkter IA og IIC-G som skabeloner). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: In vivo forsøg med site-directed csgD og McaS mutanter. Western blot analyse af stammer husly angivet vektorer. Stammer var vokset til eksponentiel fase og induceret i 10 min. med 1 mM IPTG (McaS) efterfulgt af 5 min induktion med 1 mM arabinose (csgD). Α-FLAG antistoffer blev brugt til at målrette de FLAG-mærket CsgD og α-GroEL antistoffer blev brugt til at målrette husholdning protein GroEL (fortyndet 10.000 og 50.000 gange, henholdsvis). Mus og kanin HRP-konjugerede antistoffer blev brugt som sekundære antistoffer (fortyndet 2.000 gange). Dette tal er blevet ændret fra2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: In vitro eksperiment med site-directed csgD mutanter. EMSA af in vitro-transskriberede csgD vildtype (WT) og mutant (Panel C-G) RNA'er med hensyn til regulering bindende. CsgD alleler (WT og mutant C-G) var radiolabeled og blandet med 0, 0,25, 0,5, 1 eller 2 µM monomere regulering. hybridisering reaktioner blev kørt på ikke-denatureringen polyacrylamidgeler. Den relative intensitet af de skiftede bands var kvantificeres og en sigmoid kurve blev monteret på data. Dissociation konstant (Kd) værdier blev bestemt ved hjælp af SigmaPlot. Dette tal er blevet ændret fra4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Site-directed mutagenese har en bred vifte af forskellige applikationer, og her, repræsentative resultater fra en in vivo og in vitro-eksperiment blev medtaget som eksempler på hvordan man laver biologiske konklusioner ved hjælp af teknikken. Site-directed mutagenese har længe været den gyldne standard for RNA interaktion undersøgelser. Styrken af teknikken, der ligger i kombinationen af at indføre relevante mutationer med downstream assays og eksperimenter (f.eks., vestlige skamplet eller EMSA) at drage konklusioner om specifikke DNA sites og deres betydning i funktioner af gen-produkter i spørgsmål. Når det besluttes at gøre site-directed mutagenese, design primere bør være nøje planlagt at få det meste ud af teknikken (f.eks. hvilke websteder til at mutere); Vær sikker på at omfatter den korrekte udhæng og begrænsning websteder og være opmærksomme på primer-skabelon egenskaberne.
Den faktiske mutagenese beskrevet i denne protokol er afhængig af PCR. Den mest afgørende del af protokollen er derfor betingelserne for dette. Der er flere måder at optimere PCR, herunder gradienter Mg2 + koncentrationer, DMSO koncentration og temperaturer i den udglødning trin. For yderligere oplysninger, se3. Udover optimering af PCR reaktion ved sig selv, to ting er værd at gøre sikker på når du laver site-directed mutagenese: høj kvalitet skabeloner og omhyggeligt designet primere.
At have en høj kvalitet skabelon for PCR ofte gør forskellen mellem en mislykket og vellykket PCR. Mens det er muligt at bruge en lysate celle til at give DNA-skabelon, renset DNA (genomisk-, vektor- eller PCR-DNA) er altid at foretrække. Desuden, når det kommer til mængden af skabelon, ofte mindre er mere; især i det sidste trin i 3-trins PCR (trin 4.2.5). For eksempel, prøv en 10 x fortyndingsrække skabelon for at finde optimalt hvis nødvendigt.
Optimal primer design afhænger af egenskaber af interesse og polymerase DNA. Når det er muligt, altid forsøge at designe primere i overensstemmelse hermed. Men i mange tilfælde primere skal udformes på et bestemt websted og kan derfor ikke være designet efter bestemte kriterier. I disse tilfælde kan det være nødvendigt at gøre mere optimering af PCR betingelser i stedet (se ovenfor og protokollen om PCR6), men med de rette betingelser selv vanskelige PCR'er er som regel en succes.
Flere alternative metoder for site-instrueret mutagenese er tilgængelige, såsom Kunkels metode10, hele plasmid mutagenese11, kassette mutagenese12, de novo gen syntese og CRISPR13,14.
Kunkels metode og hele plasmid mutagenese afhængig af DNA af interesse allerede at være i et plasmid (vektor) og bruger primere til at syntetisere en enkelt streng eller dobbeltstrenget af muteret DNA, henholdsvis. I begge teknikker, det hele plasmid bliver syntetiseret og anvendes til transformation, hvorimod 2 - eller 3-trins PCR kun syntetiserer DNA stykke af interesse. En ulempe af 2 - eller 3-trin PCR, er, at DNA af interesse skal syntetiseres to gange, øger risikoen for mutationer deri. På den anden side behøver plasmidet ikke at være syntetiseret, hvilket vil mindske risikoen for mutationer her i stedet. Derudover skal bruger 2 - eller 3-trin PCR, en vildtype variant ikke klones til en vektor på forhånd, således sænke kloning tiden ved flere dage.
Kassette mutagenese stole ikke på brugen af primere eller polymeraser. En lille DNA-fragment er derimod de novo syntetiseres og inkorporeres i DNA af interesse ved hjælp af restriktionsenzymer. Denne metode, men bygger på tilstedeværelsen af passende begrænsning steder nær den målrettede site, der ikke er altid til stede. Denne tilgang kræver også vildtype variant til at blive klonet i vektor på forhånd, øge kloning tid sammenlignet med 2 - eller 3-trins PCR metode.
Med de faldende udgifter til de novo gen syntese (store DNA fragmenter) bliver det mere og mere overkommelige at indføre mutationer ved at bestille den ønskede sekvens kommercielt. Denne metode er dog stadig dyrt i forhold til andre metoder nævnt. På skrivende stund de novo er syntesen ca 3 gange dyrere end den metode, der præsenteres her.
En anden ny mulighed er den ventede CRISPR metode til ændringer i genomet. Denne metode er meget effektiv og fleksibel i forhold til andre teknikker, der anvendes til eukaryote celler. Med den relative lethed og mange tilgængelige teknikker til kloning i enklere organismen som bakterier, er CRISPR sjældent mere egnet end konventionelle kloning. Nytten af CRISPR afhænger således oftest af organismen undersøges.
Når du vælger at gøre site-directed mutagenese, er det vigtigt at udforme det omhyggeligt; både med hensyn til downstream programmer samt den faktiske teknikken anvendes. 2 - og 3-trins PCR metoden beskrevet her, gælder for næsten enhver mutation undersøgelse og med dets lave pris det er egnet til ethvert laboratorium budget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Syddansk Universitet åben adgang politik tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
