Summary
位定向诱变是一种用于引入脱氧核糖核酸 (dna) 中的特定突变的技术。该协议描述了如何进行现场定向诱变与2步和3步聚合酶链反应 (pcr) 为基础的方法, 这是适用于任何 dna 片段的利益。
Abstract
位定向诱变是一种技术, 用于引入特定的突变在 dna 中, 以研究小的非编码核糖核酸 (srna) 分子与目标信使 rna (mrna) 之间的相互作用。此外, 位定向诱变被用来映射特定的蛋白质结合位点到 rna。描述了基于两步和三步 pcr 的突变导入。该方法适用于所有蛋白质-rna 和 rna-rna 相互作用研究。简而言之, 该技术依赖于设计具有所需突变的引物, 并通过2或3个步骤的 pcr 合成具有突变的 pcr 产品。然后将 pcr 产物用于克隆。在这里, 我们描述了如何执行站点定向诱变与2步和3步的方法, 以引入突变的 srna, mcas, 和 mrna, csgd, 以研究 rna-rna 和 rna-蛋白质相互作用. 我们应用这项技术来研究 rna 的相互作用;然而, 该技术适用于所有的诱变研究 (如 dna-蛋白质相互作用, 氨基酸替代/添加)。除非自然碱以外, 可以引入任何类型的突变, 但只有在 pcr 产品可用于下游应用 (例如克隆和进一步 pcr 模板) 的情况下, 该技术才适用。
Introduction
dna 通常被称为活细胞的蓝图, 因为细胞的所有结构都被编码在其 dna 的序列中。精确的复制和 dna 修复机制可确保只发生极低的突变率, 这对于维持编码基因的正确功能至关重要。dna 序列的变化会影响从 dna (通过转录因子和限制性酶识别) 开始的不同层次的连续功能, 然后影响 rna (碱对互补和二级结构改变) 和/或蛋白质 (氨基)酸取代、删除、添加或框架转移)。虽然许多突变不会显著影响基因功能, 但 dna 中的一些突变可能具有巨大的意义。因此, 位定向诱变是研究各级特定 dna 位点重要性的一个有价值的工具。
该协议描述了一种用于引入特定突变的有针对性的诱变方法。该协议依赖于两种不同的 pcr 策略: 2 步或3步 pcr。如果所需的突变接近感兴趣的 dna 的 5 ' 末端或 3 ' 末端 (从末端 lt;200 碱基对 (bp)), 则适用于所有情况下的三步 pcr。
在两步 pcr 方法中, 设计了3种引物, 其中一组引物被设计用于扩增感兴趣的 dna (引物1和 3, 分别向前和向后), 一个引物被设计为包含突变。如果突变接近 5 ' 末端, 引入引物 (引物 2) 的突变应该有相反的方向, 如果突变接近 3 ' 末端, 则应该有向前方向。在 pcr 的第一个步骤中, 引物 1 + 2 或 2 + 3 分别扩增一个靠近 5 ' 末端或 3 ' 末端的小片段。然后将生成的 pcr 产物用作第二步中的引物和引物1或 3, 从而导致 pcr 产物在感兴趣的 dna 中发生突变 (图 1 a)。
在三步 pcr 中, 设计了4种引物, 其中一组引物被设计用于扩增感兴趣的 dna (引物1和 4, 分别向前和向后), 一组引物设计为包含具有重叠互补的特定突变(引物2和 3, 分别反向和正向)。在第一步和第二步中, 引物 1 + 2 和 3 + 4 放大 5 ' 和 3 ' 端。在第三步中, 从第一步和第二步产生的 pcr 产品被用作模板, 并与引物 1 + 4 一起放大。因此, 产生的 pcr 产物是所需突变的 dna (图 1 b)。
虽然突变的 dna 可用于任何下游应用, 但该协议描述了如何将 dna 重新组合为克隆载体。克隆载体的使用有几个优点, 如易于克隆和特定的实验应用取决于载体的特征。此功能通常用于 rna 相互作用研究。rna 相互作用研究的另一种技术是与另一个 rna1、2或蛋白质3、4对复杂的 rna进行结构探测。然而, 结构探测只在体外进行, 而位定向诱变和随后的克隆允许在体内进行相互作用研究。
现场定向诱变已被广泛用于 rna 相互作用研究, 在此介绍。然而, 关于2步或3步 pcr 的关键方法适用于任何一片 dna, 因此不仅限于 rna 相互作用研究。
为了说明这项技术及其可能的用途, 使用了对大肠杆菌 (大肠杆菌) 的 mrna、 csgd、转录后调节重要区域的表征。在大肠杆菌中, csgd是由小的非编码 rna mcas 与蛋白质 hfq 合作, 抑制 csgd2,4,5的蛋白表达。该技术用于将突变引入 csgd和 mcas 之间的基对区, 以及csgd的 hfq 结合位点。然后将获得的 dna 克隆到适合后续实验的载体中。该技术的下游应用包括体内和体外实验。例如, 例子1在体内使用西方印迹法进行表征, 例子2在体外使用电泳移位分析 (emsa) 进行定性。在这两种情况下, 说明了如何将位定向诱变与其他技术结合起来, 对感兴趣的基因作出生物学结论。
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Protocol
1. 矢量选择
- 选择要使用的矢量。任何载体都适用于这种2步和3步 pcr 方法。
- 根据载体的选择, 选择合适的限制性酶进行克隆。
2. 现场定向诱变的底漆设计
- 在两步或3步 pcr 策略 (2 步仅用于突变 & lt;200 bp 之间做出决定)。对于两步 pcr, 请转到步骤 2.2, 对于3步 pcr, 请转到步骤2.3。
- 设计两步 pcr 的引物。
- 设计入门书1和3放大感兴趣的 dna, 并具有包含4个核苷酸 (例如 atat 或 agct) 的 5 ' 悬垂, 然后是克隆到所选载体所需的相关限制识别站点。
- 设计引物 2, 在所需的位置引入突变, 并将突变侧侧为两端为10-15 互补核苷酸。如果在 5 ' 端引入突变, 则使引物反转, 如果突变在 3 ' 端引入, 则向前。
- 设计三步 pcr 的引物。
- 设计入门书1和4放大感兴趣的 dna, 并具有包含4个核苷酸 (例如 atat 或 agct) 的 5 ' 悬垂, 然后是克隆到所选载体所需的相关限制识别站点。
- 设计引物2和 3, 在所需的地点引入突变, 并由两侧10-15 互补核苷酸侧翻突变。底漆2和3是反向互补的。
3. 用于克隆的野生类型 dna 的 pcr 扩增
注: 有关 pcr 的详细信息, 请参阅6。
- 使用引物 1 + 2 (2 步 pcr) 或 1 + 4 (3 步 pcr) 执行 pcr 6, 并使用野生类型 dna 作为模板来获取 pcr 产品 i. 使用表 1中的 pcr 程序。
- 琼脂糖凝胶电泳检测 pcr。
- 在1x 的 tris-乙etyetametedeteetaceetaceetacetaceetacetetal (edta) (tae) 中, 每100毫升加入2克琼脂糖凝胶溶液 (2%)。在微波炉中煮沸, 将琼脂糖溶解。将 dna 染色染料乙二氢溴化物 (添加到约 0.5μg/ml 的最终浓度中) 添加到琼脂糖凝胶溶液中进行可视化。
- 铸造琼脂糖凝胶, 将其放置在电泳单元中, 并加载 pcr 样品 (与 dna 加载染料混合) 和已知大小的 dna 阶梯。在 75 w 运行样品 45分钟, 或直到带充分分离, 并在紫外线 (uv) 表或凝胶成像系统中可视化波段。
- 用凝胶提取试剂盒 (材料表) 纯化 pcr 产品, 并用分光光度计 (材料表) 测量纯化 dna 的浓度。
- 将纯化后的 dH 保存在-20°c (在 tris-edta (te) 缓冲液中--长期储存) 或 4°c (dh2o–短期储存), 直到在步骤5中使用.
4. pcr 在 dna 中引入位点定向突变
- 用于两步 pcr 的 pcr (用于三步 pcr 的步骤 4.2)
- 如果突变位于 5 ' 末端或 2 + 3, 如果突变位于 3 ' 端, 则使用引物 1 + 2 执行 pcr 6, 如果突变位于 3 ' 端, 则使用野生类型 dna 作为模板来获取 pcr 产品 ii (pcr 程序见表 1 )。
- 琼脂糖凝胶电泳检测 pcr, 步骤3.2.1 和3.2.2。
- 用凝胶提取试剂盒 (材料表) 纯化 pcr 产品, 并用分光光度计 (材料表) 测量纯化 dna 的浓度。
- 在-20°c (te 缓冲液中) 或 4°c (dh2o) 下储存纯化的 dH, 直到在步骤5中使用。
- 如果突变在 3 ' 末端, 则使用 pcr 产物 ii 作为引物与引物3一起执行 pcr 6, 如果突变在 3 ' 端, 则使用野生类型 dna 作为模板获取 pcr 产品 iii (pcr 程序见表 1 )。
- 琼脂糖凝胶电泳检测 pcr, 步骤3.2.1 和3.2.2。
- 用凝胶提取试剂盒 (材料表) 纯化 pcr 产品, 并用分光光度计 (材料表) 测量纯化 dna 的浓度。
- 将纯化的 dH 储存在-20°c (在 te 缓冲液中) 或 4°c (dh2o), 直到第5步。
- 用于三步 pcr 的 pcr
- 在不同的反应中使用引物 1 + 2 和 3 + 4 进行 pcr 6, 并使用野生类型 dna 作为模板来获得 pcr 产品 ii 和 iii (pcr 程序见表 1 )。
- 用琼脂糖凝胶电泳验证 pcr, 如在步骤中3.2.1 和3.2.2。
- 使用凝胶提取试剂盒 (材料表) 纯化 pcr 产品, 并用分光光度计 (材料表) 测量纯化 dna 的浓度。
- 将纯化的 dH 储存在-20°c (在 te 缓冲液中) 或 4°c (dh2o)。
- 使用引物 1 + 4 进行 pcr 6, 并使用 2-5 ng 的 pcr 产品 ii 和 iii 作为模板 (在同一反应中) 获得 pcr 产品 iv (pcr 程序见表 1 )。
- 琼脂糖凝胶电泳检测 pcr, 步骤3.2.1 和3.2.2。
注: 获取几个不正确的波段并不鲜见 (有时可以通过使用较少的模板来减少)。但是, 如果切除了尺寸正确的带并提取了凝胶, 则可以忽略不正确的 pcr 产品。 - 如果正确, 使用凝胶提取试剂盒 (材料表) 纯化 pcr 产品, 并用分光光度计 (材料表) 测量纯化 dna 的浓度。
- 将纯化的 dH 储存在-20°c (在 te 缓冲液中) 或 4°c (dh2o), 直到第5步。
5. 将野生 dna 类型和突变体版本重组为所选择的载体
注: 有关以下步骤的详细信息, 请参阅7。
- 消化纯化后的 pcr 产物 i 和 iii (来自2步 pcr) 和/或 iv (来自3步 pcr) 使用相关的限制性酶。
- 在每个限制性酶为1μl 的1x 消化缓冲液中, 在37°c 下消化 200 ng pcr 产物30-60。
- 使用凝胶提取试剂盒 (材料表) 通过凝胶提取纯化消化的 pcr 产物, 用分光光度计 (材料表) 测量纯化 dH 的 dH 浓度, 并在-20°c (te 缓冲液中) 或 4°c (dh2) 中储存o), 直到用于步骤5.6。
- 消化纯化载体与相关的限制性酶和治疗碱性磷酸酶, 以减少载体再结扎事件。不要用碱性磷酸酶治疗 pcr 产品。
- 在30μl 的1x 消化缓冲液中, 每个限制酶为 1μl, 碱性磷酸酶为 1μl, 在37°c 下消化 1, 000 纳克的载体, 时间为30-60。
- 使用琼脂糖凝胶电泳从废物 dna (如未切割载体和切割 dna) 中分离消化的载体, 如在步骤3.2.1 和3.2.2。
- 使用凝胶提取试剂盒 (材料表) 通过凝胶提取纯化消化载体, 使用分光光度计 (材料表) 测量纯化 dH 的 dH 浓度, 并在-20°c (te 缓冲液中) 或 4°c (dh2o) 下储存直到用于步骤5.6。
- 配酸 pcr 产物与表2中指定的反应一起消化成消化的载体。
- 在室温下孵化 2小时, 或在16°c 下过夜。
- 通过结扎反应转化受者菌株 (如大肠杆菌k12)。
- 将应变增加到 od600= 0.3-0.5, 并将 1 ml 培养转移到与连接酶反应相同的 1.5 ml 管。
- 以 3, 500 x克旋转 5分钟, 并丢弃上清液。
- 在200μl 转化缓冲液中再悬浮细胞 (10 毫升溶酶汤 (lb) 与 0.1 gml 聚乙二醇 3350, 5% 硫酸二甲酯和 20 mL mgcl2)。
- 加入结扎反应, 并将管子放在冰上30分钟。
- 42°c 时热休克2分钟。
- 在 1.5 ml 管中加入1毫升 lb, 并允许在37°c 下至少45分钟的抗生素耐药性表型表达。
- 将细胞旋转 5分钟, 丢弃 1 毫升上清液, 并在剩余的上清液中重新悬浮细胞。
- 用适当的抗生素将细胞贴在盘子上, 在37°c 下孵育一夜。
- 通过成功集成 dna 插入物识别具有载体的变压器 (例如, 通过使用矢量和插入特定引物进行 pcr)。
- 通过桑格测序验证 dna 序列。
注意: 不要使用与步骤5.9 相同的引物进行排序。
6. 利用构造载体进行体外实验和体内实验
- 体内实验
注: 这是一个例子, 使用载体来表达野生类型突变 rna 来表征转录后的调节。有关西方印迹的更多详细信息, 请参见8。- 在适当的培养基中与构造的载体生长大肠杆菌 k12 菌株, 并在必要时诱导表达。离心采集样品。
- 通过在 1x sds 样品缓冲液 (62.5 mm tris-hcl ph 6.8, 2.5% sds, 0.002% 溴酚蓝, 5% β-硫醇, 10% 甘油), 并在95°c 煮5最小值。
注: 可以铸造凝胶或使用市售的预制凝胶。图3 (材料表) 中使用了后者。 - 在不同的井 (包括蛋白质阶梯) 中加载每个样本的 10个7个细胞, 并以 200 v 的速度运行凝胶, 直到蛋白质分离 (约 45分钟)。
- 在 80 ma 的半干式转移条件下, 将蛋白质压到纤维素膜上1小时。
- 用蛋白质混合物 (例如, 在1x 特温20-特里缓冲盐水 (ttbs) 缓冲液中溶解的5% 的牛奶粉) 阻止膜。
- 加入针对感兴趣的蛋白质 (例如, gfp-、flag-–或 his 标记的蛋白质) 的原代抗体 (溶解在 1x ttbs 缓冲液中), 并以温和的搅拌孵育1小时。
- 在 1x ttbs 中清洗膜 10分钟, 去除未绑定的抗体。再重复两次。
- 添加二级抗体 (溶解在 1x ttbs 缓冲液中), 该抗体针对初级抗体并允许检测 (例如, 辣根过氧化物酶 (hrp)-共轭二级抗体)。用温和的搅拌孵化1小时。
- 在 1x ttbs 中清洗膜 10分钟, 以去除未绑定的抗体。再重复两次。
- 用与二级抗体兼容的技术来可视化膜 (例如, 在与发光衍生的化学发光孵育后进行成像, 如果使用 hrp 共轭二级抗体)。
- 体外实验
注: 这是一个使用载体作为 rna 体外转录模板来表征 rna-蛋白质相互作用的示例。有关 emsa 的更多详细信息, 请参见9。- 使用 t7 体外转录试剂盒 (材料表) 和第5步的载体作为模板制作体外转录。
- 在4.5% 的尿素 7 m 变性凝胶上通过 page 分离 rna 转录, 并通过透析管 (材料表) 的电洗法直接从凝胶中提取 rna。
- 标签 rna (例如, 使用 t4-多核苷酸激酶(材料表) 用γ-32 p-atp 进行放射性标记, 并使用色谱柱 (材料表) 再次纯化。
注意: 在处理放射性物质之前, 请咨询当地的辐射安全官员。 - 在1x 结合缓冲液中, 在单独的反应中混合标签-rna, 蛋白质浓度不断增加 (20 mm tris, ph 8, 100 mm kcl, 1 mm mgcl 2, 1 mm 二硫醇 (dtt)).
注: 在所给出的结果 (图 4) 中, 将 2 nm 的放射性标记 csgd mrna 与0至 2μm hfq 蛋白 (单体浓度) 的梯度混合。 - 在加载非变性聚丙烯酰胺凝胶混合之前, 允许蛋白质和 rna 杂交, 并在 200 v 时运行 1.5 h 的凝胶。
- 用与步骤6.1.3 标记兼容的技术来可视化凝胶。(例如, 在应用放射性标记的情况下, 通过磷成像)。
- 使用成像处理程序量化移位波段的相对强度, 并使用图形和数据分析软件 (材料表) 将曲线 (sigmoidal) 与数据相匹配。基于拟合曲线, 可以用软件自动确定离解常数 (kd) 值。
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Representative Results
为了研究 rna 在csgd转录后调控方面的相互作用, 选择了一个双载体设置: 一个表示 csgd mrna, 另一个表示小的非编码 rna, mcas. csgd被克隆到 pbad33 中, 它是一种抗氯霉素的阿拉伯糖诱导中份质粒, 并将 mcas 克隆到微型 r1 pndm220 中, 这是一种异丙基β-d-1-硫代唑酮 (iptg) 诱导的低拷贝质粒。氨匹西林的耐受性。利用引物 1 a 和 4 a (4 a 含 flg 序列) 对野生型csgd进行 pcr 扩增, 产生 pcr 产物 ia, 而利用引物1b 和4A 扩增野生型 mcas, 产生 pcr 产物 ib。采用三步 pcr 策略引入csgd和 mcas 预测的基础配对区域的替代。在前两个步骤中, 分别利用引物1A+2A 和3A+4A 合成了 pcr 产物 iia 和 iiia。第三步, 以 pcr 产品 iia 和 iiia 为模板, 用1a 和4a 为引物合成 pcr 产物 iva (图 2 a)。同样, 在 mcas 中引入了互补的位点定向突变, 在前两个步骤中使用引物 1 b、2A、3b 和4b 生成 pcr 产物 iib, 在第三步中使用 iiib 和 ivb (图 2 a)。用 bamhi 和 psti 对 padam33 和 pcr 产物 ia 和 iva 进行了消化, 并将消化的 ia 和 iva 连接到消化的 padam33 中。生成的构造被命名为 pad-csgd flag和 pbad-csgd63-66flag (相对于转录起始部位在63-66 位置发生突变)。用 aatii 和 bamhi 消化 pNDM220 和 pcr 产物 ib 和 ivb, 并将消化后的 ib 和 ivb 连接到消化 pndm220 中。生成的构造被命名为 pNDM-mcaS 和 pNDM-mcaS42-45 (相对于转录起始部位在42-45 位置发生突变)。
为了分析突变的影响在 m9 最小培养基中生长了含有 pbad-csgd flag或 pbad-csgd 63-66flag 和 pndm220、pndm-mcas 或 pndm-mcas42-45的 大肠杆菌株, 并对 od补充0.2% 甘油450的 0.4 。然后通过添加 1 mm iptg, 然后通过添加 1 mm arabinose 对 pbad 向量进行5分钟的诱导, 从而诱导 pndm 载体的表达10分钟。在这一点上, 采集样本, 并对采集的样本进行西方印迹分析。野生型 mcas 的表达阻碍了野生型 csgd 的翻译, 但在 csgd 或 mcas 中引入突变可以缓解观察到的抑制。然而, 当突变在 csgd 和 mcas 对 csgd 的平移抑制中得到补充时, 就会恢复 (图 3; 从2修改)。因此, 站点定向突变方法支持 mcas 和csgd基对在该区域的假设。
选择 pbad33 载体进行体内实验, 并用于引入位向突变, 以研究 hfq 结合 csgd mrna 的体外实验。采用两步 pcr 策略引入位定向突变, 在转录时生成原代和 (或二级结构) 改变的csgd突变 rna。引物 1 + 2E、2E、2e、2E 或2E 被用来放大和引入 csgd 5 ' 末端的突变。由此产生的 pcr 产品 (iic、id、iie、iif 和 iig) 被用作引物3的模板, 用于扩增和引入整个csgd dna的突变 (图 2b)。如上文所述, 由此产生的 pcr 产品 (iiic、iliid、iiie、iiif 和 iiig) 被克隆到 padam33 中。用 t7 rna-聚合酶转录体外转录: 首先, 以构建的载体为模板, 用引物5a、5A、5A、5A、5A 或 5A + 6 合成 pcr 产物。由此产生的 pcr 产物被用作 t7 rna 聚合酶的模板。体外转录csgd野生类型和突变 rna 进行纯化, 进行了放射性标记, 并与纯化的 hfq 浓度增加的混合。杂交反应在非变性凝胶上进行, 并进行可视化。突变等位基因的 kd 值的增加证明 hfq 与突变体的结合效率较低。此外, hfq 在csgd上有几个结合位点, 这表现在为野生类型 rna 观察到的3个移位。但是, 对于不同的突变 rna, 只观察到2个绑定站点 (图 4; 从4修改)。因此, 站点定向突变方法识别csgd mrna 的原代和二级结构, 这些结构对 hfq 的完全结合非常重要。
总之, 有可能用2步或3步 pcr 方法与下游检测相结合进行位定向诱变, 从而得出转录后水平基因调控的生物学结论以及蛋白质-rna 相互作用.
| 步 | 温度 | 时间 |
| 初始变性 | 98°C | 2分钟 |
| 变性 | 98°C | 10秒 |
| 退火 | 55°C | 10秒 |
| 扩展 | 72°C | 15秒 |
| (30个周期) | ||
| 最后延期 | 72°C | 5分钟 |
| 按住 | 4°c |
表 1: pcr 方案
| 试剂 | 控制反应 | 20 fmol 反应 | 100 fmol 反应 |
| 10倍连接酶缓冲液 | 2μl | 2μl | 2μl |
| 消化载体 dna | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| 消化后的 pcr 产物 | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| h2o | 至19μl | 至19μl | 至19μl |
| 连接酶 | 1μl | 1μl | 1μl |
表 2: 结扎反应
| 底漆名称 | 序列 | 用于-突变 | ||
| 2-1a 或3-1a | GCGCGGATCCTACCTGCTTTTTCATCCATCTCTCCACCACA tgtaattactag |
csgd上的2和3轮 pcr | ||
| 2-3a 或3-4a | CCGCCTGCAGAAAACCCCCGGGGGGTTCTCACGAGAAC | csgd上的2和3轮 pcr | ||
| 3-2a | CTGGTGGGGGTAATATEC | csgd–替代品 4 nt 的3轮 pcr | ||
| 3-3a | GATTATTACACACACTGC | csgd–替代品 4 nt 的3轮 pcr | ||
| 3-1b | CGCC TGGGAAGAGAGAGTGTGTGGGGGTAATACTATTETA gocccagcagagagacaatcc |
mcas 上的3轮 pcr | ||
| 3-4b | AATTGGATCCAAAAAAGGTGCACATC | mcas 上的3轮 pcr | ||
| 3-2b | CTCCATACACACCAC CATCCCGGGTTAATC | mcas-4 nt 上的3轮 pcr | ||
| 3-3b | GCTGGA GCTGGTGTGTAGTAGTAGAG | mcas-4 nt 上的3轮 pcr | ||
| 2-2c | caccctaagggtaatgattactactg | csgd–删除 11 nt | ||
| 2-2d | CCCTAAGGTAAA CCCC AAATATGATTACTG | csgd–替代品 4 nt 的2轮 pcr | ||
| 2-2e | cctggtataatattatataatatatgattactg | csgd–删除 11 nt | ||
| 2-2 楼 | GTAATACACCCTA TTACGAATAGGATTACTG | csgd–删除 9 nt 并替换 7 nt | ||
| 2-2g | CTGCT GTGTTAATCC TAAACTAATGATTACTG | csgd–删除 9 nt 并替换 7 nt | ||
| 5a | GAATATACTACACTAGCAGGETTA ATTACTATTATTACCC | t7 pcr | ||
| 5c | 这是一项重要的报告 | t7 pcr | ||
| 5d | GAATATACACACACTACTAGGAGGTA ATTACTGGTTTAC | t7 pcr | ||
| 5e | GAATATACTACACTAGCAGEGTA ATTACATTATTATTATTATTA | t7 pcr | ||
| 5楼 | GAATATACACACTACTAGCAGEGTA ATTACTATTAGTAG | t7 pcr | ||
| 5g | GAATATACTACACTGATAGEGTA ATTACTATTATTAGGG | t7 pcr | ||
| 6 | gatgacatgatattagg | t7 pcr | ||
表 3: 用于现场定向诱变和 t7 模板合成的引物
大胆: 限制性酶识别位点 (bamhi、psti 和 aatii)
下划线: 核苷酸突变
图 1: 位定向诱变的 pcr 策略.a) 在两步 pcr 方法中使用了三种引物, 将位向突变引入感兴趣的基因。引物1和3扩增基因 (pcr 产物 i), 而引物2则引入特定突变 (*)。底漆对 1 + 2 在感兴趣的 dna 两端扩增一个小片段, 合成 pcr 产品 ii (步骤 1)。然后将产生的 pcr 产物与引物3一起用作引物, 合成 pcr 产物 iii, 并加入位点定向突变 (步骤 2)。b) 在三步 pcr 方法中使用了四种引物, 将位向突变引入感兴趣的基因。引物1和4扩增基因 (pcr 产物 i), 引物2和3则引入特定突变 (*)。在 pcr 的两个前两个步骤中使用底漆对 1 + 2 和 3 + 4 合成 pcr 产品 ii 和 iii (步骤 1 & 2)。在第三步中, pcr 产物 ii 和 iii 被用作引物对 1 + 4 的模板, 合成 pcr 产物 iv, 并加入位向突变 (步骤 3)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 位点定向诱变产生的 pcr 产物.如文本所述, 使用引物和模板执行 pcr。pcr 产物在2% 琼脂糖凝胶上运行, 溴化乙酯 (~ 0.5μg/ml), dna 阶梯混合 (材料表)。正确的大小带用红色方块标记。a) 在大多数 pcr 反应中, 只有一个正确大小的波段是可见的。然而, pcr 反应 ivb 有两个可见带, 其中顶部带 (刚刚超过 300 bp) 有正确的长度。如预期的那样, pcr 产品 ii 和 iiic 的长度等于 pcr 产品 i 和 iv 的长度 ( a:csgd pcr 产品, b:mcas pcr 产品, i: 野生型 csgd/mcas 1A/B+4A/B, ii + iii: 中间 pcr 产品用引物1A/B+2A/B 和3A/B+4A/B 分别扩增, 用引物1A/B+4A/B 以中间 pcr 产物 ii 和 iii 为模板) 扩增 iv: 突变 pcr 产物。在所有 pcr 反应中, 只有一个正确大小的波段是可见的。在这种情况下, 几乎所有添加到 pcr 反应 iii 中的 pcr 产物 ii 分子都被用于合成 pcr 产物 iii。只有 pcr 产品 iie 仍然可见 (ia: 野生型csgd pcr 产品用引物1A+3A 扩增, iic-g: 中间 pcr 产品用引物 1A+2C-g, iice-g: 突变 pcr 产品用 pcr 产品与 pcr 产品 ia 扩增和 iic-g 作为模板)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 现场定向 csgd 和 mcas 突变体的体内实验.西方对藏有指示载体的菌株的印迹分析。菌株生长到指数相, 诱导10分钟与 1 mm iptg (mcas), 然后5分钟诱导与 1 mm 阿拉伯糖 (csgd)。α-flag 抗体用于针对 fla 标记的 csgd 和α-groel 抗体针对家政蛋白 groel (分别稀释 10, 000次和 50, 000次)。小鼠和兔 hrp 结合抗体作为二级抗体 (稀释 2, 000次)。此数字已从2修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 位定向csgd突变体的体外实验。体外转录 csgd 野生类型 (wt) 和突变体 (c-g) rna 与 hfq 结合有关的 emsa。对 csgd等位基因 (wt 和突变体 c-g) 进行了放射性标记, 并与0、0.25、0.5、1或2μm 单体 hfq 混合, 在非变性聚丙烯酰胺上进行了杂交反应。对移位带的相对强度进行了量化, 并在数据中拟合了乙状结肠曲线。使用 sigmaplot 确定了分离常数 (kd) 值。此数字已从4修改。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
现场定向诱变有广泛的应用, 在这里, 具有代表性的结果, 从体内和体外实验中包括如何作出生物结论的技术。定位诱变长期以来一直是 rna 相互作用研究的黄金标准。这项技术的优势在于将相关突变与下游检测和实验 (如西方印迹或 emsa) 结合起来, 得出关于特定 dna 位点及其在基因产品功能中的重要性的结论。问题。在决定进行站点定向诱变时, 应仔细规划引物的设计, 以便从技术中获得最大收益 (例如, 要进行哪些站点突变);一定要包括正确的悬垂和限制网站, 并注意原始模板的特点。
本协议中描述的实际诱变依赖于 pcr。因此, 议定书最关键的部分是这样做的条件。优化 pcr 的方法有多种, 包括 mg2+浓度梯度、dmso 浓度和退火步骤的温度。有关详细信息, 请参阅3。除了优化 pcr 反应本身, 有两点是值得确定的, 当做现场定向诱变: 高质量的模板和精心设计的引物。
拥有高质量的 pcr 模板通常会使 pcr 失败和成功之间产生影响。虽然可以使用细胞裂解液提供 dna 模板, 纯化的 dna (基因组学、矢量-或 pcr-dna) 总是可取的。此外, 当涉及到模板的数量, 往往少是多;特别是在三步 pcr 的最后一步 (步骤 4.2.5)。例如, 尝试10倍稀释系列模板, 以找到最佳的, 如果需要。
最佳引物设计取决于感兴趣的 dna 和聚合酶的特性。只要有可能, 总是尝试相应地设计引物。然而, 在许多情况下, 引物必须在特定地点设计, 因此可能不是根据具体标准设计的。在这些情况下, 可能有必要对 pcr 条件进行更多的优化 (见上文和 pcr6的协议), 但在适当的条件下, 即使是困难的 pcr 通常也是成功的。
有几种可供选择的方法, 如 kunkel 的方法10, 全质粒诱变 11, 盒状诱变 12,de novo 基因合成和 crispr13,14.
昆克尔的方法和整个质粒诱变依赖于质粒 (载体) 中已经存在的感兴趣的 dna, 并分别利用引物合成单个链或双链突变 dna。在这两种技术中, 整个质粒都被合成并用于转化, 而2步或3步 pcr 只合成感兴趣的 dna 片段。2步或3步 pcr 的缺点是, 感兴趣的 dna 必须合成两次, 增加了其中突变的风险。另一方面, 质粒不必合成, 从而降低了这里发生突变的风险。此外, 使用2步或3步 pcr, 野生类型变异不需要事先克隆到矢量中, 从而将克隆时间缩短数天。
盒式磁带诱变不依赖于使用引物或聚合酶。相反, 一个小的 dna 片段是重新合成的, 并通过使用限制性酶纳入感兴趣的 dna。但是, 这种方法依赖于目标站点附近是否存在适当的限制站点, 而这并不总是存在的。这种方法还要求事先将野生类型变异克隆到载体中, 与2步或3步 pcr 方法相比, 增加了克隆时间。
随着新基因合成 (大 dna 片段) 成本的降低, 通过商业订购所需序列来引入突变变得越来越实惠。然而, 与提到的其他方法相比, 这种方法仍然很昂贵。在编写本文时, 新合成的成本大约是这里提出的方法的3倍。
另一个新出现的选择是备受期待的 crispr 基因组改变方法。与其他用于真核细胞的技术相比, 这种方法是高效和适应性强的。然而, 随着相对容易和许多可用的技术克隆在更简单的生物体作为细菌, crispr 是很少比传统的克隆更合适。因此, crispr 的效用主要取决于所研究的生物体。
在选择进行现场定向诱变时, 仔细设计是很重要的;无论是在下游应用以及实际使用的技术。这里描述的2步和3步 pcr 方法几乎适用于任何突变研究, 其成本低廉, 适用于任何实验室预算。
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Disclosures
提交人声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
作者要感谢南丹麦大学开放获取政策赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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