Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli

Resumen

Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ácido desoxirribonucleico (ADN). Este protocolo describe cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con un 2-paso y enfoque, que es aplicable a cualquier fragmento de ADN de interés basado en la reacción en cadena de polimerasa de 3 pasos (PCR).

Resumen

Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ADN para investigar la interacción entre moléculas de ácido ribonucleico (sRNA) no codificante pequeñas y destino mensajero RNAs (mRNAs). Además, mutagénesis sitio-dirigida se utiliza para asignar sitios de unión de la proteína específica a RNA. Se describe una introducción de PCR basado en 2 pasos y 3 pasos de mutaciones. El enfoque es relevante para todos los estudios de interacciones RNA-RNA y proteína-RNA. En definitiva, la técnica se basa en el diseño de cartillas con la mutación deseada y a través de 2 o 3 pasos de PCR sintetizar un producto PCR de la mutación. El producto PCR entonces se utiliza para la clonación. Aquí, describimos cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con el enfoque de paso 2 y 3 para introducir mutaciones la sRNA, McaS y el mRNA, csgD, para investigar interacciones RNA-proteína y ARN-ARN. Aplicamos esta técnica para investigar las interacciones RNA; sin embargo, la técnica es aplicable a todos los estudios de mutagénesis (por ejemplo, las interacciones DNA proteína, aminoácido sustitución/supresión/adición). Es posible introducir a cualquier tipo de mutación excepto bases no natural pero la técnica sólo es aplicable si un producto PCR se puede utilizar para uso aguas abajo (por ejemplo, clonación y plantilla para más PCR).

Introducción

ADN se refiere a menudo como el plan de acción de una célula viva ya que todas las estructuras de la célula están codificadas en la secuencia de su ADN. Replicación exacta y mecanismos de reparación del ADN aseguran que se producen sólo muy bajas tasas de mutaciones, que es esencial para mantener la correcta funciones de genes codificados. Los cambios de la secuencia del ADN pueden afectar funciones sucesivas en diferentes niveles a partir de ADN (reconocimiento de factores de transcripción y las enzimas de restricción), entonces RNA (complementariedad de pares de base y alteraciones de la estructura secundaria) o proteínas (aminoácidos ácido sustituciones, supresione....

Protocolo

1. selección de vector

1. Elegir un vector para realizar experimentos posteriores con. Cualquier vector es aplicable para este método PCR de 2 y 3 pasos.
2. Basado en elección del vector, seleccionar enzimas de restricción apropiadas para la clonación.

2. primer diseño por sitio dirigido mutagénesis

1. Decidir entre bien la estrategia PCR paso 2 o 3 pasos (paso 2 es sólo para las mutaciones < 200 bp de cualquiera de los extremos de la DNA de interés). Para la PCR de 2 pasos, vaya al paso 2.2 y para la PCR de 3 pasos, vaya al paso 2.3.
2. Diseño de primers para PCR de 2 pasos.
   1. Diseño cartilla 1 y 3 p....

Resultados

Interacción del RNA con respecto a la regulación postranscripcional de csgD, fue elegida una configuración de doble vector: uno para expresar el csgD ARNm y otra para expresar el pequeño ARN no codificante, McaS. csgD fue reproducido en pBAD33, que es un plásmido arabinosa de la copia medio inducible con resistencia a cloranfenicol y McaS fue clonado en mini pNDM220 R1, que es un plásmido de copia baja inducible β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) isopropílico con.......

Discusión

Mutagénesis sitio-dirigida tiene una amplia gama de aplicaciones, y aquí, se incluyeron como ejemplos de cómo hacer conclusiones biológicas mediante la técnica de los resultados representativos de un experimento in vitro y en vivo. Mutagénesis sitio-dirigida ha sido durante mucho tiempo el estándar de oro para los estudios de interacción de la RNA. La fuerza de la técnica radica en la combinación de la introducción de mutaciones relevantes con posteriores ensayos y experimentos (por ejemplo, western blot o EMSA) para sac.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-GroEL producido en conejo	Merck	G6532	Anticuerpo primario
Azure c200	Azure	NA	Estación de trabajo de imágenes
gel Oligo de ADN personalizado	Merck	VC00021
DeNovix DS-11 DeNovix		NA	Espectrofotómetro para mediciones de ácidos nucleicos
Colorante de carga de gel de ADN (6X)	Thermo Scientific	R0611
Solución de bromuro de etidio 1 %	Carl Roth	2218.1
Kit de extracción de gel GeneJET	Thermo Scientific	K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix	Fermentas	SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi	Gerard Biotech	TO12	Tubos de diálisis para electroelución
MEGAscript T7 Kit de transcripción	Invitrogen	AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-Rad	1704406	Sistema de electroforesis horizontal
Anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG M2 producido en ratón	Merck	F3165	Anticuerpo primario
Inmunoglobulinas de ratón	Dako Citomatación	P0447	HRP Anticuerpo secundario conjuncionado
NucleoSpin miRNA	Macherey Nagel	740971	purificación de ARN
NuPAGE 4-12% Gel de proteína Bis-Tris	Geles Thermo Scientific	NP0323BOX	Bis-Tris para la separación de proteínas
Phusion Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad con tampón HF	Nueva Inglaterra Biolabs	M0531S	ADN polimerasa
PowerPac HC Fuente de alimentación de alta corriente Bio-Rad		1645052
Conejo Inmunoglobulinas	Dako Citomatación	P0448	HRP conjuncionada anticuerpo secundario
SeaKem LE Agarosa	Lonza	50004
SigmaPlot	Systat Software Inc	NA	Herramienta de software de análisis de datos y gráficos
T100 Termociclador	Bio-Rad	1861096	máquina de PCR
T4 ADN ligasa New	England Biolabs	M0202	Ligasa
T4 Polinucleótido quinasa	New England Biolabs	M0201S
Tampón TAE (Tris-acetato-EDTA) (50X)	Thermo Scientific	B49

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