Summary
Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ácido desoxirribonucleico (ADN). Este protocolo describe cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con un 2-paso y enfoque, que es aplicable a cualquier fragmento de ADN de interés basado en la reacción en cadena de polimerasa de 3 pasos (PCR).
Abstract
Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ADN para investigar la interacción entre moléculas de ácido ribonucleico (sRNA) no codificante pequeñas y destino mensajero RNAs (mRNAs). Además, mutagénesis sitio-dirigida se utiliza para asignar sitios de unión de la proteína específica a RNA. Se describe una introducción de PCR basado en 2 pasos y 3 pasos de mutaciones. El enfoque es relevante para todos los estudios de interacciones RNA-RNA y proteína-RNA. En definitiva, la técnica se basa en el diseño de cartillas con la mutación deseada y a través de 2 o 3 pasos de PCR sintetizar un producto PCR de la mutación. El producto PCR entonces se utiliza para la clonación. Aquí, describimos cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con el enfoque de paso 2 y 3 para introducir mutaciones la sRNA, McaS y el mRNA, csgD, para investigar interacciones RNA-proteína y ARN-ARN. Aplicamos esta técnica para investigar las interacciones RNA; sin embargo, la técnica es aplicable a todos los estudios de mutagénesis (por ejemplo, las interacciones DNA proteína, aminoácido sustitución/supresión/adición). Es posible introducir a cualquier tipo de mutación excepto bases no natural pero la técnica sólo es aplicable si un producto PCR se puede utilizar para uso aguas abajo (por ejemplo, clonación y plantilla para más PCR).
Introduction
ADN se refiere a menudo como el plan de acción de una célula viva ya que todas las estructuras de la célula están codificadas en la secuencia de su ADN. Replicación exacta y mecanismos de reparación del ADN aseguran que se producen sólo muy bajas tasas de mutaciones, que es esencial para mantener la correcta funciones de genes codificados. Los cambios de la secuencia del ADN pueden afectar funciones sucesivas en diferentes niveles a partir de ADN (reconocimiento de factores de transcripción y las enzimas de restricción), entonces RNA (complementariedad de pares de base y alteraciones de la estructura secundaria) o proteínas (aminoácidos ácido sustituciones, supresiones, adiciones o cambios de marco). Mientras que muchas mutaciones no afectan significativamente la función gene, algunas mutaciones en el ADN pueden tener implicaciones enormes. Así, la mutagénesis sitio-dirigida es una valiosa herramienta para el estudio de la importancia de sitios específicos del ADN en todos los niveles.
Este protocolo describe un enfoque de mutagénesis dirigida utilizado para introducir mutaciones específicas. El protocolo se basa en dos estrategias diferentes de la polimerización en cadena: un paso de 2 o un PCR de 3 pasos. La PCR de 2 pasos es aplicable si la mutación deseada está cerca del extremo 5' o el extremo 3' del ADN de interés (< 200 pares de bases (bp) desde el extremo) y la PCR de 3 pasos es aplicable en todos los casos.
En el enfoque PCR de 2 pasos, 3 cartillas están diseñados, en la que está diseñado un conjunto de iniciadores para amplificar el ADN de interés (cartillas 1 y 3, adelante y atrás, respectivamente) y una sola cartilla está diseñada para incorporar la mutación. La mutación de la introducción de la cartilla (cartilla 2) debe tener una orientación inversa, si la mutación está cerca del extremo 5' y una orientación hacia adelante si la mutación es cerca del extremo 3'. En el primer paso de la polimerización en cadena, cartilla 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un fragmento pequeño cerca del extremo 5' o 3' final, respectivamente. El producto resultante de la polimerización en cadena se utiliza entonces como una cartilla en el paso dos con la cartilla de 1 o 3, lo que resulta en un producto PCR con una mutación en el ADN de interés (figura 1A).
En la PCR 3 pasos, 4 cartillas están diseñados, en la que está diseñado un conjunto de iniciadores para amplificar el ADN de interés (cebadores 1 y 4, adelante y atrás, respectivamente) y un conjunto de iniciadores está diseñado para incorporar mutaciones específicas con la superposición de complementariedad (cartillas 2 y 3, atrás y adelante, respectivamente). En el paso uno y dos, cartillas 1 + 2 y 3 + 4 amplifican el extremo 5' y 3'. En el paso tres, los productos resultantes de la polimerización en cadena del paso uno y dos se utilizan como plantillas y amplificado con cebadores 1 + 4. Así, el producto resultante de la polimerización en cadena es el ADN de interés con la mutación deseada (figura 1B).
Mientras que el ADN mutado puede usarse para cualquier aplicación posterior, este protocolo describe cómo volver a combinar el ADN en un vector de clonación. El uso de vectores de clonación tiene varias ventajas tales como facilidad de clonación y aplicaciones experimentales específicas dependiendo de características del vector. Esta función se utiliza a menudo para estudios de interacción de la RNA. Otra técnica para estudios de interacción de la RNA es sondear estructural del ARN en complejo con otro RNA1,2 o proteína3,4. Sin embargo, sondeo estructural sólo se realiza in vitro mientras que mutagénesis sitio-dirigida y posterior clonación permiten estudios de interacción in vivo.
Mutagénesis dirigida se ha utilizado extensivamente para estudios de interacción de la RNA presentada aquí. Sin embargo, el método clave acerca de 2 - o 3-step PCR es aplicable a cualquier pieza de ADN y así no sólo se limita a los estudios de interacción de la RNA.
Para ejemplificar la técnica y sus posibles usos, se utiliza la caracterización de las regiones importantes para la regulación postranscripcional de la ARNm, csgD, de Escherichia coli (e. coli). En e. coli, csgD es dirigida por el pequeño ARN no codificante, McaS, en cooperación con una proteína Hfq, para reprimir la expresión de la proteína CsgD2,4,5. La técnica se utiliza para introducir mutaciones en la región de bases entre csgD y McaS y el sitio de unión de Hfq de csgD. El ADN obtenido luego se clona en un vector adecuado para experimentos posteriores. Aplicaciones posteriores de la técnica incluyen experimentos tanto in vivo como in vitro. Para Ilustración, caracteriza en vivo usando un análisis de western blot ejemplo 1 y ejemplo 2 se caracteriza in vitro usando un análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA). En ambos casos, es ilustrada cómo dirigida mutagénesis puede utilizarse en combinación con otras técnicas para establecer conclusiones biológicas sobre un gen de interés.
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Protocol
1. selección de vector
- Elegir un vector para realizar experimentos posteriores con. Cualquier vector es aplicable para este método PCR de 2 y 3 pasos.
- Basado en elección del vector, seleccionar enzimas de restricción apropiadas para la clonación.
2. primer diseño por sitio dirigido mutagénesis
- Decidir entre bien la estrategia PCR paso 2 o 3 pasos (paso 2 es sólo para las mutaciones < 200 bp de cualquiera de los extremos de la DNA de interés). Para la PCR de 2 pasos, vaya al paso 2.2 y para la PCR de 3 pasos, vaya al paso 2.3.
- Diseño de primers para PCR de 2 pasos.
- Diseño cartilla 1 y 3 para amplificar el ADN de interés y con 5' de la proyección contiene 4 nucleótidos (por ejemplo, ATAT o AGCT) seguidos por el sitio de reconocimiento de restricción relevante necesario para clonar en el vector elegido.
- Diseño de cartilla 2 presentar mutación en el sitio deseado y flanquean la mutación con 10 a 15 nucleótidos complementarios en ambos lados. Hacer la cartilla reversa si la mutación se introduce en el extremo 5' o hacia adelante si la mutación se introduce en el extremo 3'.
- Diseño de primers para PCR de 3 pasos.
- Diseño cartilla 1 y 4 para amplificar el ADN de interés y con 5' de la proyección contiene 4 nucleótidos (por ejemplo, ATAT o AGCT) seguidos por el sitio de reconocimiento de restricción relevante necesario para clonar en el vector elegido.
- Diseño de cartilla 2 y 3 presentar mutación en el sitio deseado (s) y la mutación del flanco por 10 a 15 nucleótidos complementarios en ambos lados. Cartilla 2 y 3 son inversa complementaria.
3. amplificación por PCR salvaje del tipo de ADN para clonación
Nota: Para más detalles sobre la polimerización en cadena, ver6.
- PCR6 usando las cartillas 1 + 2 (2-step PCR) o 1 + 4 (PCR de 3 pasos) y DNA de tipo salvaje como plantilla para obtener PCR producto I. uso el programa PCR en la tabla 1.
- Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa.
- Hacer un agarose gel solución (2%) mediante la adición de 2 g de agarosa por 100 mL de 1 x Tris-acetato-etilendiaminotetracético ácido (EDTA) (TAE) almacenador intermediario. Disolver la agarosa por ebullición en el microondas. Añadir el bromuro de etidio colorante tinción de DNA (a una concentración final de ~ 0,5 μg/mL) solución para la visualización del gel a la agarosa.
- Gel de agarosa del molde, colocarlo en una unidad de electroforesis y cargar muestras PCR (mezcladas con el tinte de la carga de ADN) y una escalera de ADN de tamaño conocido. Ejecutar ejemplos 75 W por 45 min o hasta que las bandas se separan adecuadamente y visualizar las bandas en una mesa a ultra violeta (UV) o con un gel sistema de imagen.
- Purificar el producto PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).
- Almacenar el ADN purificado a-20 ° C (en tampón Tris-EDTA (TE)-almacenamiento a largo plazo) o a 4 ° C (dH2O – almacenamiento de corto plazo) hasta utilizado en el paso 5.
4. PCR para introducir mutaciones sitio-dirigida de la DNA
- PCR para PCR de 2 pasos (ver paso 4.2 para PCR de 3 pasos)
- Realizar PCR6 usando las cartillas 1 + 2 si las mutaciones están en el extremo 5' o 2 + 3 si las mutaciones están en los 3' extremo y utilizar DNA de tipo salvaje como plantilla para obtener el producto de PCR II (ver tabla 1 para el programa PCR).
- Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.
- Purificar el producto PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).
- Tienda purificado ADN a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O) hasta utilizado en el paso 5.
- Realizar PCR6 usando el producto de PCR II como la cartilla junto con cartilla 3 si las mutaciones están en el extremo 5' o cartilla 1 si las mutaciones están en el extremo 3' y usan la DNA de tipo salvaje como plantilla para obtener el producto de PCR III (ver tabla 1 para el programa PCR).
- Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.
- Purificar el producto de PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).
- Tienda purificado ADN a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O) hasta el paso 5.
- PCR para PCR de 3 pasos
- Realizar PCR6 usando las cartillas 1 + 2 y 3 + 4 en reacciones separadas y usar DNA de tipo salvaje como plantilla para obtener el producto de PCR II y III (ver tabla 1 para el programa PCR).
- Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.
- Purificar productos PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).
- Tienda purificado ADN a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O).
- Polimerización en cadena6 usando las cartillas 1 + 4 y 2-5 ng de ambos productos de la polimerización en cadena II y III como las plantillas (en la misma reacción) obtener PCR producto IV (ver tabla 1 para el programa PCR).
- Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.
Nota: No es inusual conseguir varias bandas incorrecta (se puede a veces reducir con menos plantilla). Sin embargo, los productos PCR incorrecta pueden ser ignorados si la banda de tamaño correcto es suprimida y gel extraído. - Si es correcta, purificar productos PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).
- Tienda purificado ADN a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O) hasta el paso 5.
5. recombinación de tipo salvaje y mutantes versiones de DNA en el vector elegido
Nota: Para información sobre pasos, ver7.
- Digest purificar productos de PCR I y III (de PCR de 2 pasos) o IV (del paso 3 polimerización en cadena) usando las enzimas de restricción relevantes.
- En 20 μl de 1 x de buffer de digestión con 1 μl de cada enzima de restricción, digest 200 ng del producto de PCR a 37 ° C durante 30-60 minutos.
- Purificar el producto PCR digerido por extracción de gel utilizando un kit de extracción de gel (Tabla de materiales), medir la concentración de ADN de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales) y almacenar a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (en dH2 O) hasta que paso 5.6.
- Digerir vector purificado con las enzimas de restricción y tratar con fosfatasa alcalina para disminuir eventos de vector a la ligadura. No tratar a los productos PCR con fosfatasa alcalina.
- En 30 μl de 1 x de tampón de digestión con 1 μl de cada enzima de restricción y 1 μl de la fosfatasa alcalina, digest 1.000 ng del vector a 37 ° C durante 30-60 minutos.
- Vector digerido separada de ADN basura (por ejemplo, vector sin cortar y corte de ADN) mediante electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.
- Purificar el vector digerido por extracción de gel utilizando un kit de extracción de gel (Tabla de materiales), medir la concentración de ADN de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales) y almacenar a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O) hasta que paso 5.6.
- Ligar los productos PCR digeridos en vector digerido con las reacciones que se especifica en la tabla 2.
- Incubar a temperatura ambiente durante 2 h o noche a la mañana a 16 ° C.
- Transformar la tensión receptora (por ejemplo, e. coli K12) con reacciones de ligadura.
- Crece tensión en OD600= 0.3-0.5 y transferir 1 mL de la cultura a tantos tubos de 1,5 mL como reacciones de ligasa.
- Centrifugado a 3.500 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
- Resuspender las células en 200 μL de tampón de transformación (10 mL de caldo de lisogenia (LB) con 0,1 g/mL polietilenglicol 3350, 5% dimetil sulfato y 20 mM MgCl2).
- Agrega reacción de la ligadura y coloque los tubos en hielo durante 30 minutos.
- Choque térmico por 2 min a 42 ° C.
- Añadir 1 mL de LB en los tubos de 1.5 mL y permiten la expresión fenotípica de la resistencia a los antibióticos durante al menos 45 min a 37 ° C.
- Girar las células a 3.500 x g durante 5 min., descartar 1 mL de sobrenadante y resuspender las células en el sobrenadante restante.
- Las células en las placas de la placa con los antibióticos apropiados e incubar durante una noche a 37 ° C.
- Identificar transformantes que vectores con éxito de la integración del inserto de ADN (por ejemplo, por PCR usando las cartillas específicas vector e insertar).
- Validar la secuencia de DNA sanger secuenciación.
PRECAUCIÓN: No utilice los mismos cebadores de secuencia como paso 5.9.
6. usando vectores construidos para los experimentos in vitro o in vivo
- Experimento in vivo
Nota: Este es un ejemplo de la utilización de un vector para expresar tipo salvaje/mutado RNA para caracterizar la regulación postranscripcional. Para más detalles sobre western blot, ver8.- Cepas de e. coli K12 con vectores construidos en medio apropiado e inducen la expresión si es necesario. Recolección de muestras por centrifugación.
- Preparar muestras para la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE) por disolver el pellet celular en 1 x de tampón de SDS (62,5 mM Tris-HCl de pH 6.8, 2.5% SDS, azul de bromofenol 0,002%, 5% β-mercaptoetanol, glicerol al 10%) y hierve a 95 ° C por 5 min.
Nota: Es posible emitir un gel o un gel prefabricado disponible en el mercado. El último fue utilizado en los resultados presentados en la figura 3 (Tabla de materiales). - Carga 107 células de cada muestra en pocillos distintos (incluye una escalera de proteína) y corren gel 200 V hasta que las proteínas se separan (aproximadamente 45 minutos).
- Blot las proteínas a una membrana de celulosa por transferencia semiseco en 80 mA durante 1 hora.
- Bloquear la membrana con una mezcla de proteínas (por ejemplo, 5% leche-polvo disuelto en 1 x Tween 20-Tris-buffer salina (TTBS) solución tampón).
- Añadir el anticuerpo primario (disuelto en 1 x TTBS solución tampón) que apuntar de la proteína del interés (e.g., GFP, bandera o HIS-tagged proteína) e incubar durante 1 h con agitación suave.
- Lavar la membrana en 1 x TTBS durante 10 min para eliminar los anticuerpos no Unidos. Repetir dos veces más.
- Añadir el anticuerpo secundario (disuelto en 1 x TTBS solución tampón) que se dirige a los anticuerpos primarios y permiten la detección (por ejemplo, con peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado anticuerpos secundarios. Incubar durante 1 h con agitación suave.
- Lavar la membrana en 1 x TTBS durante 10 min para eliminar los anticuerpos no Unidos. Repetir dos veces más.
- Visualizar la membrana con una técnica compatible con los anticuerpos secundarios (por ejemplo, por proyección de imagen después de la incubación con un derivado luminol QL, si se utilizó un anticuerpo secundario conjugado con HRP).
- Experimento in vitro
Nota: Este es un ejemplo de usar el vector como una plantilla para la transcripción in vitro de ARN para caracterizar las interacciones RNA-proteína. Para obtener más información sobre EMSA, ver9.- Hacer la transcripción in vitro utilizando un T7 en vitro kit de transcripción (Tabla de materiales) y vectores en el paso 5 como plantillas.
- Transcritos de RNA por página de un 4.5% de urea de 7 M desnaturalización gel de separar y extraer RNA directamente el gel por elución del electro con los tubos de diálisis (Tabla de materiales).
- RNA de la etiqueta (por ejemplo, radiolabeling con γ -32P-ATP utilizando cinasa T4 Polinucleótido (Tabla de materiales) y purificar nuevamente con columnas (Tabla de materiales).
PRECAUCIÓN: Antes de trabajar con material radiactivo, consulte con el oficial de seguridad de radiación local. - La mezcla RNA etiquetados con el aumento de las concentraciones de proteína en diferentes reacciones en un 1 x de tampón de unión (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM Ditiotreitol (DTT)).
Nota: en los resultados presentados (figura 4), 2 nM de radiactivo csgD mRNA fue mezclado con un gradiente de la proteína de Hfq de 0 a 2 μm (concentración de monómero). - Que proteínas y ARN para hibridar antes de cargar la mezcla de hibridación en gel de poliacrilamida no desnaturalizantes y correr el gel durante 1,5 h a 200 V.
- Visualizar el gel con una técnica compatible con el etiquetado de paso 6.1.3. (p. ej., por phosphoimaging si radiolabeling se aplicó).
- Cuantificar la intensidad relativa de las bandas cambiadas de puesto con un programa de procesamiento de la proyección de imagen y ajuste de una curva (sigmoidal) a los datos mediante el uso de un gráfico y software de análisis de datos (Tabla de materiales). Basado en la curva cabida, la valores de constantes de disociación (Kd) se puede determinar automáticamente con el software.
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Representative Results
Interacción del RNA con respecto a la regulación postranscripcional de csgD, fue elegida una configuración de doble vector: uno para expresar el csgD ARNm y otra para expresar el pequeño ARN no codificante, McaS. csgD fue reproducido en pBAD33, que es un plásmido arabinosa de la copia medio inducible con resistencia a cloranfenicol y McaS fue clonado en mini pNDM220 R1, que es un plásmido de copia baja inducible β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) isopropílico con resistencia a la ampicilina. Tipo salvaje csgD fue PCR amplificado con cebadores 1A y 4A (4A incluye una secuencia de bandera) a IA de producto PCR, mientras que tipo salvaje McaS PCR amplificado utilizando primers 1B y 4B para rendimiento producto de la polimerización en cadena del IB. Se utilizó la estrategia PCR de 3 pasos para introducir sustituciones en la región de bases predicha de csgD y McaS. En los dos primeros pasos, productos de la PCR IIA y IIIA fueron sintetizados usando primers 1A, 2A y 3A + 4A, respectivamente. En el tercer paso, producto de la polimerización en cadena IVA fue sintetizado utilizando productos de la PCR IIA y IIIA como plantilla y 1A y 4A como primers (figura 2A). Asimismo, mutaciones sitio-dirigida complementarias fueron introducidas en McaS, utilizando primers 1B, 2B, 3B y 4B para productos de PCR IIB, IIIB en los primeros dos pasos y IVB en el tercer paso (figura 2A). pBAD33 y IA y IVA los productos PCR fueron digeridos con BamHI y PstI y digerido IVA y IA eran ligarse en pBAD33 digerido. Las construcciones resultantes fueron nombradas pBAD csgDbandera y pBAD csgD63-66FLAG (transformado en posición 63-66 en relación con el sitio de inicio transcripcional). pNDM220 y productos PCR del IB y IVB fueron digeridos con AatII y BamHI y digerido IB y IVB se unen en pNDM220 digerido. Construcciones resultantes fueron nombradas pNDM mcaS y mcaS pNDM42-45 (transformado en posición 42-45 en relación con el sitio de inicio transcripcional).
Para analizar el efecto de las mutaciones, las cepas de e. coli albergar la pBAD csgDbandera o pBAD csgD63-66FLAG y pNDM220, pNDM mcaS o McaS pNDM42-45 fueron cultivadas en M9 medio mínimo suplementado con 0.2% de glicerol a OD 450 de 0.4. Expresión de los vectores de pNDM entonces fue inducido durante 10 minutos por la adición de 1 mM IPTG seguida de inducción de 5 min de los vectores pBAD por adición de arabinosa 1 mM. En este punto, se cosecharon muestras y mancha blanca /negra occidental análisis fue realizado con las muestras recolectadas. Mientras que la expresión de tipo salvaje McaS impide la traducción de tipo salvaje CsgD, introducción de mutaciones en CsgD o McaS alivia la represión observada. Sin embargo, cuando las mutaciones se complementan en la represión traduccional CsgD y McaS de CsgD es restaurado (figura 3; modificada de2). Así, el enfoque mutacional dirigida apoya la hipótesis McaS y csgD -pares de bases en esta región.
El vector de pBAD33 fue elegido para el experimento in vivo y también fue utilizado para la introducción de mutación sitio-dirigida a investigar Hfq-enlace a la csgD mRNA in vitro. Dirigida de mutaciones fueron introducidas con la estrategia PCR de 2 pasos para generar a csgD mutante RNAs con estructuras primarias y secundarias alteradas al transcribir. Cartillas 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F y 2G fueron utilizados para amplificar e introducir mutaciones en el extremo 5' de csgD. Los productos resultantes de la polimerización en cadena (IIC, IID, IIE, IIF y IIG) fueron utilizados como plantillas con cartilla 3 ampliar e introducir mutaciones a la entera csgD ADN (figura 2B). Los productos resultantes de la polimerización en cadena (IIIC IIID, IIIE, IISI y IIIG) fueron clonados en pBAD33 como se describe anteriormente. Transcripción in vitro fueron transcritas con la T7 RNA-polimerasa: en primer lugar, se sintetizaron productos de PCR con primers 5A, 5C, 5D, 5E, 5F o 5 + 6 utilizando los vectores construidos como plantilla. Los productos PCR obtenidos fueron utilizados como plantillas para la RNA-polimerasa de T7. En vitro transcritos csgD tipo de salvaje y mutante RNAs fueron purificadas, radiactivos y mezcladas con concentraciones cada vez mayor de Hfq purificada. Las reacciones de hibridación se ejecute en geles no desnaturalizantes y visualizadas. El aumento de Kd-valores de los alelos mutantes demuestra que Hfq se une menos eficientemente a los mutantes. Además, Hfq tiene varios sitios de Unión en csgD que se muestra en los 3 turnos para el tipo salvaje RNA. Sin embargo, se observan sólo 2 sitios de Unión para el mutante diferentes RNAs (figura 4; modificado de4). Así, el enfoque mutacional dirigida identifica estructuras primarias y secundarias de csgD mRNA que son importantes para la Unión completa de Hfq.
Tomados en conjunto, es posible realizar mutagénesis sitio-dirigida con un enfoque PCR de 2 o 3 pasos en combinación con análisis posteriores para establecer conclusiones biológicas sobre la regulación de los genes en el nivel postranscripcional así como las interacciones proteína-RNA .
| Paso | Temperatura | hora |
| Desnaturalización inicial | 98° C | 2 min |
| Desnaturalización | 98° C | 10 s |
| De recocido | 55° C | 10 s |
| Extensión | 72° C | 15 s |
| (30 ciclos) | ||
| Extensión final | 72° C | 5 min |
| Mantenga | 4 ° C |
Tabla 1: Programa PCR
| Reactivo de | Reacción de control | reacción de fmol 20 | reacción de 100 fmol |
| 10 x buffer ligasa | 2 ΜL | 2 ΜL | 2 ΜL |
| Digiere ADN vector | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Producto PCR digerido | fmol 0 | fmol 20 | 100 fmol |
| H2O | A 19 μl | A 19 μl | A 19 μl |
| Ligasa | 1 ΜL | 1 ΜL | 1 ΜL |
Tabla 2: Reacciones de ligadura
| Nombre de la cartilla | Secuencia de | Utilizado para - mutaciones | ||
| 2-1 o 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - y 3-ronda PCR en csgD | ||
| 2-3A o 4A 3 | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - y 3-ronda PCR en csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3-ronda PCR en csgD – sustitutos 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3-ronda PCR en csgD – sustitutos 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3-ronda PCR en McaS | ||
| 3-4B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3-ronda PCR en McaS | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 3-ronda PCR en McaS – sustitutos 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3-ronda PCR en McaS – sustitutos 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2-ronda PCR en csgD – elimina 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | 2-ronda PCR en csgD – sustitutos 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-ronda PCR en csgD – elimina 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-ronda PCR en csgD – elimina 9 nt y sucedáneos 7 nt | ||
| 2-2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-ronda PCR en csgD – elimina 9 nt y sucedáneos 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tabla 3: Cartillas para mutagénesis sitio-dirigida y síntesis de plantilla T7
Negrita: sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (BamHI, PstI y AatII)
Subrayado: mutaciones de nucleótido
Figura 1: estrategia PCR para la mutagénesis sitio-dirigida. A) tres cartillas se utilizan en el enfoque PCR de 2 pasos para introducir mutaciones sitio-dirigida a un gen de interés. Cartillas 1 y 3 amplifica el gen (producto de PCR), mientras que la cartilla 2 introduce mutaciones específicas (*). Pares de cartilla 1 + 2 amplifica un fragmento pequeño en cada extremo de la DNA de interés para sintetizar el producto de PCR II (paso 1). El producto resultante de la polimerización en cadena se utiliza entonces como una imprimación junto con cartilla 3 para sintetizar el producto de PCR III con la mutación del sitio dirigido incorporada (paso 2). B) cuatro cartillas se utilizan en el método PCR 3 pasos para introducir mutaciones sitio-dirigida a un gen de interés. Cartillas 1 y 4 amplifica el gen (producto de PCR), mientras que los cebadores de 2 y 3 presenta mutaciones específicas (*). Pares de cartilla 1 + 2 y 3 + 4 se utilizan en los dos primeros pasos de la PCR para sintetizar el producto de PCR II y III (paso 1 y 2). En el tercer paso, productos PCR II y III se utilizan como plantilla con par de la cartilla 1 + 4 para sintetizar PCR producto IV con la dirigida mutación incorporada (paso 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: productos de la PCR de mutagénesis sitio-dirigida. Se realizaron PCRs con iniciadores y plantillas como se describe en el texto. Productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio (~ 0,5 μg/mL) con 1 μg de escalera de ADN mezcla (Tabla de materiales). Bandas de tamaño correcto están marcados con un cuadrado rojo. A) en la mayoría de las reacciones de PCR es visible solamente una venda del tamaño correcto. Sin embargo, la reacción de PCR IVB tiene dos bandas visibles de que la banda superior (justo por encima de 300 bp) tiene la longitud correcta. Como era de esperar, la suma de la longitud de los productos PCR II y IIIC igual a la longitud de los productos PCR I y IV (productos PCR csgD A:, B: McaS PCR, I: tipo salvaje csgD/McaS amplificado mediante cartillas 1A/B + 4A/B, II + III: PCR productos intermedios amplificado con cebadores 1A/B + 2A/B y B + 4A/3A/B, respectivamente, IV: transformado producto de PCR amplificado con cebadores 1A/B + 4A/B los productos PCR intermedios II y III como plantillas). En todas las reacciones de PCR es visible solamente una venda del tamaño correcto. En este caso, casi todas las moléculas de los productos PCR que II añadido a reacciones de PCR III fueron utilizadas para sintetizar los productos PCR III. Sólo para PCR IIIE es producto de la polimerización en cadena IIE aún visible (IA: tipo salvaje csgD producto de PCR amplificado mediante cartilla 1A + 3A, CII-G: intermedios productos PCR amplificados usando la cartilla 1A + C 2-G, IIIC-G: mutado PCR Productos amplificados con cartilla 3A IA los productos PCR y G-CII como plantillas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: experimento In vivo con csgD dirigida y mutantes de McaS. Mancha blanca /negra occidental análisis de cepas que indican vectores. Cepas fueron cultivadas a fase exponencial e inducidas por 10 min con 1 mM IPTG (McaS) seguido por la inducción de 5 min con arabinosa 1 mM (csgD). Α-bandera anticuerpos fueron utilizados para orientar el CsgD tagged bandera y α-GroEL anticuerpos fueron utilizados para atacar la proteína GroEL (diluido 10.000 y 50.000 veces, respectivamente) del servicio de limpieza. Anticuerpos de ratón y conejo conjugado con HRP fueron usados como anticuerpos secundarios (2.000 veces diluidos). Esta figura ha sido modificada desde2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: In vitro experimento con dirigida csgD mutantes. EMSA csgD transcrito in vitro tipo salvaje (WT) y RNAs del mutante (Panel C-G) con respecto a enlace Hfq. Los alelos csgD (WT y mutante C-G) fueron radiactiva y mezclados con 0, 0.25, 0.5, 1 ó 2 μm monomérica Hfq. hibridación reacciones se corrieron en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. Se cuantificó la intensidad relativa de las bandas cambiadas de puesto y una curva sigmoidea se ajustó a los datos. La valores de constantes de disociación (Kd) se determinaron utilizando SigmaPlot. Esta cifra se modificó de4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mutagénesis sitio-dirigida tiene una amplia gama de aplicaciones, y aquí, se incluyeron como ejemplos de cómo hacer conclusiones biológicas mediante la técnica de los resultados representativos de un experimento in vitro y en vivo. Mutagénesis sitio-dirigida ha sido durante mucho tiempo el estándar de oro para los estudios de interacción de la RNA. La fuerza de la técnica radica en la combinación de la introducción de mutaciones relevantes con posteriores ensayos y experimentos (por ejemplo, western blot o EMSA) para sacar conclusiones sobre sitios específicos del ADN y su importancia en las funciones de los productos del gene en pregunta. Cuando se decide hacer la mutagénesis sitio-dirigida, el diseño de los primers debe cuidadosamente planificado para obtener el máximo provecho de la técnica (por ejemplo, qué sitios de mutar); Asegúrese de la correcta voladizos y sitios de restricción y prestar atención a las características de la cartilla/plantilla.
La mutagénesis real descrita en el presente Protocolo se basa en la PCR. La parte más importante del protocolo es, por tanto, las condiciones para ello. Hay varias formas de optimizar la polimerización en cadena, incluyendo gradientes de concentraciones de Mg2 + , concentración de DMSO y temperaturas del paso de recocido. Para más detalles, véase3. Además de la optimización de la reacción de PCR sí mismo, son dos cosas merece la pena hacer seguro al realizar mutagénesis sitio-dirigida: plantillas de alta calidad y cuidadosamente diseñados primers.
Tener una plantilla de alta calidad para PCR a menudo hace la diferencia entre una PCR fallida y exitosa. Mientras que es posible utilizar un lisado celular para proporcionar la plantilla de la DNA, DNA purificado (genómica-, vector o PCR-DNA) siempre es preferible. Además, cuando se trata de la cantidad de plantilla, muchas veces menos es más; especialmente en el último paso de la PCR de 3 pasos (paso 4.2.5). Por ejemplo, tratar una serie de diluciones de 10 x de plantilla para encontrar el óptimo si es necesario.
Primer óptimo diseño depende de las características del ADN de interés y de la polimerasa. Siempre que sea posible, trate siempre de diseñar primers en consecuencia. Sin embargo, en muchos casos cartillas deben estar diseñadas en un sitio específico y por lo tanto no podrían ser diseñadas según criterios específicos. En esos casos, podría ser necesario hacer más optimización de la PCR condiciones en su lugar (ver arriba y protocolo PCR6), pero con las condiciones adecuadas incluso difíciles PCRs son generalmente acertados.
Varios métodos alternativos para sitio dirigen mutagénesis están disponibles, como método10 de Kunkel, todo plásmido mutagénesis11, de mutagénesis del cassette12, síntesis de novo gen CRISPR13,14.
Método de Kunkel y mutagénesis de plásmido todo se basa en el ADN de interés ya están en un plásmido (vector) y cartillas utiliza para sintetizar una hebra o cadena doble de ADN mutado, respectivamente. En ambas técnicas, el plásmido todo está siendo sintetizada y utilizada para la transformación, mientras que la PCR de 2 o 3 pasos sólo sintetiza la pieza de DNA de interés. Una desventaja de la polimerización en cadena, de 2 o 3 pasos es que el ADN de interés debe ser sintetizado dos veces, aumentando el riesgo de mutaciones en el mismo. Por otra parte, el plásmido no debe sintetizarse, disminuyendo el riesgo de mutaciones aquí en su lugar. Además, con el 2 - o 3-step PCR, una variante de tipo salvaje no necesita ser clonado en un vector de antemano, disminuyendo el tiempo de clonación por varios días.
Mutagénesis del cassette no se basa en el uso de cartillas o polimerasas. En cambio, un pequeño fragmento de ADN es de novo sintetizado e incorporado en el ADN de interés con el uso de enzimas de restricción. Este método, sin embargo, se basa en la presencia de sitios de restricción adecuados cerca del lugar deseado, que no siempre está presente. Este enfoque también requiere que la variante de tipo salvaje para ser clonados en el vector previamente, aumentando el tiempo de clonación en comparación con el método PCR de 2 o 3 pasos.
Con la disminución de los costos de la síntesis de novo gen (grandes fragmentos de ADN), se está convirtiendo en cada vez más asequible para introducir mutaciones al ordenar la secuencia deseada comercialmente. Sin embargo, este método es todavía costoso en comparación con los otros métodos mencionados. En el momento de la escritura de novo síntesis es aproximadamente 3 veces más caro que el método presentado aquí.
Otra opción emergente es el muy esperado método CRISPR para las alteraciones del genoma. Este método es muy eficiente y adaptable en comparación con otras técnicas utilizadas para las células eucariotas. Sin embargo, con relativa facilidad y muchas técnicas disponibles para la clonación en el organismo más simple como las bacterias, CRISPR raramente es más conveniente que la clonación convencional. Por lo tanto, la utilidad de CRISPR depende sobre todo el organismo en estudio.
Al elegir hacer mutagénesis sitio-dirigida, es importante diseñar cuidadosamente; tanto con respecto a posteriores aplicaciones de la técnica real utilizada. El método PCR de 2 y 3 paso descrito aquí es aplicable a casi cualquier estudio de mutación y con su bajo costo es adecuado para cualquier presupuesto de laboratorio.
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Disclosures
Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores desean dar las gracias a subvenciones de la política de acceso abierto Universidad de Dinamarca Meridional.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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