Summary
Nettstedet-rettet mutagenese er en teknikk som brukes til å introdusere spesifikke mutasjoner i deoksyribonukleinsyre (DNA). Denne protokollen beskriver hvordan området-rettet mutagenese med en 2-trinns og 3-trinns polymerasekjedereaksjons (PCR) basert tilnærming som gjelder for alle DNA del av interesse.
Abstract
Nettstedet-rettet mutagenese er en teknikk som brukes til å introdusere spesifikke mutasjoner i DNA å undersøke samspillet mellom små ikke-koding ribonukleinsyre (sRNA) molekyler og målet messenger RNAs (mRNAs). I tillegg brukes nettstedet-rettet mutagenese til å tilordne bestemte protein bindende områder til RNA. En 2-trinns og 3-trinns PCR basert innføring av mutasjoner er beskrevet. Tilnærmingen er relevant for alle protein-RNA og RNA-RNA samhandling studier. Kort sagt, avhengig teknikken designe primere med den ønskede mutation(s), og gjennom 2 eller 3 trinnene for PCR syntetisere et PCR produkt med mutasjon. PCR produktet brukes deretter for kloning. Her beskriver vi hvordan du utfører området-rettet mutagenese med både 2 - og 3-trinn tilnærming til å introdusere mutasjoner i sRNA, McaS og mRNA, csgD, å undersøke RNA-RNA og RNA-protein interaksjoner. Vi bruker denne teknikken for å undersøke RNA interaksjoner; teknikken er imidlertid gjelder for alle mutagenese studier (f.eks DNA-protein interaksjoner, aminosyre substitusjon/sletting/tillegg). Det er mulig å innføre noen form for mutasjon bortsett fra ikke-naturlige baser men teknikken gjelder bare hvis et PCR-produkt kan brukes for nedstrøms program (f.eks kloning og mal for ytterligere PCR).
Introduction
DNA er ofte referert til som blåkopi av en levende celle siden alle strukturer av cellen er kodet i sekvensen av sin DNA. Nøyaktig replikering og DNA reparasjon mekanismer sikrer at bare svært lave priser av mutasjoner oppstår, som er avgjørende for å opprettholde riktige funksjonene av kodet gener. Endringer av DNA sekvensen kan påvirke påfølgende funksjoner på ulike nivåer starter med DNA (anerkjennelse av transkripsjonsfaktorer og begrensning enzymer), deretter RNA (base-par komplementaritet og sekundær endringer) og/eller protein (aminosyre Acid erstatninger, sletting, tilleggene eller ramme-Skift). Mens mange mutasjoner ikke påvirker gen funksjon betydelig, kan noen mutasjoner i DNA har enorme implikasjoner. Dermed er området-rettet mutagenese et verdifullt verktøy for å studere betydningen av spesifikke DNA nettsteder på alle nivåer.
Denne protokollen beskriver en målrettet mutagenese tilnærming brukes til å introdusere spesifikke mutasjoner. Protokollen er avhengig av to forskjellige PCR strategier: en 2-trinns eller en 3-trinns PCR. 2-trinns PCR gjelder hvis ønsket mutasjon ligger 5' slutten eller 3 slutten av DNA av interesse (< 200 base parene (bp) fra slutten) og 3-trinns PCR gjelder i alle tilfeller.
I 2-step PCR tilnærming, 3 primere er utformet som en rekke primere er utviklet for å forsterke DNA av interesse (primere 1 og 3, fremover og bakover, henholdsvis) og en enkelt primer er utformet for å innlemme mutasjon. Mutasjon introdusere grunning (primer 2) bør ha en omvendt retning hvis mutasjon er 5' slutten og en forover retning hvis mutasjon ligger 3 slutten. I det første trinnet PCR forsterker primer 1 + 2 eller 2 + 3 et lite fragment nær 5' slutten eller 3 slutt, henholdsvis. PCR sluttproduktet brukes deretter som en primer i trinn to med primer 1 eller 3, dermed resulterer i et PCR-produkt med en mutasjon i DNA av interesse (figur 1A).
Den 3-trinns PCR, 4 primere er utformet, der ett sett med primere er utviklet for å forsterke DNA av interesse (primere 1 og 4 fremover og bakover, henholdsvis) og en rekke primere er utformet for å omfatte spesifikke mutasjoner med overlappende komplementaritet (primere 2 og 3, snu og videresende, henholdsvis). I trinn en og to, primere 1 + 2 og 3 + 4 forsterke 5' og 3 slutten. I trinn tre, de resulterende PCR produktene fra trinn en og to er stjernen og forsterket med primere 1 + 4. Dermed er PCR sluttproduktet DNA av interesse med ønsket mutasjon (figur 1B).
Mens mutert DNA kan brukes for alle nedstrøms søknad, beskriver denne protokollen hvordan å kombinere DNA i en kloning vektor. Bruk av kloning vektorer har flere fordeler som brukervennlighet kloning og bestemte eksperimentelle programmer avhengig av funksjoner av vektoren. Denne funksjonen brukes ofte for RNA samhandling studier. En annen teknikk for RNA samhandling studier er strukturelle undersøkelser av RNA i kompleks med en annen RNA1,2 eller protein3,4. Imidlertid utføres strukturelle undersøkelser bare i vitro mens området-rettet mutagenese og påfølgende kloning tillater samhandling studier i vivo.
Nettstedet-rettet mutagenese har vært mye brukt for RNA samhandling studier som presenteres her. Men den viktigste metoden om 2 eller 3-trinn PCR gjelder for ethvert stykke DNA, og dermed ikke bare begrenset til RNA-interaksjon studier.
Du eksemplifiserer teknikken og bruksområdene, brukes karakteristikk av regioner viktig for post-transcriptional regulering av mRNA, csgD, av Escherichia coli (E. coli). E. coli , csgD er rettet av små ikke-koding RNA, McaS, i samarbeid med en protein, Hfq, å undertrykke protein uttrykk CsgD2,4,5. Teknikken brukes til å introdusere mutasjoner base-sammenkobling området mellom csgD og McaS og Hfq binding området av csgD. Innhentet DNA er deretter klonet i en vektor egnet for senere eksperimenter. Nedstrøms programmer av teknikken omfatter både i vivo og in vitro eksperimenter. For illustrasjon, eksempel 1 er preget i vivo bruker en western blot analysen og eksempel 2 er preget i vitro bruker en electrophoretic mobilitet Skift analyse (EMSA). I begge tilfeller er det illustrert hvordan området-rettet mutagenese kan brukes i kombinasjon med andre teknikker for å gjøre biologiske konklusjoner om en genet av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vektorvalget
- Velg en vektor utføre nedstrøms eksperimenter med. Enhver vektor gjelder for denne 2 - og 3-trinns PCR metoden.
- Basert på valg av vektor, velge riktig begrensning enzymer for kloning.
2. primer design for området regissert mutagenese
- Velge mellom enten 2-step eller 3-trinns PCR strategien (2-step er bare for mutasjoner < 200 bp fra hver ende av DNA av interesse). For 2-trinns PCR, gå til trinn 2.2 og 3-trinns PCR gå til trinn 2.3.
- Utforme primere for 2-trinns PCR.
- Design primer 1 og 3 å forsterke DNA av interesse og med en 5' overheng som inneholder 4 nukleotider (f.eks ATAT eller AGCT) etterfulgt av relevante begrensning anerkjennelse området nødvendig å klone i den valgte vektoren.
- Utforme primer 2 å innføre mutation(s) på stedet/stedene som ønsket og flanken mutasjon med 10-15 komplementære nukleotider på begge sider. Gjør primer omvendt hvis mutasjon er introdusert på 5' slutten eller videresende hvis mutasjon er introdusert på 3 slutten.
- Utforme primere for 3-trinns PCR.
- Design primer 1 og 4 å forsterke DNA av interesse og med en 5' overheng som inneholder 4 nukleotider (f.eks ATAT eller AGCT) etterfulgt av relevante begrensning anerkjennelse området nødvendig å klone i den valgte vektoren.
- Utforme primer 2 og 3 for å innføre mutation(s) på ønsket steder og flanke mutasjon av 10-15 komplementære nukleotider på begge sider. Primer 2 og 3 er omvendt utfyllende.
3. PCR forsterkning av vill-type DNA for kloning
Merk: Om PCR, se6.
- Utfør PCR6 bruke primere 1 + 2 (2-trinns PCR) eller 1 + 4 (3-trinns PCR) og bruke wild type DNA som mal for å få PCR produktet I. Bruk programmet PCR i tabell 1.
- Validere PCR ved agarose gel geleelektroforese.
- Gjøre en agarose gel løsning (2%) ved å legge 2 g agarose per 100 mL 1 x Tris-acetate-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (TAE) buffer. Oppløse agarose ved koking i en mikrobølgeovn. Legge til DNA flekker fargestoff ethidium bromide (til en siste konsentrasjon av ~ 0,5 µg/mL) agarose gel løsning for visualisering.
- Kastet agarose gel, plasserer den i en geleelektroforese enhet og laste PCR prøver (blandet med DNA laste fargestoff) og en DNA stige kjent størrelse. Kjøre prøver på 75 W for 45 min eller til band skilles tilstrekkelig og visualisere band på en ultrafiolette (UV)-tabell eller en gel tenkelig system.
- Rense PCR produktet med en gel utvinning kit (Tabell for materiale) og måle konsentrasjonen av renset DNA med et spektrofotometer (Tabell for materiale).
- Lagre renset DNA på 20 ° C (i Tris-EDTA (TE) buffer-langtidslagring) eller 4 ° C (i dH2O-kort sikt lagring) til i trinn 5.
4. PCR å innføre nettstedet-rettet mutasjoner i DNA
- PCR for 2-trinns PCR (se trinn 4.2 for 3-trinns PCR)
- Utføre PCR6 bruke primere 1 + 2 Hvis mutasjoner er 5' til slutt eller 2 + 3 Hvis mutasjoner i 3' ende og bruke wild type DNA som mal for å få PCR produktet II (se tabell 1 for PCR programmet).
- Validere PCR ved agarose gel geleelektroforese som i trinn 3.2.1 og 3.2.2.
- Rense PCR produktet med en gel utvinning kit (Tabell for materiale) og måle konsentrasjonen av renset DNA med et spektrofotometer (Tabell for materiale).
- Store renset DNA på 20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O) til i trinn 5.
- Utføre PCR6 bruker PCR produktet II som primer med primer 3 Hvis mutasjoner i 5' slutten eller primer 1 Hvis mutasjoner er 3 til slutt og bruke wild type DNA som mal å få PCR produktet III (se tabell 1 for PCR-program).
- Validere PCR ved agarose gel geleelektroforese som i trinn 3.2.1 og 3.2.2.
- Rense PCR produkt med en gel utvinning kit (Tabell for materiale) og måle konsentrasjon av renset DNA med et spektrofotometer (Tabell for materiale).
- Store renset DNA på 20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O) til trinn 5.
- PCR for 3-trinns PCR
- Utføre PCR6 bruke primere 1 + 2 og 3 + 4 i eget reaksjoner og bruke wild type DNA som mal for å få PCR produktet II og III (se tabell 1 for PCR programmet).
- Validere PCRene ved agarose gel geleelektroforese som i trinn 3.2.1 og 3.2.2.
- Rense PCR produkter med en gel utvinning kit (Tabell for materiale) og måle konsentrasjonen av renset DNA med et spektrofotometer (Tabell for materiale).
- Store renset DNA på 20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O).
- Utføre PCR6 bruke primere 1 + 4 og bruke 2-5 ng både PCR produkter II og III som malene (i samme reaksjon) å få PCR produktet IV (se tabell 1 for PCR programmet).
- Validere PCR ved agarose gel geleelektroforese som i trinn 3.2.1 og 3.2.2.
Merk: Det er ikke uvanlig å få flere feil band (kan noen ganger reduseres ved hjelp av mindre mal). Feil PCR produktene kan imidlertid ignoreres hvis riktig størrelse bandet er forbrukeravgift og gel-utdraget. - Hvis riktig, rense PCR produkt med en gel utvinning kit (Tabell for materiale) og måle konsentrasjon av renset DNA med et spektrofotometer (Tabell for materiale).
- Store renset DNA på 20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O) til trinn 5.
5. rekombinasjon vill type og mutant versjon(er) av DNA i den valgte vektoren
Merk: Om følgende, se7.
- Digest renset PCR produkter I og III (fra 2-trinns PCR) og/eller IV (fra 3-trinns PCR) ved hjelp av relevante begrensning enzymer.
- I 20 µL av 1 x fordøyelsen buffer med 1 µL av hver begrensning enzym, fordøye 200 ng PCR produkt på 37 ° C i 30-60 minutter.
- Rense fordøyd PCR produkt av gel-utvinning bruker en gel utvinning kit (Tabell for materiale), måle DNA konsentrasjonen av renset DNA med et spektrofotometer (Tabell for materiale) og lagre på 20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2 O) til brukes for trinn 5.6.
- Fordøye renset vektor med relevante begrensning enzymer og behandle med alkalisk fosfatase redusere vektor re ligation hendelser. Ikke behandle PCR produkter med alkalisk fosfatase.
- I 30 µL av 1 x fordøyelsen buffer med 1 µL av hver begrensning enzym og 1 µL av alkalisk fosfatase, fordøye 1000 ng av vektoren på 37 ° C i 30-60 minutter.
- Separat fordøyd vektor fra avfall DNA (f.eks uncut vektor og utskjæringen DNA) bruker agarose gel geleelektroforese som i trinn 3.2.1 og 3.2.2.
- Rense fordøyd vektor av gel-utvinning bruker en gel utvinning kit (Tabell for materiale), måle DNA konsentrasjon av renset DNA med et spektrofotometer (Tabell for materiale) og lagre på 20 ° C (i TE buffer) eller 4 ° C (i dH2O) før brukes for trinn 5.6.
- Ligate fordøyd PCR produkter i fordøyd vektor med reaksjonene angitt i tabell 2.
- Inkuber ved romtemperatur for 2t eller overnatting på 16 ° C.
- Transformere mottaker belastning (f.eks E. coli K12) med ligation reaksjoner.
- Vokse belastning OD600= 0.3-0,5 og overføre en 1 mL kultur til så mange 1,5 mL rør som ligase reaksjoner.
- Spinn på 3500 x g i 5 min og forkaste nedbryting.
- Resuspend celler i 200 μL transformasjon bufferen (10 mL av lysogeny kjøttkraft (LB) med 0,1 g/mL polyetylenglykol 3350, 5% dimethyl sulfat og 20 mM MgCl2).
- Legg ligation reaksjon, og plassere rør på is 30 min.
- Varme-sjokk i 2 minutter på 42 ° C.
- Legg 1 mL av LB til 1,5 mL rør, og tillate fenotypiske uttrykk av antibiotikaresistens i minst 45 min på 37 ° C.
- Spin cellene på 3500 x g i 5 min, forkaste 1 mL av nedbryting og resuspend cellene i gjenværende nedbryting.
- Plate cellene på plater med aktuelle antibiotika og ruge over natten på 37 ° C.
- Identifisere transformants skjuler vektorer med vellykket integrering av DNA sette (for eksempel ved PCR bruker vektor - og sett inn-spesifikk primere).
- Validere sekvens av DNA av sanger sekvensering.
Advarsel: Ikke bruk de samme primerne for sekvenser som brukes for trinn 5.9.
6. Bruk konstruert vektorer for i vitro og/eller i vivo eksperimenter
- In vivo eksperiment
Merk: Dette er et eksempel på bruk en vektor uttrykke vill type/mutert RNA å karakterisere post-transcriptional regulering. For ytterligere informasjon om vestlige blotting, se8.- Vokse E. coli K12 stammer med konstruert vektorer i passende medium og induserer uttrykk hvis nødvendig. Høste prøver med sentrifugering.
- Forberede prøver natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) ved oppløsning celle pellets i 1 x SDS eksempel buffer (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% SDS, 0,002% bromophenol blå, 5% β-mercaptoethanol, 10% glyserol) og kok til 95 ° C for 5 min.
Merk: Det er mulig å kaste en gel eller bruke en kommersielt tilgjengelig precast gel. Sistnevnte ble brukt i resultatene som presenteres i Figur 3 (Tabell for materiale). - Laste inn 107 cellene i hvert utvalg i separate brønner (inkluderer en protein stige) og kjøre gel 200 V til proteiner er atskilt (ca 45 min).
- Blot proteiner på en cellulose-membran av semi-tørr overføring på 80 mA 1t.
- Blokkere membranen med en blanding av proteiner (f.eks 5%-melkepulver oppløst i 1 x Tween 20-Tris-bufret saltvann (TTBS) buffer).
- Legg til primære antistoff (oppløst i 1 x TTBS buffer) protein av interesse (f.eks GFP, flagg eller hans-merket protein) og ruge 1t med mild agitasjon.
- Vask membran i 1 x TTBS i 10 min å fjerne ubundet antistoffer. Gjenta to ganger mer.
- Legge til sekundære antistoff (oppløst i 1 x TTBS buffer) som mål primære antistoffer og tillater påvisning (f.eks pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundære antistoffer. Inkuber 1t med mild agitasjon.
- Vask membranen i 1 x TTBS i 10 min å fjerne ubundet antistoffer. Gjenta to ganger mer.
- Visualisere membranen med en teknikk som er kompatibel med sekundær antistoffer (for eksempel ved tenkelig etter inkubasjon med en luminol-avledet chemiluminescence, hvis et HRP-konjugerte sekundære antistoff ble brukt).
- In vitro eksperiment
Merk: Dette er et eksempel på bruk av vektoren som en mal for i vitro transkripsjon av for å karakterisere RNA-protein interaksjoner. For ytterligere informasjon om EMSA, se9.- Gjør i vitro utskrifter ved hjelp av en T7 i vitro transkripsjon kit (Tabell for materiale) og vektorer fra trinn 5 som maler.
- Separate RNA transkripsjoner av siden på en 4,5% 7 M urea denaturing gel, og ekstra RNA direkte fra gel av electro elueringsrør med dialyse rør (Tabell for materiale).
- Etiketten RNA (f.eks radiolabeling med γ -32P-ATP ved hjelp av T4-polynucleotide kinase (Tabell for materiale) og rense igjen med kolonner (Tabell for materiale).
Advarsel: Før du arbeider med radioaktivt materiale, ta kontakt med det lokale strålevernsansvarligs. - Bland merket RNA med økende konsentrasjoner av protein i egne reaksjoner i en 1 x bindende buffer (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)).
Merk: I presenterte resultatene (Figur 4), 2 nM i radiolabeled csgD mRNA ble blandet med en gradient 0 til 2 µM Hfq protein (monomer konsentrasjon). - Tillate protein og RNA hybridize før lasting hybridisering blanding på en ikke-denaturing polyakrylamid gel og kjøre gel for 1,5 t 200 V.
- Visualisere gel med en teknikk som er kompatibel med merkingen fra trinn 6.1.3. (for eksempel ved phosphoimaging hvis radiolabeling ble brukt).
- Kvantifisere den relative intensiteten skiftet band med bilde behandling programmet og passer en kurve (sigmoidal) til data ved hjelp av en graf og dataanalyse programvare (Tabell for materiale). Basert på montert kurven, kan dissosiasjon konstanter (Kd) bestemmes automatisk med programvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøke RNA interaksjoner om post-transcriptional regulering av csgD, en dobbel vektor oppsett ble valgt: en å uttrykke csgD mRNA og en annen for å uttrykke den liten ikke-koding RNA, McaS. csgD ble klonet i pBAD33, som er en arabinose induserbart medium-kopi plasmider chloramphenicol motstand og McaS ble klonet i mini R1 pNDM220, som er en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induserbart lav kopi plasmider med Ampicillin motstand. Wild type csgD var PCR forsterket primere 1A og 4A (4A inkluderer en flagg-sekvens) å gi PCR produktet IA, mens wild type McaS var PCR forsterket bruker primere 1B og 4B til PCR produktet IB. 3-trinns PCR strategien ble brukt til å innføre erstatninger i spådd base-sammenkobling regionen csgD og McaS. I de to første trinnene, ble PCR produkter IIA og IIIA syntetisert med primere 1A + 2A, og 3A + 4A, henholdsvis. I det tredje trinnet ble PCR produktet IVA syntetisert bruker PCR produkter IIA og IIIA som mal og 1A og 4A som primere (figur 2A). Tilsvarende ble utfyllende område-rettet mutasjoner introdusert i McaS, bruke grunning 1B, 2B, 3B og 4B til PCR produkter IIB, IIIB i de første to trinnene og IVB i det tredje trinnet (figur 2A). pBAD33 og PCR produkter IA og IVA var fordøyd med både BamHI og PstI og fordøyd IA og IVA var samskrevet i fordøyd pBAD33. Resulterende konstruksjoner het pBAD-csgDflagg og pBAD-csgD63-66FLAG (mutert på plasseringen 63-66 i forhold til transcriptional startwebstedet). pNDM220 og PCR produkter IB og IVB ble fordøyd med AatII og BamHI og fordøyd IB og IVB var samskrevet i fordøyd pNDM220. Resulterende konstruksjoner het pNDM-mcaS og pNDM-mcaS42-45 (mutert på plasseringen 42-45 i forhold til transcriptional startwebstedet).
For å analysen effekten av mutasjoner, ble E. coli stammer skjuler pBAD-csgDflagg eller pBAD-csgD63-66FLAG og pNDM220, pNDM-mcaS eller pNDM-McaS42-45 dyrket i M9 minimal medium med 0,2% glycerol å OD 450 av 0.4. Uttrykk pNDM-vektorer ble deretter indusert i 10 min ved tillegg av 1 mM IPTG etterfulgt av 5 min induksjon av pBAD-vektorer av tillegg av 1 mM arabinose. På dette punktet, prøver ble høstet og western blot analyse ble gjennomført med høstet prøvene. Mens uttrykk for wild type McaS hindrer oversettelse av vill-type CsgD, lindrer innføring av mutasjoner i enten CsgD eller McaS observert undertrykkelse. Men når mutasjoner er supplert i både CsgD og McaS translasjonsforskning undertrykkelse av CsgD gjenopprettes (Figur 3; endret fra2). Dermed støtter nettsted rettet mutational tilnærming hypotesen som McaS og csgD base-parene i denne regionen.
PBAD33-vektor ble valgt i vivo eksperimentet, og ble også brukt for å innføre nettstedet-rettet mutasjon for å undersøke Hfq-binding til csgD mRNA i vitro. Nettsted rettet mutasjoner ble introdusert med 2-trinns PCR strategi å generere csgD mutant RNAs med endrede primære og/eller sekundær strukturer når transkribert. Grunning 1 + 2 C 2D, 2E, 2F eller 2G ble brukt til å forsterke og introdusere mutasjoner på 5' slutten av csgD. De resulterende PCR-produktene (IIC, IID, IIE, IIF og IIG) ble brukt som maler med primer 3 å forsterke og introdusere mutasjoner til hele csgD DNA (figur 2B). De resulterende PCR produktene (IIIC, IIID, IIIE, IIIF og IIIG) ble klonet i pBAD33 som beskrevet ovenfor. In vitro transkripsjoner ble transkribert med den T7 RNA polymerase: først PCR produkter ble syntetisert med primere 5A, 5C, 5D, 5E, 5F eller 5G + 6 bruke konstruert vektorer som mal. De resulterende PCR-produktene ble brukt som maler for T7 RNA-utvalg. I vitro transkribert csgD wild type og mutant RNAs ble renset, radiolabeled og blandet med økende konsentrasjoner av renset Hfq. Hybridisering reaksjonene var kjøre på ikke-denaturing gels og visualisert. Økt Kd-verdier av de muterte alleler beviser at Hfq binder mindre effektivt til mutanter. Videre har Hfq flere bindende områder på csgD som vises av de 3 skiftene observert i vill-type RNA. Men bare 2 bindende områder observeres for ulike mutant RNAs (Figur 4; endret fra4). Dermed nettsted rettet mutational tilnærming identifiserer primære og/eller sekundær strukturer av csgD mRNA som er viktige for komplett binding av Hfq.
Til sammen er det mulig å utføre området-rettet mutagenese med en 2 - eller 3-trinns PCR tilnærming i kombinasjon med nedstrøms analyser å gjøre biologiske konklusjoner om genet regulering på post-transcriptional nivå samt protein-RNA interaksjoner .
| Trinn | Temperatur | Tid |
| Første rødsprit | 98° C | 2 min |
| Rødsprit | 98° C | 10 s |
| Avspenning | 55° C | 10 s |
| Utvidelse | 72° C | 15 s |
| (30 sykluser) | ||
| Endelig utvidelse | 72° C | 5 min |
| Hold | 4 ° C |
Tabell 1: PCR programmet
| Reagens | Kontroll reaksjon | 20 fmol reaksjon | 100 fmol reaksjon |
| 10 x ligase buffer | 2 ΜL | 2 ΜL | 2 ΜL |
| Fordøyd vektor DNA | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Fordøyd PCR-produkt | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| H2O | Til 19 µL | Til 19 µL | Til 19 µL |
| Ligase | 1 ΜL | 1 ΜL | 1 ΜL |
Tabell 2: Ligation reaksjoner
| Primer navn | Sekvens | Brukes for - mutasjoner | ||
| 2-1A eller 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - og 3-round PCR på csgD | ||
| 2-3A eller 3-4A | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - og 3-round PCR på csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3-round PCR på csgD -erstatter 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3-round PCR på csgD -erstatter 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3-round PCR på McaS | ||
| 3-4B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3-round PCR på McaS | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 3-round PCR på McaS-erstatter 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3-round PCR på McaS-erstatter 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD -sletter 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD -erstatter 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD -sletter 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD -sletter 9 nt og erstatter 7 nt | ||
| 2-2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runde PCR på csgD -sletter 9 nt og erstatter 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tabell 3: Primere brukt for området-rettet mutagenese og T7 mal syntese
Fet: begrensning enzym anerkjennelse nettsteder (BamHI, PstI og AatII)
Understreket: nukleotid mutasjoner
Figur 1: PCR strategi for området-rettet mutagenese. A) tre primere brukes i 2-step PCR tilnærming til å innføre nettstedet-rettet mutasjoner til et gen rundt. Primere 1 og 3 forsterker genet (PCR produktet jeg), mens primer 2 introduserer spesifikke mutasjoner (*). Primer par 1 + 2 forsterker et lite fragment i hver ende av DNA av interesse å syntetisere PCR produktet II (trinn 1). PCR sluttproduktet brukes deretter som en primer med primer 3 for å syntetisere PCR produktet III med nettstedet regissert mutasjon innlemmet (trinn 2). B) fire primere brukes i 3-trinns PCR tilnærming for å innføre nettstedet-rettet mutasjoner til et gen av interesse. Primere 1 og 4 forsterker genet (PCR produktet jeg), mens primere 2 og 3 introduserer spesifikke mutasjoner (*). Primer par 1 + 2 og 3 + 4 er brukt i de to første trinnene i PCR for å syntetisere PCR produktet II og III (trinn 1 og 2). I det tredje trinnet brukes PCR produkter II og III som mal med primer par 1 + 4 for å syntetisere PCR produktet IV med nettstedet-rettet mutasjon innlemmet (trinn 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: PCR produkter fra nettstedet-rettet mutagenese. PCRene ble utført med grunning og maler som beskrevet i teksten. PCR produkter ble kjørt på en 2% agarose gel med ethidium bromide (~ 0,5 µg/mL) med 1 µg av DNA stigen bland (Tabell for materiale). Riktig størrelse band er merket med en rød firkant. A) i de fleste PCR reaksjoner vises bare en gjeng riktig størrelse. PCR reaksjon IVB har imidlertid to synlige bånd som topp bandet (like over 300 bp) har riktig lengde. Som forventet, summen av lengden på PCR produkter II og IIIC lik lengden på PCR produkter I og IV (A: csgD PCR produkter, B: McaS PCR produkter, I: wild type csgD/McaS forsterket bruker primere 1A/B + 4A/B, II + III: middels PCR produkter forsterket med primere 1A/B + 2A/B og 3A/B + 4A/B, henholdsvis, IV: mutert PCR produktet forsterkes med primere 1A/B + 4A/B med middels PCR produktene II og III som maler). I alle PCR reaksjoner vises bare en gjeng riktig størrelse. I dette tilfellet ble nesten alle molekyler av PCR produkter II lagt til PCR reaksjoner III brukt til å syntetisere PCR produkter III. Bare for PCR IIIE er PCR produkt IIE fortsatt synlig (IA: wild type csgD PCR produktet forsterkes med primer 1A + 3A, IIC-G: PCR innsatsvarer forsterket bruker primer 1A + 2 C-G, IIIC-G: mutert PCR produkter forsterket med primer 3A PCR produkter IA og IIC-G som maler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: In vivo eksperimentere med nettstedet-rettet csgD og McaS mutanter. Western blot analyse av stammer skjuler indikerte vektorer. Stammer var vokst til eksponentiell fase og indusert for 10 min med 1 mM IPTG (McaS) etterfulgt av 5 min induksjon med 1 mM arabinose (csgD). Α-flagg antistoffer ble brukt mot flagg-merket CsgD og α-GroEL antistoffer ble brukt mot housekeeping protein GroEL (utvannet 10.000 og 50 000 ganger, henholdsvis). Mus og kanin HRP-konjugerte antistoffer ble brukt som sekundær antistoffer (utvannet 2000 ganger). Dette tallet er endret fra2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: In vitro eksperimenter med nettstedet-rettet csgD mutanter. EMSA i vitro transkribert csgD villtype (WT) og mutant (Panel C-G) RNAs med hensyn til Hfq binding. CsgD alleler (WT og mutant C-G) var radiolabeled og blandet med 0, 0,25, 0,5, 1 eller 2 µM monomerisk Hfq. hybridisering reaksjoner ble kjørt på ikke-denaturing polyakrylamid gels. Den relative intensiteten av skiftet bandene ble kvantifisert og en sigmoid kurve ble montert på dataene. Dissosiasjon konstantverdier (Kd) var bestemmes ved hjelp av SigmaPlot. Dette tallet er endret fra4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nettstedet-rettet mutagenese har en rekke forskjellige programmer, og her, representant resultater fra en in vivo og et i vitro eksperiment ble inkludert som eksempler på hvordan å gjøre biologiske konklusjoner ved hjelp av teknikken. Nettstedet-rettet mutagenese har lenge vært golden standarden for RNA samhandling studier. Styrken på teknikken ligger i kombinasjonen av introdusere relevante mutasjoner nedstrøms analyser og eksperimenter (f.eks western blot eller EMSA) for å trekke konklusjoner om bestemte DNA nettsteder og deres betydning i funksjoner av de gene- spørsmål. Når beslutter å gjøre området-rettet mutagenese, utformingen av primere må planlegges nøye å få mest mulig ut av teknikken (f.eks hvilke nettsteder å mutere); Husk å inkludere riktig overheng og begrensning nettsteder og ta hensyn primer/mal egenskaper.
Den faktiske mutagenese beskrevet i denne protokollen er avhengig av PCR. Den viktigste delen av protokollen er derfor vilkårene for dette. Det er flere måter å optimalisere PCR, inkludert graderinger Mg2 + konsentrasjoner, DMSO konsentrasjon og temperaturer på annealing trinnet. For ytterligere informasjon, se3. Foruten optimalisering av selve reaksjonen PCR, to ting er verdt gjør at når du gjør området-rettet mutagenese: høy kvalitet maler og nøye utformet primere.
Å ha et høykvalitets mal for PCR ofte gjør forskjellen mellom en mislykket og vellykket PCR. Mens det er mulig å bruke en celle lysate for å gi malen DNA, renset DNA (genomisk-, vektor- eller PCR-DNA) er alltid å foretrekke. Videre, når det gjelder mengden av malen, ofte mindre er mer; spesielt i det siste trinnet i 3-trinns PCR (trinn 4.2.5). For eksempel prøve en 10 x fortynning rekke mal finne optimalt om nødvendig.
Optimal primer design, avhenger av egenskapene til DNA av interesse og utvalg. Mulig Prøv alltid å utforme primere tilsvarende. Men i mange tilfeller primere må være utformet på et bestemt område og kan derfor ikke være utformet etter bestemte vilkår. I slike tilfeller kan det være nødvendig å gjøre mer optimalisering av PCR forhold i stedet (se ovenfor og protokollen på PCR6), men med de rette forholdene selv vanskelig PCRene er vanligvis vellykket.
Flere alternative metoder for området-rettet mutagenese finnes, for eksempel Kunkels metode10, hele plasmider mutagenese11, kassett mutagenese12, de novo gen syntese og CRISPR13,14.
Kunkels metode og hele plasmider mutagenese avhengig av DNA av interesse som allerede er i en plasmider (vektor) og bruker primere for å syntetisere en enkelt tråd eller dobbel tråd av muterte DNA, henholdsvis. I begge teknikkene blir hele plasmider syntetisert og anvendt for transformasjon, mens 2 - eller 3-trinns PCR bare syntetiserer DNA stykke interesse. En ulempe av de 2 eller 3-trinnet PCR, er at DNA rundt må syntetiseres to ganger, øker risikoen for mutasjoner deri. På den annen side, trenger plasmider ikke å bli syntetisert, dermed redusere risikoen for mutasjoner her i stedet. Videre trenger bruker PCR den 2 - eller 3-steg, en vill type variant ikke klones i en vektor på forhånd, således nedsetter kloning tiden av flere dager.
Kassetten mutagenese stole ikke på bruk av primer eller polymerases. I stedet er en liten DNA-fragment de novo syntetisert og innlemmet i DNA av interesse med bruk av begrensning enzymer. Denne metoden er imidlertid avhengig av tilstedeværelsen av egnet begrensning områder i nærheten av målrettede området, som ikke alltid er til stede. Denne fremgangsmåten krever også wild type variant å være klonet i vektoren på forhånd, øke kloning tid i forhold til metoden 2 - eller 3-trinns PCR.
Med mindre kostnaden for de novo gen syntese (store DNA fragmenter) blir det stadig mer rimelig å introdusere mutasjoner av bestilling i ønsket rekkefølge kommersielt. Denne metoden er imidlertid fortsatt dyre sammenlignet med de andre metodene nevnt. På skrivende de novo er syntese ca 3 ganger dyrere enn metoden som presenteres her.
En annen nye alternativet er den etterlengtede CRISPR metoden for Genova endringer. Denne metoden er svært effektiv og tilpasningsdyktig sammenlignet med andre teknikker for eukaryote celler. Men det er relative enkelt og mange tilgjengelige teknikker for kloning i enklere organismen som bakterier, er CRISPR sjelden mer passende enn konvensjonelle kloning. Derfor avhengig nytten av CRISPR stort sett av organismen blir studert.
Når du velger å gjøre området-rettet mutagenese, er det viktig å utforme det nøye. både med hensyn til nedstrøms programmer også er selve teknikken brukes. 2 - og 3-trinns PCR metoden beskrevet her er gjelder for nesten alle mutasjon studie med sin rimelig det er egnet til alle laboratorium budsjett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke University of Southern Denmark åpen tilgang politikk tilskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
