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Immunology and Infection

जैव सुरक्षा स्तर 2 की स्थापना में अत्यधिक रोगजनक कोरोनावायरस का अध्ययन करने के लिए स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59010
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 4, 3,5, 3, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine, Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences, Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center, University of Massachusetts Medical School

Summary

यहां, हम एक बीएसएल-2 उच्च रोगजनक वायरस मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम और गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस के स्पाइक प्रोटीन को शामिल करने की स्थापना में स्यूडोटाइप कणों उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इन कूटलिखित कणों एक luciferase रिपोर्टर जीन लक्ष्य मेजबान कोशिकाओं में वायरस प्रविष्टि के परिमाणन की अनुमति होते हैं ।

Abstract

प्रोटोकॉल को व्यापक रूप से उपलब्ध hek-293t सेल लाइन के एक सरल अभिकर्मक प्रक्रिया का उपयोग कर, एक murine ल्यूकेमिया वायरस (mlv) कोर और luciferase रिपोर्टर के साथ कोरोनावायरस (cov) स्पाइक (एस) फ्यूजन प्रोटीन स्यूडोटाइप कणों उत्पन्न करने के लिए करना है । एक बार का गठन किया और निर्माता कोशिकाओं से जारी, इन स्यूडोविरिओन एक luciferase रिपोर्टर जीन शामिल. चूँकि वे केवल उनकी सतह पर विषमजातीय कोरोनाविरस स्पाइक प्रोटीन होते हैं, अतः कणों के प्रवेश चरणों के लिए उनके देशी कोरोनाविरस समकक्षों की तरह व्यवहार करते हैं. इस तरह के रूप में, वे मेजबान कोशिकाओं में वायरल प्रवेश का अध्ययन करने के लिए देशी virions के उत्कृष्ट surrogates हैं । लक्ष्य कोशिकाओं में सफल प्रवेश और संक्रमण पर, luciferase रिपोर्टर मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत हो जाता है और व्यक्त की है । एक साधारण luciferase परख का उपयोग करना, transduced कोशिकाओं को आसानी से quantified जा सकता है । इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इस तरह के मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस (MERS-cov) के रूप में उच्च रोगजनक कोरोनावायरसों के साथ काम के लिए आवश्यक सुविधाएं बीएसएल-3 सुविधाओं के बजाय जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल-2) सुविधाओं में किया जा सकता है और गंभीर एक्यूट श्वसन सिंड्रोम कोरोनाविरस (सार्स-सीओवी) । एक और लाभ अपनी बहुमुखी प्रतिभा से आता है के रूप में यह लिफाफा प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है वायरल फ्यूजन प्रोटीन के सभी तीन वर्गों से संबंधित, इस तरह के वर्ग के रूप में मैं इंफ्लूएंजा hemagglutinin (हा) और ebola वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी), वर्ग द्वितीय सेमलीकी वन वायरस E1 प्रोटीन, या कक्षा III vesicular स्टेमाइटिस वायरस जी ग्लाइकोप्रोटीन । कार्यप्रणाली की एक सीमा यह है कि यह केवल वायरस प्रविष्टि लिफाफा प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता कदम पुनर्निमित कर सकते है जांच की जा रही है । अन्य वायरल जीवन चक्र चरणों का अध्ययन करने के लिए, अन्य तरीकों की आवश्यकता है । कई अनुप्रयोगों के उदाहरण इन छद्म प्रकार कणों में इस्तेमाल किया जा सकता है मेजबान सेल संवेदनशीलता और अनुवर्तन की जांच शामिल है और वायरस प्रवेश inhibitors के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए वायरल प्रवेश रास्ते काटना इस्तेमाल किया ।

Introduction

मेजबान सेल प्रविष्टि वायरल संक्रामक जीवन चक्र के प्रारंभिक कदम का गठन किया । आवरण वायरस के लिए, यह एक एकल मेजबान सेल रिसेप्टर या कई रिसेप्टर्स, वायरल और सेलुलर झिल्ली के विलय के बाद के लिए बाध्यकारी शामिल है । ये आवश्यक कार्य वायरल लिफाफे द्वारा किए जाते हैं नच१,२. कोरोनाविरस लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन स्पाइक (एस) प्रोटीन कहा जाता है और वर्ग मैं वायरल फ्यूजन प्रोटीन2,3,4,5,6का एक सदस्य है । वायरल लिफाफा नच का अध्ययन एक दिया वायरस के कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि: जीवन चक्र दीक्षा, अपने मेजबान और सेलुलर अनुवर्तन, interspecies संचरण, वायरल रोगजनन, साथ ही मेजबान सेल प्रविष्टि रास्ते. वायरल कूटलिखित कणों, भी कूटविरिओन नाम, शक्तिशाली उपकरण है कि हमें आसानी से वायरल फ्यूजन प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए सक्षम हैं । स्यूडोटाइप कणों या स्यूडोविरिओन चिएरिक विरिओन होते हैं जो उनकी सतह पर एक विषमजातीय वायरल लिफाफा प्रोटीन के साथ एक सरोगेट वायरल कोर से मिलकर बनता है । प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य कोरोनेविरस स्पाइक स्यूडोटाइप कणों को प्राप्त करने का तरीका है जो कि एक मुरीन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) कोर पर आधारित है और इसमें एक ल्यूसीफ्रैज़ रिपोर्टर जीन शामिल हैं । उदाहरण के रूप में, उच्च रोगजनक गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम (एसएआरएस) और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम (MERS) कोरोनावायरस के स्पाइक प्रोटीन के साथ स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन करने की विधि प्रस्तुत की गई है । प्रोटोकॉल में शामिल अभिकर्मक प्रक्रिया का वर्णन, कैसे अतिसंवेदनशील लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, और लूसिफेट्रेस परख द्वारा संक्रमणशीलता परिमाणन.

चूंकि स्यूडोविरिओन के प्रवेश चरणों को उनकी सतह पर कोरोनाविरस एस द्वारा नियंत्रित किया जाता है, वे एक समान फैशन में देशी समकक्षों के लिए कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं । इस प्रकार, वे कार्यात्मक संक्रामकता के उत्कृष्ट सरोगेट हैं । कूटलिखित कणों आम तौर पर रेट्रोवायरस जैसे पैतृक मॉडल वायरस से व्युत्पंन कर रहे है (mlv7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 और लेंटीवायरस मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस — एचआईवी23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , ३२ , ३३ , ३४ , ३५) या रैब्डोवाइरस (vesicular स्टेमाइटिस वायरस-vsv३६,३९,४०,४१,४२,४३,४४ , ४५ , ४६ , ४७). जब कूटलेखन में प्रयोग किया जाता है, पैतृक वायरस ' जीनोम आवश्यक जीन को हटाने के लिए संशोधित कर रहे हैं, उंहें एक पूर्ण प्रतिकृति चक्र पूरा करने के लिए दोषपूर्ण प्रतिपादन । यह सुविधा उन्हें मध्यवर्ती जैव सुरक्षा स्तर की सुविधाओं (बीएसएल-2) में इस्तेमाल करने की अनुमति देती है और अत्यधिक रोगजनक देशी विषाणुओं का उपयोग करने पर एक महत्वपूर्ण लाभ है जो उच्च जैव सुरक्षा सुविधाओं (बीएसएल-3, बीएसएल-4 की आवश्यकता होती है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हैं) जब वायरस प्रवेश अध्ययन का आयोजन । यहां, एस प्रोटीन के जोखिम समूह 3 रोगजनकों सार्स-cov और mers-cov वायरल लिफाफा प्रोटीन के उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है mlv स्यूडोटाइप कणों में शामिल, सार्स सृजन एस और MERS-cov एस स्यूडोविरियंस (sars-spp और mers-spp, क्रमशः) । इन स्यूडोविरियनों को सफलतापूर्वक इन वायरस४८,४९,५०,५१के प्रवेश की घटनाओं पर ध्यान केंद्रित कर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । एक और लाभ यह है कि तकनीक यहां वर्णित है कि कोरोनावायरस एस प्रोटीन कूटलेखन करने के लिए सीमित नहीं है: यह बहुत लचीला है और वायरल फ्यूजन प्रोटीन के सभी तीन वर्गों के प्रतिनिधियों को शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरणों में इंफ्लूएंजा hemagglutinin (हा, कक्षा मैं)५२, ebola वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी कक्षा मैं), alphavirus सेमलीकी वन वायरस के E1 प्रोटीन (sfv, द्वितीय श्रेणी), और vsv ग्लाइकोप्रोटीन (जी, कक्षा III)५३शामिल हैं । इसके अलावा, एक से अधिक प्रकार के वायरल ग्लाइकोप्रोटीन को एक स्यूडोटाइप कण में सह-शामिल किया जा सकता है, जैसा कि इंफ्लूएंजा हा-और एनए-स्यूडोटाइप कणों५१के मामले में होता है ।

bartosch एट अल.20द्वारा प्रदर्शन किया काम के आधार पर, इस प्रोटोकॉल एक तीन plasmid सह-transfection व्यापक रूप से उपलब्ध है और अत्यधिक transfection-सक्षम हेक-293t सेल लाइन का उपयोग कर रणनीति के साथ mlv pseudotyped कणों की पीढ़ी का वर्णन ५४. पहले प्लाज्मिड mlv कोर जीन गैग और पीओएल encodes लेकिन mlv लिफाफा encodes जीन का अभाव है । दूसरा प्लाज्मिड एक स्थानांतरण सदिश है कि एक जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन encodes, एक mlv Ψ-आरएनए पैकेजिंग संकेत, साथ 5 '-और 3 '-flanking mlv लांग टर्मिनल दोहराने (ltr) क्षेत्रों । तीसरे प्लाज्मिड ब्याज के फ्यूजन प्रोटीन encodes, इस मामले में या तो सार्स-cov एस या MERS-cov एस प्रोटीन. तीन plasmids का एक अभिकर्मक अभिकर्मक, वायरल आरएनए और प्रोटीन का उपयोग करने के सह-अभिकर्मक पर पारफेक्टेड कणों के उत्पादन की अनुमति कोशिकाओं के भीतर व्यक्त हो । चूंकि mlv स्यूडोविरिओन रीढ़ के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह प्लाज्मा झिल्ली पर होता है: luciferase जीन रिपोर्टर और पैकेजिंग सिग्नल युक्त rnas नवजात कणों में समझाया जाता है जो प्लाज्मा झिल्ली को भी शामिल करते हैं-व्यक्त कोरोनाविरस स्पाइक प्रोटीन. कणों कि कोशिकाओं से बाहर कली उनकी सतह पर कोरोनाविरस एस प्रोटीन होते हैं और संक्रामकता assays में उपयोग के लिए काटा जाता है । क्योंकि कूटलिखित कणों को कोरोनाविरस एस प्रोटीन बंदरगाह और नहीं mlv लिफाफा प्रोटीन, कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया, वे प्रवेश कदम के लिए अपने मूल कोरोनाविरस समकक्षों की तरह व्यवहार करते हैं । वायरल आरएनए लूसिफेरेज़ रिपोर्टर और अगल बगल लटर्स युक्त तो सेल के भीतर जारी किया है और रेट्रोवाइरल पॉलीमरेज़ गतिविधियों के डीएनए और मेजबान सेल जीनोम में एकीकरण में अपने रिवर्स प्रतिलेखन सक्षम । संक्रमित कोशिकाओं में वायरल स्यूडोटाइप कणों की संक्रामकता का quantification तो एक सरल luciferase गतिविधि परख के साथ प्रदर्शन किया है । क्योंकि डीएनए अनुक्रम है कि मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत हो जाता है केवल luciferase जीन और mlv या कोरोनाविरस प्रोटीन-एंकोडिंग जीन में से कोई भी शामिल है, वे स्वाभाविक प्रतिकृति से उपयोग करने के लिए सुरक्षित है-सक्षम देशी वायरस ।

सुरक्षित surrogates और उच्च लिफाफे के विभिंन प्रकार के निगमन की अनुमति के लिए अनुकूलनीय होने के अलावा नच, छद्म यहां वर्णित कणों भी अत्यधिक बहुमुखी है और वायरस प्रविष्टि के कई पहलुओं का अध्ययन किया जा सकता है । यह शामिल है, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं है: वायरस के संक्रमण के लिए मेजबान सेल संवेदनशीलता का परीक्षण, सेलुलर प्रवेश रास्ते का विश्लेषण एक घिरा वायरस का उपयोग करता है, औषधीय inhibitors और दवा स्क्रीनिंग के प्रभाव का अध्ययन, बेअसर एंटीबॉडी का आयोजन assays, आवरण वायरस है कि सभ्य नहीं किया जा सकता है, और जीन वितरण, ब्याज के जीन की स्थिर सेलुलर अभिव्यक्ति, या जीन silencing के लिए वायरल वैक्टर पैदा की विशेषता मेजबान सेल प्रविष्टि ।

Protocol

1. स्यूडोटाइप कण उत्पादन के लिए सेल सीडिंग

नोट: जैव सुरक्षा कैबिनेट में यह चरण निष्पादित करें ।

  1. मानक सेल संस्कृति तकनीक से, प्राप्त एक 80-90% संगामी ७५ सेमी2 कुप्पी की hek-293t/17 कोशिकाओं को पूरा dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम (dmem-सी) 10% (vol/भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs), 10 मिमी 4-(2-hydroxyethyl) युक्त में passaged-1- पीप्राज़ीनीथैनेस्लफोनिक एसिड (hepes), १०० IU/एमएल पेनिसिलिन, और १०० μg/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन । transfections के लिए dmem-टी मध्यम तैयार (इसकी संरचना dmem-सी लेकिन एंटीबायोटिक दवाओं के बिना के रूप में ही है) ।
  2. पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने dulbecco ' s फॉस्फेट buffered खारा (dpbs) दो बार.
    नोट: देखभाल के साथ HEK293T/17 कोशिकाओं को संभाल के रूप में वे आसानी से अलग ।
  3. महाप्राण और अलग कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर ०.२५% ट्रिप्सिन समाधान के साथ पहले से ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम किया जाता है । कोशिकाओं की कुप्पी को ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखें, 5% सह2 इनकोबेटर 3 − 5 मिनट के लिए या जब तक कोशिकाएं अलग नहीं होती हैं ।
    नोट: से अधिक 5 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं incubating से बचें के रूप में यह आम तौर पर सेल clumping की ओर जाता है ।
  4. dmem-C मध्यम की 4 मिलीलीटर जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें और सेल का उपयोग करते हुए स्लाइड और प्रकाश सूक्ष्मदर्शी को गणना करने वाले कक्षों को गिनें ।
    नोट: भी कई कोशिकाओं की गिनती करने के लिए होने से बचने के लिए, एक अतिरिक्त कमजोर पड़ने कदम पहले से आवश्यक हो सकता है. trypsinized कोशिकाओं के वास्तविक सेल घनत्व की गणना करते समय इस कमजोर पड़ने में कारक करने के लिए याद रखें.
  5. dmem-C के साथ 5 x 105 कोशिकाओं को पतला कोशिकाओं/
  6. बीज 6-अच्छी तरह से प्रति सेल समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ ऊतक संस्कृति प्लेट और धीरे से थाली को आगे और पीछे की ओर ले जाने के लिए समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए, परिपत्र गति से परहेज ।
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है । समान रूप से वितरित कोशिकाओं सुनिश्चित करेंगे कि कोशिकाओं कुओं के केंद्र में झुरमुट नहीं है । इसके बदले में, यह अच्छा ट्रांसफेक्शन क्षमता और स्यूडोटाइप कण उत्पादन सुनिश्चित करेगा ।
  7. एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 सेल संस्कृति इनकोबेटर में रात भर (16-18 एच) थाली सेते हैं ।

2. तीन-plasmid सह-transfection

नोट: जैव सुरक्षा कैबिनेट में यह चरण निष्पादित करें ।

  1. सेल आकारिकी और घनत्व के लिए जांच करने के लिए एक औंधा प्रकाश खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण ।
    नोट: आदर्श रूप में, सेल घनत्व 40-60% कन्फ्लुएंसी रेंज में होना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को न तो बहुत संगामी (80 − 90% संगामी) और न ही कम से कम वितरित (20 − 30% संगामी) एक अच्छी तरह से । 40 − 60% कन्फ्लुएंसी का सेल घनत्व अच्छे स्यूडोटाइप कणों के उत्पादन को सुनिश्चित करेगा ।
  2. plasmids मिक्स
    1. एक लिफाफा के लिए प्लाज्मिड मिश्रण की गणना ग्लाइकोप्रोटीन एक अच्छी तरह से एक के लिए मात्रा के बाद 6-अच्छी तरह से थाली तालिका 1में दिखाया गया. कई कुओं transfecting और मिश्रण से बाहर चलने से बचने के लिए एक अतिरिक्त अच्छी तरह से शामिल हैं, तो मात्रा गुणा.
      नोट: सार्स के साथ-cov एस और MERS-cov s एंकोडिंग plasmids, नकारात्मक नियंत्रण कणों की कमी है जो वायरल लिफाफा नच (के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण ग्लाइकोप्रोटीन के साथ इस तरह के vesicular के रूप में) का अभाव के लिए खाली वेक्टर नियंत्रण शामिल स्टेमाइटिस वायरस (vsv) जी ग्लाइकोप्रोटीन है कि robustly कोशिकाओं की एक बहुत व्यापक रेंज (vsv-gpp) को संक्रमित करने के लिए जाना जाता है । plasmids अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।
    2. मिश्रण plasmids और कम सीरम सेल संस्कृति मध्यम की गणना की मात्रा ( सामग्री की तालिकादेखें) एक microcentrifuge ट्यूब में ।
  3. लिपिड-आधारित ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक मिश्रण ( सामग्री तालिकादेखें)
    1. एक अच्छी तरह से (1:3 अभिकर्मक अनुपात, मात्रा के रूप में की जरूरत के रूप में गुणा) तालिका 2 में दिखाया मात्रा से अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण के लिए संस्करणों की गणना. ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक मिश्रण से बाहर चलने से बचने के लिए अतिरिक्त कुओं को शामिल करें ।
    2. लिपिड-आधारित ट्रांसफक्शन अभिकर्मक (3 μl प्रति अच्छी तरह से) की गणना की गई मात्रा और कम सीरम सेल कल्चर मीडियम (४७ μl प्रति अच्छी तरह से) एक microcentrifuge ट्यूब, में ट्रांसफक्शन अभिकर्मक जोड़ने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कम सीरम सेल संस्कृति मध्यम और नहीं अन्य तरह आसपास.
  4. सेते दोनों घोला जा सकता है (एक अच्छी तरह के लिए: ५० μl के plasmids मिश्रण और ५० μl के लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण) अलग से 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।
  5. एक 1:1 अनुपात में plasmids मिश्रण करने के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण की सामग्री जोड़ें (के लिए 1 अच्छी तरह से: प्रत्येक मिश्रण के ५० μl)
  6. परिणामी मिश्रण के पूरी तरह से ऊपर-नीचे पाइपटिंग को पूरा करें ।
  7. कमरे के तापमान पर कम से 20 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं ।
  8. कोशिकाओं के खर्च के माध्यम को महाप्राण ।
  9. धीरे से 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) कम सीरम सेल संस्कृति मध्यम प्रति अच्छी तरह से जोड़ें ।
  10. एक अच्छी तरह से अभिकर्मक मिश्रण के बिंदुश: १०० μl जोड़ें ।
    नोट: जब वे आसानी से अलग के रूप में hek के कुओं के लिए अभिकर्मक मिश्रण जोड़ने की देखभाल व्यायाम-293t ।
  11. एक ३७ डिग्री सेल्सियस में सेते कोशिकाओं, 4-6 एच के लिए 5% सह2 सेल संस्कृति इनकोबेटर ।
  12. 1 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से पूर्व-गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) dmem-T मध्यम जोड़ें, जिसमें एंटीबायोटिक्स नहीं होते हैं
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है । ट्रांसफेक्शन अभिकर्मकों सेल पारगम्यता बढ़ाने के लिए और एंटीबायोटिक दवाओं के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि. अच्छी ट्रांसफेक्शन दक्षता और स्यूडोटाइप कण उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए, यह आवश्यक है कि सेल संस्कृति के माध्यम से एंटीबायोटिक्स युक्त उपयोग से बचें
  13. एक ३७ डिग्री सेल्सियस में सेते कोशिकाओं, ४८ एच के लिए 5% सह2 सेल संस्कृति इनकोबेटर ।

3. स्यूडोटाइप कणों संग्रह

नोट: जैव सुरक्षा कैबिनेट में यह चरण निष्पादित करें ।

  1. सेल आकारिकी और सामान्य स्थिति के लिए जाँच करने के लिए उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण. इसके अलावा मध्यम के रंग की जांच करें जो हल्के गुलाबी/
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है । यदि वहां बहुत ज्यादा कोशिका मृत्यु अभिकर्मक या मध्यम रंग के साथ जुड़ा हुआ है नारंगी/पीला (अंलीय पीएच), यह आम तौर पर संक्रामक स्यूडोटाइप कणों में कम पैदावार के साथ जुड़ा होगा
  2. ५० मिलीलीटर शंकु अपकेंद्री ट्यूबों के लिए ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के supernatants स्थानांतरण ।
  3. २९० एक्स जी पर 7 मिनट के लिए सेंट्रेसेज ट्यूबों सेल मलबे को हटाने के लिए ।
  4. फिल्टर एक बाँझ ०.४५ μm ताकना आकार फिल्टर के माध्यम से supernatants स्पष्ट किया ।
  5. cryovials में स्यूडोटाइप वायरस समाधान के छोटे वॉल्यूम एलिक्ट्स (उदा., ५०० μl या 1 mL) बनाएं ।
  6. -८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है । कूटलिखित कणों कई महीनों के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हैं, लेकिन एक बार thawed, उन्हें फिर से ठंड से बचने के रूप में वे संक्रामकता खो देंगे

4. अतिसंवेदनशील कोशिकाओं का कूटटाइप कण संक्रमण

नोट: जैव सुरक्षा कैबिनेट में यह चरण निष्पादित करें ।

  1. 24-कुआं की थाली में अतिसंवेदनशील कक्षों की सेल सीडिंग
    1. मानक सेल संस्कृति तकनीक द्वारा प्राप्त करें 80 − 90% संगामी ७५ सेमी अतिसंवेदनशील कोशिकाओं के2 फ्लास्क: सार्स के लिए वेरो-E6 सेल-सीओवी स्यूडोटाइप कणों (एसआरएस-एसपीपी) और हं-7 कोशिकाओं के लिए mers-सीओवी एस स्यूडोटाइप कणों (mers-एसपीपी) ।
      नोट: पुष्टि करने के लिए कि क्या स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन किया गया है, संक्रामक हैं, यह महत्वपूर्ण है कि स्यूडोविरिओन संक्रामकता assays के लिए उचित अतिसंवेदनशील सेल लाइन को सावधानीपूर्वक चुनें । खराब स्वतंत्र कोशिकाओं का उपयोग कम संक्रामकता के लिए नेतृत्व करेंगे ।
    2. पहले से 10 मिलीलीटर (३७ डिग्री सेल्सियस) डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं ।
    3. महाप्राण और अलग कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर ०.२५% ट्रिप्सिन समाधान के साथ पहले से ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम किया जाता है । कोशिकाओं की कुप्पी को ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखें, 5% सह2 इनकोबेटर 3 − 5 मिनट के लिए या जब तक कोशिकाएं अलग नहीं होती हैं ।
      नोट: से अधिक 5 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं incubating से बचें के रूप में यह आम तौर पर सेल clumping की ओर जाता है । हं-7 कोशिकाओं को विशेष रूप से इस आशय के प्रति संवेदनशील हैं ।
    4. dmem-C मध्यम जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें और सेल की गणना स्लाइड और प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं को गिन दें ।
    5. dmem-C के साथ 5 x 105 कोशिकाओं को पतला कोशिकाओं/
    6. अच्छी तरह से प्रति सेल समाधान के ०.५ मिलीलीटर के साथ एक 24-वेल प्लेट के बीज कुओं और धीरे से थाली आगे और पीछे और पक्ष को समान रूप से वितरित करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित, परिपत्र गति से परहेज
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है । समान रूप से वितरित कोशिकाओं सुनिश्चित करेंगे कि कोशिकाओं कुओं के केंद्र में झुरमुट नहीं है । इसके बदले में, यह अच्छा संक्रामकता assays सुनिश्चित करेगा । प्रत्येक स्यूडोटाइप कण (एसआरएस-एसपीपी, MERS-एसपीपी) और शर्त के लिए, तीन प्रायोगिक replicates के लिए तीन कुओं तैयार करते हैं । कुओं को गैर-संक्रमित (n.i.), खाली वेक्टर δ env कणों और सकारात्मक नियंत्रण कणों जैसे vsv-gpp के लिए शामिल करें
    7. एक ३७ डिग्री सेल्सियस में रात भर थाली (16 − 18 एच) सेते, 5% सह2 सेल संस्कृति इनकोबेटर
  2. कूटटाइप कण संक्रमण
    1. प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण और नेत्रहीन कोशिकाओं की एक संगामी कालीन है कि पुष्टि करते हैं ।
    2. स्यूडोटाइप वायरस के cryovials बर्फ पर गल लाने के लिए ।
    3. धो कोशिकाओं के साथ तीन बार ०.५ मिलीलीटर पूर्व warmed (३७ डिग्री सेल्सियस) dpbs
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है । कोशिकाओं है कि ठीक से पहले संक्रमण से rinsed नहीं कर रहे है आम तौर पर गरीब संक्रामकता readouts के लिए सीसा
    4. कोशिकाओं के अधिनाशकों को महाप्राण ।
    5. २०० μl के साथ गल गई स्यूडोटाइप कण समाधान के साथ inoculate कोशिकाओं ।
    6. एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 सेल संस्कृति इनकोबेटर में 1 − 2 एच के लिए कोशिकाओं को सेते हैं ।
    7. पूर्व-गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) dmem-सी माध्यम के ३०० μl जोड़ें ।
    8. एक ३७ डिग्री सेल्सियस में सेते कोशिकाओं, ७२ एच के लिए 5% सह2 सेल संस्कृति इनकोबेटर ।

5. लूसीफेरीज़ परख readout द्वारा संक्रामकता quantification

नोट: जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रारंभिक चरण निष्पादित करें ।

  1. गल ल्यूसिफरिन सब्सट्रेट (-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) और 5x ल्यूसिफरिन परख lysis बफर (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) जब तक वे कमरे के तापमान तक पहुंचने ।
  2. पतला luciferase परख lysis बफर बाँझ पानी के साथ 1x करने के लिए ।
  3. स्यूडोटाइप कणों से संक्रमित कोशिकाओं के महाप्राण ।
  4. एक अच्छी तरह से 1x luciferase परख lysis बफर के १०० μl जोड़ें ।
  5. एक घुमाव पर थाली प्लेस और 15 मिनट के लिए सेते कमरे के तापमान पर कमाल के साथ (इस बिंदु से बाद थाली एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के बाहर संभाला जा सकता है) ।
  6. प्रत्येक ट्यूब में ल्यूसिफरिन सब्सट्रेट के 20 μl जोड़कर एक अच्छी तरह के लिए microcentrifuge ट्यूब तैयार करते हैं ।
  7. luminometer पर बारी ।
  8. ल्यूसिफेरोन सब्सट्रेट के 20 μl युक्त एक ट्यूब को lysate के 10 μl स्थानांतरित करके एक अच्छी तरह से एक समय में luciferase गतिविधि माप एक प्रदर्शन करते हैं ।
  9. सामग्री मिश्रण करने के लिए धीरे ट्यूब झटका, लेकिन ट्यूब की दीवारों पर तरल displacing से बचने ।
  10. ट्यूब को डिवाइस में रखें और ढक्कन बंद कर दें ।
  11. luminometer का उपयोग करके ट्यूब के संदीप्ति मूल्य को मापने ।
  12. सापेक्ष प्रकाश इकाई के मापन को रिकॉर्ड करना ।
  13. दोहराएं कदम 5.8-5.12 तक सभी कुओं का विश्लेषण कर रहे हैं ।
    नोट: इस तरह के एक थाली पढ़ने luminometer के रूप में उपयुक्त उपकरणों के साथ, इस प्रक्रिया को स्वचालित रूप से किया जा सकता है । परख के लिए थाली प्रारूप को स्केल की आवश्यकता होगी (जैसे, ९६-well प्लेट प्रारूप) ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. गणना और सापेक्ष luciferase इकाइयों ' औसत और मानक विचलन की साजिश रचने
    1. एक सॉफ्टवेयर की साजिश रचने के लिए luciferase परख माप औसत और प्रयोगात्मक और जैविक replicates के मानक विचलन की गणना ग्राफ का उपयोग करें ।
    2. मानक विचलन वाले बार चार्ट के रूप में डेटा प्लॉट करना ।
      नोट: डेटा पर सांख्यिकीय विश्लेषण करते समय, डेटा सेट्स में कम से तीन जैविक प्रतिकृति को शामिल करना सुनिश्चित करें ।

Representative Results

एसएआरएस-सीओवी एस और MERS-सीओवी एस स्यूडोटाइप कणों के संक्रामकता assays के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में दिखाया गया है । के रूप में की उंमीद है, दोनों चित्रा 1ए और 1bके लिए, vsv जी pseudotyped सकारात्मक नियंत्रण कणों (vsv-gpp) 106 से 107 रिश्तेदार luciferase इकाइयों (rlu) रेंज में बहुत उच्च औसत संक्रामकता दी क्रमशः । सार्स के लिए-सीओवी एस स्यूडोटाइप कणों (चित्रा 1ए) अतिसंवेदनशील वेरो-E6 कोशिकाओं का संक्रमण, एक मजबूत औसत संक्रामकता लगभग ९.८ x 104 rlu पर मापा गया था । यह मान गैर-संक्रमित नियंत्रण (१.१ x 102 rlu), या (१.५ x 102 rlu) के लिए मापा गया मान से अधिक परिमाण के लगभग 3 आदेश है, जो किसी भी वायरल लिफाफा उनके सतह पर नच बंदरगाह नहीं है । इसी प्रकार, MERS-cov S स्यूडोटाइप कणों के लिए (चित्रा 1ख) हं-7 कोशिकाओं का संक्रमण, एक उच्च औसत संक्रामकता लगभग १.० x 106 rlu पर मापा गया था । यह गैर-संक्रमित नियंत्रण (०.८ x 102 rlu), या (२.० x 102 rlu) के लिए मापा गया मान से अधिक परिमाण के लगभग 4 आदेश है । एक अतिरिक्त संक्रामकता परख का प्रदर्शन किया गया जिसमें सार्स-एसपीपी और MERS-spp प्रश्नपत्र पतला था और वेरो-E6 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया (चित्रा 2ए) । इस परख पुष्टि की है कि luciferase गतिविधि मापा कणों की एकाग्रता पर निर्भर है कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया । एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम की भूमिका की पुष्टि करने के लिए 2 (ACE2) और dipeptidyl पेप्टिडेस 4 (DPP4), सार्स के रिसेप्टर्स-cov और MERS-cov, क्रमशः, mediating लगाव और स्यूडोटाइप कणों की प्रविष्टि में, हम खराब-permissive hek-293t कोशिकाओं का इस्तेमाल किया और उन्हें ट्रांसफेक्टेड या तो ACE2 या DPP4 (चित्रा 2बी) व्यक्त करने के लिए । ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं तो एक संक्रामकता परख के लिए इस्तेमाल किया गया । इस विश्लेषण को दर्शाता है कि ACE2 और DPP4 के overexpression पर, वहां एक ~ 4-लॉग और ~ 2-sars के लिए लॉग वृद्धि-spp और MERS-spp संक्रामकता, क्रमशः, पुष्टि कि स्यूडोविरिओन के रिसेप्टर उपयोग देशी वायरस के समान है ।

यहां दिखाए गए उदाहरणों में नकारात्मक (गैर-संक्रमित, δ env कणों) के साथ-साथ सकारात्मक नियंत्रण (vsv-gpp) शर्तों को शामिल करने के महत्व को प्रदर्शित करता है जब स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन होता है । वास्तव में, सकारात्मक नियंत्रण vsv-gpp कणों हम का आकलन करने के लिए कि क्या छद्म कणों का एक विशेष बैच कार्यात्मक और संक्रामक स्यूडोविरिओन उपज में सफल था की अनुमति देते हैं । सबसे स्तनधारी कोशिका लाइनों में vsv-gpp कणों द्वारा ठेठ संक्रमण के अपेक्षित परिणाम 106− 107 rlu रेंज में हैं । hek के साथ कोई समस्या-293t/17 उत्पादक कोशिकाओं (उच्च मार्ग संख्या, सेल घनत्व के साथ मुद्दों) या गरीब अभिकर्मक क्षमता समग्र pseudotyped कण उत्पादन और संक्रामकता प्रभाव कर सकते हैं । इसके अलावा, नकारात्मक नियंत्रण की स्थिति भी महत्वपूर्ण है के रूप में वे हमें एक विशेष सेल लाइन में rlu माप के आधाररेखाओं का आकलन करने की अनुमति (गैर संक्रमित हालत) और गैर कणों के विशिष्ट internalization (δ env संक्रमण) जो मध्यस्थता नहीं है एक वायरल लिफाफा प्रोटीन से । आदर्श रूप में, एक दिए गए प्रकार के कण के लिए एक वायरल लिफाफा ब्याज के प्रोटीन के साथ स्यूडोटाइप, यह मान प्राप्त करने के लिए अनुशंसित है कि नकारात्मक नियंत्रण मूल्यों से अधिक परिमाण के कुछ आदेश हैं, जैसा कि यहाँ चित्र 1ए, बीमें दिखाया गया है । हालांकि, यदि किसी दिए गए सेल प्रकार के लिए एक स्यूडोटाइप वायरस संक्रमण बहुत कम संक्रामकता देता है (यानी, नकारात्मक नियंत्रणों के करीब जैसे चित्रा 2बी में गैर-ट्रांसफेक्टेड n.t. शर्तों) इसका मतलब यह नहीं है कि स्यूडोटाइप कण उत्पादन दोषपूर्ण था । यह अच्छी तरह से हो सकता है कि विशेष रूप से सेल इस्तेमाल किया लाइन नहीं है या खराब संक्रमण के लिए स्वतंत्र । यह जांच करने के लिए अनुशंसित है कि क्या किसी दिए गए सेल प्रकार के वायरस की जांच की जा रही द्वारा संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होने की उम्मीद है । प्लाज्मिड (एस) वायरल रिसेप्टर व्यक्त (ओं) के साथ खराब स्वतंत्र कोशिकाओं transfecting अधिक कुशल वायरल प्रवेश और संक्रमण होने की अनुमति कर सकते हैं, के रूप में चित्रा 2बीमें दिखाया गया है, जहां ACE2 और लक्ष्य hek में DPP4 रिसेप्टर्स के transfecting पर-293t कोशिकाओं, वहां एक ~ 4-और ~ 2-संक्रामकता में प्रवेश के लिए क्रमशः वृद्धि हुई है ।

प्लाज्मिड अभिकर्मक मात्रा
pcmv-mlvgagpol mlv झूठ और पीओएल एन्कोडिंग प्लाज्मिड ३०० एनजी
ptg-luc स्थानांतरण वेक्टर luciferase रिपोर्टर के साथ ४०० एनजी
pcdna-सार्स-एस, pcdna-MERS-s या खाली वेक्टर ३०० एनजी
कम सीरम कोशिका संवर्धन माध्यम से ५० μl

तालिका 1: plasmids की मात्रा और कम सीरम कोशिका संस्कृति मध्यम एक अच्छी तरह से एक 6-hek के एक अच्छी तरह से थाली-293t के लिए आवश्यक/ प्लाज्मिड तैयारी की एकाग्रता से, प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यक मात्रा तक पहुंचने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें । एक से अधिक अच्छी तरह से एक ही plasmids के साथ transfected है, तो, transfected करने के लिए कुओं की आवश्यक संख्या से गुणा मात्रा, और बाद में चरणों में मिश्रण से बाहर चलने से बचने के लिए गणना में एक अतिरिक्त अच्छी तरह से शामिल हैं । डीएनए की कुल मात्रा को ट्रांसफेक्टेड किया जा रहा है 1 μg/ plasmids लेखकों के अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।

अभिकर्मक मात्रा
ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक 3 μl
कम सीरम कोशिका संवर्धन माध्यम ४७ μl

तालिका 2: अभिकर्मक अभिकर्मक की मात्रा और कम सीरम कोशिका संस्कृति मध्यम एक अच्छी तरह से एक 6-hek के अच्छी तरह से थाली-293t के लिए आवश्यक/ transfect और बाद के चरणों में मिश्रण से बाहर चलने से बचने के लिए गणना में अतिरिक्त कुओं को शामिल करने के लिए कुओं की आवश्यक संख्या से गुणा मात्रा. ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक: इस्तेमाल किया प्लाज्मिड डीएनए अनुपात 3:1 है ।

Figure 1
चित्रा 1 : कोरोनावायरस एस-स्यूडोटाइप कण संक्रामकता अतिसंवेदनशील मेजबान कोशिकाओं में एक मूरीन ल्यूकेमिया वायरस (mlv) रीढ़ और luciferase रिपोर्टर जीन का उपयोग कर assays । (क) सार्स-सीओवी एस स्यूडोटाइप कण वेरो-E6 कोशिकाओं में संक्रामकता परख । (B) MERS-cov S स्यूडोटाइप कण में संक्रामकता परख हं-7 कोशिकाओं । (A) और (B) दोनों के लिए, प्लॉट किए गए डेटा मानक विचलन (s.d.) के संगत त्रुटि पट्टियों के साथ, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से औसत सापेक्ष luciferase इकाइयों से संबंधित होते हैं. y-अक्ष पर लॉग10 स्केल में प्लॉट किए गए डेटा । n.i.: गैर-संक्रमित नियंत्रण; δ env: छद्म के साथ संक्रमण वायरल लिफाफा नच और vsv-gpp कमी कणों: सकारात्मक नियंत्रण vsv जी लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन असर छद्म टाइप कणों के साथ संक्रमण. अंय संक्षिप्त नाम इस्तेमाल किया, सार्स-spp: सार्स के साथ संक्रमण-cov एस स्यूडोटाइप कणों, mers-spp: mers-cov एस स्यूडोटाइप कणों के साथ संक्रमण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : सार्स-एसपीपी और MERS-एसपीपी प्रविष्टि में ACE2 और DPP4 रिसेप्टर्स की एकाग्रता-सीओवी एस-स्यूडोविरिओन संक्रामकता और भूमिका की निर्भरता । (क) सार्स-एसपीपी और MERS-एसपीपी संक्रामकता की एकाग्रता-निर्भरता luciferase गतिविधि परख द्वारा मापा जाता है । स्यूडोविरिओन प्रश्नपत्र पतला और वेरो-E6 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । (ख) सार्स की संक्रामकता परख-spp और MERS-खराब स्वतंत्र hek में spp-293t लक्षित कोशिकाओं को ACE2 एक्सप्रेस, और DPP4 रिसेप्टर्स, क्रमशः transfected । डेटा पर लॉग10 स्केल में y-अक्ष के रूप में चित्र 1 में डुप्लिकेट प्रयोगों से, मानक विचलन (s.d.) के संगत त्रुटि पट्टियों के साथ प्लॉट किए गए । n.t.: गैर ट्रांसफेक्टेड नियंत्रण hek-293t कोशिकाओं; ACE2: एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम 2 (सार्स-cov रिसेप्टर) और DPP4: dipeptidyl पेप्टिडेस 4 (MERS-cov रिसेप्टर). अंय संक्षिप्त रूप में चित्र 1के समान ही हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल एक बीएसएल-2 की स्थापना में जोखिम समूह 3 कोरोनावायरस, एसएआरएस-सीओवी और मर्स-सीओवी के एस प्रोटीन के असर वाले स्यूडोटाइप कणों को कुशलतापूर्वक उत्पादन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है । इन कणों, जो एक luciferase रिपोर्टर जीन को शामिल, हमें आसानी से एक अपेक्षाकृत सरल luciferase परख४८,४९,५०,५१द्वारा कोरोनाविरस एस-मध्यस्थता प्रविष्टि घटनाओं यों तो करने के लिए सक्षम. संक्रामकता में स्वतंत्र कोशिकाओं का उपयोग कर, हम पुष्टि करते है कि luciferase गतिविधि मापा कणों की एकाग्रता पर निर्भर है । इसके अलावा, ACE2 और DPP4 रिसेप्टर अभिकर्मक खराब स्वतंत्र कक्ष लाइनों में अधिक कुशल प्रवेश के लिए अनुमति देता है, जैसे hek-293t कोशिकाओं । विधि अत्यधिक अन्य वायरल लिफाफा नच के लिए अनुकूलनीय है और बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है४८,४९,५०,५१,५२,५३, ५५,५६,५७,५८,५९, अक्सर जैव रासायनिक विश्लेषण या देशी वायरस के संक्रमण की तरह अन्य assays के पूरक करने के लिए.

प्रोटोकॉल हम यहां का वर्णन retrovirus mlv कि एक luciferase रिपोर्टर शामिल पर आधारित है । हालांकि, यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि अन्य स्यूडोटाइपिंग प्रणालियों की एक बहुत व्यापक सरणी है जिसे सफलतापूर्वक पैकेजिंग के लिए विकसित किया गया है कोरोनाविरस एस12,13,25,26, 30 , 31 , ३२ और अन्य वायरल लिफाफा नच10,11,14,16,17,23,24, 29 , ३३ , ३८ , ४० , ४२ , ४४ , ४६. इनमें से कुछ अन्य प्रणालियाँ सामान्यतः प्रयुक्त एमएलवी रेट्रोवायरल कोर7,8,9,10,11,12,13 पर आधारित हैं ,14,15,16,17,18,19,20, या व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली मसूर की दाल पर आधारित एचआईवी-1 छद्म टंकण प्रणाली विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करते हुए23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,३२,३३,३४,३५, या के साथ रैब्डोवायरस vesicular स्टेमाइटिस वायरस (vsv) कोर के रूप में, जो एक विस्तृत विविधता को शामिल करने की अनुमति देता है लिफाफा नच के, और फिर से कार्यरत विभिन्न रणनीतियों के साथ३७,३८,३९,४०,४१,४२,४३ ,४४,४५,४६,४७. इसके अलावा, अन्य रिपोर्टर्स जैसे कि जीएफपी11,13 और आरएफपी३६जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, या β-galactosidase16,17 और स्रावित की तरह luciferase के अलावा अन्य एंजाइमों क्षारीय फॉस्फोटेज (सीएपी)४२ सफलतापूर्वक मापन के लिए नियोजित किया गया है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत परख में, एक क्षणिक अभिकर्मक mlv और cov एस जीन और प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, अभिव्यक्ति के लिए अन्य रणनीतियां हैं, जैसे स्यूडोटाइप वायरस के उत्पादन के लिए स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी7,14। इन प्रणालियों में से प्रत्येक के रूप में अपने फायदे और नुकसान है, यह निर्णय लेने के लिए महत्वपूर्ण है, जब तय है जो प्रणाली सबसे अच्छा सूट एक जांचकर्ता की जरूरत है स्यूडोविरिओन कोर (mlv, एचआईवी-1, vsv या दूसरों), कैसे फैसला करने के लिए निंनलिखित महत्वपूर्ण मापदंडों चयनात्मक एक विशेष छद्म टंकण कोर एक विशिष्ट वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन, परख readout के लिए रिपोर्टर को शामिल करने में है (gfp, luciferase, seap या अन्य), और अभिकर्मक रणनीति (सह में शामिल plasmids की संख्या-अभिकर्मक, क्षणिक अभिकर्मक या स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी).

इस विधि में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो जोर देने के लिए महत्वपूर्ण हैं । सेल घनत्व, विशेष रूप से हेक-293t/17 उत्पादक सेल लाइन सफल ट्रांसफेक्शन सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है । 40 की सीमा में एक सेल घनत्व-60% कन्फ्लुएंसी इष्टतम होना पाया गया । उच्च घनत्व आम तौर पर कम अभिकर्मक क्षमता और कम कण उत्पादन में परिणाम. इसके अलावा, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि हेक-293t/17 कोशिकाएं अन्य सेल लाइनों की तुलना में कम आसंन हैं । उन्हें अनावश्यक रूप से अलग करने से बचने के लिए देखभाल का प्रयोग करना चाहिए । एक विकल्प के पालन को बढ़ाने के लिए पाली-डी-lysine के साथ सेल संस्कृति प्लास्टिक सतहों का इलाज है । इसके अलावा, उच्च सेल मार्ग अक्सर गरीब ट्रांसफेक्शन दरों में परिणाम है । हेक-293t/17 कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक जोड़ने के बाद, यह भी याद रखना महत्वपूर्ण है कि कोशिका पारगम्यता बढ़ जाती है । यही कारण है कि इस बिंदु पर यह सबसे अच्छा है के रूप में वे cytotoxicity वृद्धि हो सकती है एंटीबायोटिक दवाओं युक्त माध्यम का उपयोग कर से बचने के लिए । स्यूडोटाइप कणों को एकत्र करने से पहले, ट्रांसफेक्टेड हेक-293t/17 सेल सुपरनैटेंट के रंग की जांच करें । आम तौर पर, transfection के ४८ ज के बाद, सेल संस्कृति मध्यम रंग एक नारंगी गुलाबी टिंगल लेता है । पीले रंग का मध्यम आम तौर पर गरीब छद्म कणों पैदावार के लिए अनुवाद और अक्सर सेल बोने घनत्व या उच्च मार्ग संख्या के साथ मुद्दों का एक परिणाम है ।

इस प्रोटोकॉल में, स्यूडोटाइप कण उत्पादन 6-वेल प्लेट प्रारूप में किया जाता है । उत्पादित कणों की मात्रा बढ़ाने के लिए, एक 6-वेल प्लेट के कई कुओं को एक ही plasmids मिश्रण के साथ transfected किया जा सकता है और supernatants एक साथ परित किया जा सकता है । पूल तो स्पष्ट किया जा सकता है, फ़िल्टर्ड और aliquoted । वैकल्पिक रूप से, उत्पादन पैमाने पर करने के लिए, जहाजों के अन्य प्रकार (जैसे, 25, या ७५ सेमी2 flasks) इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, ट्रांसफेक्शन शर्तों को तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल में, संक्रामकता परख एक 24-अच्छी तरह से थाली प्रारूप और एक luminometer है कि केवल माप एक समय में एक ट्यूब की अनुमति देता है का उपयोग किया जाता है । उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए, अंय प्रारूपों भी इस तरह के रूप में संभव है ९६-well प्लेट प्रारूप और एक थाली रीडर luminometer । ल्यूसीफेरेज परख के लिए वॉल्यूम और अभिकर्मकों को तदनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता है । cryovials में स्यूडोटाइप कणों का भंडारण-८० डिग्री सेल्सियस संक्रामकता में उल्लेखनीय कमी के बिना कई महीनों के लिए अपनी स्थिरता बनाए रखता है । यह उनके विषय के लिए उन्हें फ्रीज-गल चक्र के रूप में यह समय के साथ उनके संक्रामकता में कमी होगी अनुशंसित नहीं है. इस प्रकार, यह उन्हें एक संक्रमण से पहले इस तरह के 0.5-1 मिलीलीटर और गल के रूप में छोटे aliquots में स्टोर करने के लिए सबसे अच्छा है ।

यहां प्रस्तुत विधि में कई सीमाएं हैं । एक महत्वपूर्ण तथ्य यह है कि छद्म टाइप कणों केवल वायरल प्रवेश घटनाओं को फिर से दोहराती है । संक्रामक जीवन चक्र में अन्य चरणों का विश्लेषण करने के लिए, अन्य assays आवश्यक हैं । इसके अलावा, प्लाज्मा झिल्ली पर mlv कणों कली के रूप में, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन का अध्ययन किया जा रहा उत्पादन के दौरान स्यूडोविरिओन में समावेश के लिए प्लाज्मा झिल्ली के लिए भी यातायात की जरूरत है. इस तरह के रूप में, यह जानना महत्वपूर्ण है जहां कोशिका में एक विशेष वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के साथ subcellular स्थानीयकरण visualizing द्वारा जैसे अभिकर्मक शर्तों में व्यक्त की है, और/ प्रोटीन । इसके अलावा, जबकि प्रोटोकॉल का वर्णन चरणों का उत्पादन और संक्रामकता परीक्षण करने के लिए, यह विस्तार से नहीं है कैसे को मापने के लिए वायरल लिफाफा आभासी छद्म में ग्लाइक । एक विधि कणों के केंद्रित समाधान पर पश्चिमी ब्लॉट assays प्रदर्शन करने के लिए है, के रूप में पहले वर्णित५०,५१ के लिए MERS-cov एस निगमन. इन assays में, s लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के MERS-cov कैप्सिड के साथ जांच की है (p30) mlv का प्रोटीन, जो हमें कणों में एस प्रोटीन के निगमन सामान्य करने की अनुमति. ऐसे assays के अंय उदाहरण का विश्लेषण वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन शामिल करने के लिए स्यूडोविरिओन में सार्स-सीओवी एस निगमन के लिए एक एचआईवी-1 लेंटीवायरल स्यूडोविरिओन सिस्टम३२ , इबोला ग्लाइरोप्रोटीन (जीपी) एक और एमएलवी स्यूडोटाइप में किया गया है । कण प्रणाली17, और इन्फ्लूएंजा hemagglutinin (हा) और neuraminidase (एनए) में vsv स्यूडोविरिन्स३८. स्यूडोटाइप कण उत्पादन की विशेषता में हाल ही में एक विकास अभिनव इमेजिंग उपकरणों जैसे nanosight का उपयोग है: यह हमें सीधे कल्पना, मात्रात्मक, और आकार वायरल कणों५०के लिए सक्षम बनाता है । डिवाइस समग्र कण उत्पादन पर विस्तृत जानकारी प्रदान करता है; हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि यह लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन निगमन पर जानकारी प्रदान नहीं करता है । इन बहुमुखी स्यूडोविरिओन कणों के आवेदन के लिए एक भविष्य की दिशा व्यक्तिगत वायरल फ्यूजन एकल कण ट्रैकिंग का उपयोग कर घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए है, microfluidics और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी६०,६१ ,६२. इस तरह के दृष्टिकोणों को इंफ्लूएंजा वायरस और डियर कोरोनाविरस कणों के साथ-साथ इंफ्लूएंजा हा-और एनए-स्यूडोटाइप vsv आधारित स्यूडोविरिन्स६३पर सफलतापूर्वक लागू किया गया । वर्तमान में कोरोनाविरस एस-स्यूडोटाइप एमएलवी आधारित कणों के लिए लागू की गई ऐसी तकनीकों की तैनाती विकसित की जा रही है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उपयोगी टिप्पणियों के लिए whittaker और डैनियल लैब्स के सभी सदस्यों को धंयवाद देना चाहता हूं । अनुसंधान धन nih अनुदान R21 AI111085 और R01 AI135270 द्वारा प्रदान किया गया था । टीटी अनुदान सं के तहत cornell विश्वविद्यालय और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप कार्यक्रम में राष्ट्रपति जीवन विज्ञान फैलोशिप से समर्थन स्वीकार करता है । DGE-१६५०४४१. l.n. अनुदान सं के तहत एक शमूएल सी फ्लेमिंग परिवार स्नातक फैलोशिप और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करता है । DGE-१६५०४४१. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन १५०४८४६ (S.D. और g.r.w.) द्वारा भी समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100

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References

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