Summary
피부 부상에 타고 난 면역 반응의 실시간 탐지 및 쥐의 포도 상 구 균 감염에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 비교 LysM EGFP 여 쥐 (형광 neutrophils 보유) LysM EGFP와 잡종 immunodeficient 마우스 스트레인, 우리가 미리 감염에 대 한 우리의 이해 및 감염을 방지 하는 방법의 개발.
Abstract
황색 포도상구균 (S. 구 균) 감염, 메 티 실린 내성 얼룩을 포함 하 여 보건 의료 시스템에 대 한 엄청난 부담 있습니다. 매년 등반 S. 구 균 감염의 발병 률, 그것의 pathogenicity 추가 연구에 대 한 수요가 있다. 전염 성 질환의 동물 모델 호스트 병원 체 응답의 우리의 이해를 전진 하 고 효과적인 치료제의 개발으로 이어질. 호 중구는 감염 떨어져 벽 세균성 클리어런스; 촉진 하 농 양을 형성 하 여 S. 구 균 감염을 제어 하는 타고 난 면역 반응에서 기본 역 종종 S. 구 균 피부 감염을 침투 하는 호 중구 수가 질병 결과와 상관 한다. 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) Lysozyme M (LysM) 발기인 지역 (주로 호 중구에 의해 표현)에 삽입, 소유 하는 LysM EGFP 마우스와 함께에서 사용 될 때 vivo에서 전체 동물 형광 이미징 (FLI) 제공를 상처 입은 피부에 호 중구 이주 noninvasively 및 경도 측정을 의미 합니다. 발광 S. 구 균 과 결합 될 때 긴장과 순차적 vivo에서 전체 동물 발광 영상 (BLI), 그것은 경도 호 중구 모집 역학과의 사이트에서 vivo에서 세균성 부담 모니터링 가능 해상도 또는 죽음 감염의 발병에서 마 취 생쥐에 감염. 마우스는 더 효과적인 식민과 인간에서 감염을 촉진 하는 S. 구 균 에 의해 생산 독성 요인의 수를 방지. 영구 미 균 검사를 더 민감한 동물 모델을 제공 하는 immunodeficient 쥐 감염 및 치료의 능력을 타고 난 면역 반응 향상. 여기, 우리는 야생-타입 LysM EGFP 쥐 S. 구 균 피부 상처 감염 조사를 함께 MyD88 불충분 한 쥐 (LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐) 자란 LysM EGFP 마우스에 응답을 특징. Multispectral 동시 탐지 vivo에서 FLI, vivo에서 씨를 사용 하 여 세균성 부담을 사용 하 여 호 중구 모집 역학의 연구를 활성화 하 고 상처 치유 경도 noninvasively 시간이 지남에.
Introduction
황색 포도상구균 (S. 구 균) 피부 및 연 조직 감염 (SSTIs) 미국1의 대부분을 차지 한다. 발생률 감염 지난 2 년간2, 지 속성의 메커니즘 및 새로운 치료 전략의 발견의 연구 동기 부여 동안 꾸준히 증가 메 티 실린 내성 S. 구 균 (MRSA)의. MRSA 감염에 대 한 치료의 표준 조직 항생제 치료, 하지만 시간3 MRSA 항생제에 저항력이 점점 되고있다 그리고 이러한 약물에 특히 부정적인 건강 효과 일으키는 호스트의 유익한 미생물을 점감 할 수 있다 아이 들4. 전 임상 연구5MRSA 감염 치료 하는 대체 전략 검사 하지만 번역 클리닉에 이러한 접근 호스트 면역 반응6저지 독성 요인의 출현으로 인해 어려운 입증 했다. 드라이브 미 균 SSTIs 호스트 병원 체 역학을 해 부, 우리 비 침범 성 결합 및 호 중구 수의 경도 판독 상처 침대에 세균성 풍부의 운동 측정을 가진 모집 영역 상처.
호 중구는 인간과 세균 감염7초 동 조치에서 가장 풍부한 순환 백혈구. 호 중구는 반응성 산소 종, 프로 테아 제, 항균 성 펩 티 드 및 기능적인 응답의 생산을 포함 하 여 그들의 살 균 메커니즘으로 인해 미 균 감염에 대 한 효과적인 호스트 응답에 대 한 필요한 구성 요소 식 균 작용 및 호 중구 extracellular 함정 생산8,9를 포함 하 여. Chediak-히가시 증후군 등 만성 granulomatous 질환 호 중구 기능에 유전 결함을 가진 인간 환자는 S. 구 균 감염에 걸릴을 보여줍니다. 또한, 환자 유전자 (예: 선 천 성 호 중구 감소 증)와 인수 (예: 화학 요법 환자에서 호 중구 감소 증) 결함에 호 중구 수는 또한 S. 구 균 감염10에 매우 취약. 지우기 S. 구 균 감염에서 호 중구의 중요성을 감안할 때, 그들의 면역 능력을 강화 하거나 S. 구 균 병 변 내에서 그들의 숫자를 튜닝은 감염을 해결에 효과적인 전략을 증명할 수 있습니다.
지난 10 년간, 형광 호 중구 기자와 유전자 변형 쥐 그들의 밀매11,12연구 개발 되었습니다. 호 중구 기자 마우스 전체 동물 이미징 기술을 결합 조직 및 장기에 호 중구의 spatiotemporal 분석을 허용 합니다. S. 구 균의 발광 종자와 결합 하면, S. 구 균 풍요에 대 한 응답에서 호 중구의 축적을 추적 하 고 세균 독성의 맥락에서 지 속성 요소는 직접 및 간접적으로 영향을 받는 조직13,14,,1516호 중구 수 교란
마우스는 인간 보다 미 균 독성 및 면역 회피 메커니즘을 적습니다. 따라서, 야생-타입 마우스의 효능을 조사 하는 이상적인 동물 모델을 되지 않을 수 있습니다는 만성 S. 구 균 치료 치료 주어진 감염. MyD88 불충분 한 쥐 (즉, MyD88-/- 생쥐), 부족 기능 interleukin-1 수용 체 (IL-1R) 및 통행세 같이 수용 체 (TLR) 신호, 표시 S. 구 균 감염에 비해 더 큰 민감성 immunocompromised 마우스 스트레인 야생-타입 마우스17 그리고 피부18에 S. 구 균 감염의 사이트에 호 중구 매매에 장애. MyD88-/- 생쥐에서 형광 호 중구 기자를 보유 하 고 있는 마우스 스트레인의 개발 조사 현재 neutrophil에 비해 S. 구 균 감염을 치료 하는 요법의 효능에 대 한 대체 모델을 제공 하고있다 기자 쥐입니다.
이 프로토콜에서 우리 immunocompromised LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐에서 S. 구 균 감염을 특성화 하 고 시간 과정 및 LysM EGFP 쥐과 감염의 해상도 비교. LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐 해결 되지 않으면, 만성 감염을 개발 하 고 8 일 후 감염에 굴복 하는 75%. 초기 호 중구 채용에 중요 한 결함 발생의 감염, 염증 성 단계 이상 72 h 그리고 감염의 후반 단계에서 50% 적은 neutrophils 모집. LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐에 게 특정 스트레인의 새로운 치료 기술 현재에 비해 S. 구 균 감염을 대상으로 효능을 평가 하는 엄격한 전 임상 모델의 증가 자화 율 모델을 야생-타입 쥐, 감염에 대 한 타고 난 면역 반응 향상을 목표로 특히 기법을 활용 합니다.
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Protocol
모든 마우스 연구 검토 되었다 기관 동물 관리 및 사용 위원회 UC 데이비스에 의해 승인 및 동물 복지 행위와 건강 연구 연장 행위의 지침에 따라 수행 했다. 동물 들과 함께 작업 하는 경우 멸 균 장갑을 사용 해야 합니다.
1. 마우스 소스 및 주택
- LysM-eGFP 마우스 C57BL/6J 유전 배경에 파생12위에서 설명한 대로. LysM-EGFP × MyD88-/- 마우스 C57BL/6J 배경에 MyD88-/- 생쥐와 건너 LysM EGFP 쥐에 의해 파생 됩니다.
- 집 마우스는 물고기에서. 이러한 연구에 대 한 동물, 수술 및 단일 지 내게 다음 수술 전에 그룹에 데이비스가 주 대학에 보관 되어 있었다. 10-16 주 사이의 마우스를 사용 합니다.
2. 세균성 준비 및 정량화
- 제거는 발광 얼음 해 동-80 ° C 저장소에서 관심의 S. 구 균 긴장. 5% 소 혈액 한 천 배지에서 행진. 37 ° C에서 하룻밤 (16h) 습도 인큐베이터에서 질주 된 접시를 품 어.
참고:이 프로토콜에서 ALC2906 SH1000 변형 사용 되었다. 이 긴장은 Photohabdus luminescens18 luxABCDE 기자 카세트를 융합 하는 페니실린 의무적인 단백질 2 모터와 셔틀 플라스 미드 pSK236를 포함 합니다. - 순수한 물, 그리고 오토 클레이 브 소독 하는 TSB의 mL 당 TSB 가루 0.03 g을 혼합 하 여 tryptic 간장 국물 (TSB)를 준비 합니다. 냉각 되 면, 모든 필요한 항생제 무 균 기술을 사용 하 여 추가 합니다. 이 프로토콜에서 생물 발광 luxABCDE 카세트 포함 된 pSK236 셔틀 플라스 미드의 표현에 대 한 선택 하는 TSB를 페니18 10 µ g/mL를 추가 합니다.
- TSB에 하룻밤 문화 시작 10 µ g/mL 페니와 S. 구 균 격판덮개에서 3-4 별도 식민지를 선택 합니다. 37 ° C에서 하룻밤 (16h) incubating 뿌리에 박테리아를 품 어.
- 10 µ g/mL 페니와 TSB에 샘플 1시 50분을 diluting 하 여 하룻밤 문화에서 새로운 세균성 문화를 시작 합니다. 200 rpm와 37 ° C에서 incubating 셰이 커에 문화
- S. 구 균을 분한 후 두 시간 모니터링 600에서 광학 밀도 분 광 광도 계에 nm (OD600). OD600 대 중반 로그 단계 성장 찾는 데 시간을 관찰 합니다. ALC2906 SH1000 스트레인에 대 한 0.5 세600 중반 로그 이며 1 x 108 CFU/mL (그림 1)의 농도에 해당 합니다.
- OD600 0.5 이면 씻어 박테리아 얼음 DPBS와 1:1. 3000 x g 와 4 ° C에서 10 분 동안 박테리아 원심 신중 하 게 가만히 따르다는 상쾌한 고 추가 냉장된 DPBS와 소용돌이 철저 하 게 추가 합니다. G 와 4 ° C x 3000에서 10 분 동안 한 번 더 원심 분리기
- 신중 하 게는 상쾌한을 가만히 따르다. 원하는 농도에 세균성 펠 릿을 resuspend. 이러한 연구에 대 한 ALC2906 SH1000 3 mL을 수집 하 고 1.5 ml PBS, 약 2 x 108 CFU/mL의 세균 농도에 연관의 resuspend. 사용까지 얼음에 박테리아를 유지.
- 박테리아 농도 확인 하려면 100 µ L 세균 샘플 1:10,000 및 1:100,000 PBS에 희석. 한 천 배지에서 20 µ L aliquots 플레이트. 총 검사 16 헤 수 CFUs에 대 한 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어 하 고 세균성 농도 다음 날을 계산.
3. excisional 피부 Wounding 및 S. 구 균 으로 접종
- 복 주입을 통해 각 마우스를 0.03 mg/mL buprenorphine 염 산 염 (~0.2 mg/kg)의 100 µ L를 관리 합니다.
- 20 분 후 주입, 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소 챔버에 장소 2-4 마우스 일단 마우스는 완전히 마 취, 코 콘을 한 번에 한 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소에 연결 된 마우스를 전송 합니다. 마우스는 완전히 단단히 각 후방 발 엄지와 집게 손가락 사이 곤란 하 게 하 여 마 취를 확인 합니다. 동물 핀치에 응답 하지 않는 경우 다음 단계를 진행 합니다.
- 마우스의 뒷면에 2 인치 섹션 1 인치 전기 면도기로 면도 하 고 모피 잘라낸 깨끗 한 지우기 또는 거 즈를 사용 하 여 영역을 지웁니다. 초과 염증을 일으킬 수 있기 때문에 탈모 로션을 사용 하지 마십시오.
- 깨끗 한 마우스의 뒤로 처음 10 %povidone-요오드 젖은 거 즈와 함께 다음 70% 에탄올 젖 었 거 즈. 나선형 패턴, 외과 영역의 중심에서 바깥쪽으로 이동 영역을 청소. 수술 전에 건조 외과 영역에 대 한 약 1 분을 기다립니다.
-
두 손가락 사이 느슨하게 마우스 뒷면 면도 잡고 누르고 단단히 준비 외과 영역의 중앙에 살 균 6 m m 펀치 생 검. 당겨 하지 마십시오 피부 긴장 늦추지.
- 트위스트 원형 개요 개요의 적어도 한 부분에서 피부를 통해 완벽 하 게 인하 피부에 만들려고 펀치 생 검. 수 기본 근 막 또는 조직으로 잘라 하지 않도록 주의 하십시오.
- 살 균가 위와 집게를 사용 하 여 표 피와 진 피 펀치 생 검에 의해 각 인 원형 패턴을 통해 잘라.
4. 미 균 접종
- 원하는 발광 세균 접종으로 28 G 인슐린 주사기를 채우십시오. 이 연구에서는 관리 1 x 108 CFU/mL의 농도 (50 µ L). 볼륨의 이상의 100 µ L를 관리 하지 않습니다.
-
마우스의 뒷면에 상처의 중심에 조직과 근 막 사이 접종의 50 µ L을 주입. 확인은 접종 최소한의 누설 또는 분산 상처의 중심에 거품을 형성 합니다.
- 진 피 쪽으로 당겨, 주사기는 조직에 거의 평행한 누른 저항에 갑자기 감소 느낌, 근 막의 피어 싱 하는 것을 나타내는 때까지 천천히 조직에 주사기를 밀어. 조심 스럽게 상처의 중심으로 주사기를 리드 하 고 천천히는 접종을 분배. 동물에서 주사기를 천천히 제거 합니다.
- 위에서 설명한 대로 감염된 동물의 상처에 살 균 PBS의 동일한 볼륨을 삽입할.
- 그것의 감 금에 있는 동물을 반환 합니다. 케이지 열 램프 아래에서 또는 열 패드 위에 놓고 마 취에서 회복까지 동물을 모니터링 합니다.
5.에 비보 씨 FLI
- 악기 소프트웨어를 통해 전체 동물 영상을 초기화 합니다. 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소를 받고 챔버에 마우스 anesthetize Nosecones는 영상 내부에 마 취를 제공 합니다.
-
영상에 상처와 감염 된 마우스를 놓습니다. 상처는 가능한 평면 같은 마우스를 놓습니다. 다음 순서 대로 설치를 사용 하 여 이미지에 마우스를.
- 이미지 모드와 발광 고 사진을 선택 합니다. 노출 시간은 작은 binning와 F/중지 1 (발광)와 F/중지 8 (사진)에서 1 분입니다. 배기 필터는 열려있습니다. 이미지를 기록 하기 위해 취득 버튼을 클릭 합니다.
- 형광 및 사진 이미지 모드 선택 합니다. 노출 시간은 1 작은 binning 및 F/정지 1 (형광) s와 F/중지 8 (사진) 465/30의 여기 파장으로 nm와 높은 램프 강도 방출 파장 520/20 nm. 이미지를 기록 하기 위해 취득 버튼을 클릭 합니다.
- 마 취에서 회복까지 그것의 감 금 소 및 모니터에 동물을 반환 합니다.
- 이미지 마우스 매일 설명 대로 위의입니다.
6. 이미지 분석
- 오픈 이미지를 측정할 수입니다.
- 둘러싼 각 마우스 이미지에 대 한 피부를 포함 한 전체 상처 영역에 관심 (ROI)의 큰 원형 영역을 배치 합니다. Neutrophil vivo에서 FLI EGFP 신호 및 생체 조건 씨 미 균 신호 몇 일 후 상처 가장자리를 넘어 확장 하 고 이러한 연구 (그림 2A 와 2B)에 포함 됐다. 측정 ROI 와 각 마우스에 대 한 평균 유량에 대 한 레코드 값을 클릭 합니다. 각 시간 대 신호 (p/s)의 평균 유량을 플롯 합니다.
-
호 중구 또는 S. 구 균 은 상처에서의 절대 숫자는 원하는 경우 다음과 같은 실험을 수행 합니다.
- 호 중구 수 FLI EGFP vivo에서 신호를 상관 관계, C57BL/6J 쥐, 위에서 설명한 대로 상처와 LysM EGFP 또는 LysM-EGFPxMyD88-/- 기증자 로부터 골 수 파생 된 호 중구 (5 x 105 1 x 107)의 범위를 전송 바로 위에 다른 상처. 이미지 설명으로 위의 상관 관계가 vivo에서 FLI EGFP 호 중구의 알려진된 수량을 신호 한다.
- S. 구 균 CFU vivo에서 라스 신호 상관 관계, 상처 하 고 위에서 설명한 대로 쥐를 감염. 하루에 1 감염 된 후 레코드 vivo에서 라스 신호 쥐에서 그리고 즉시 안락사 하 고 시체를 진정. 상처를 소비 세, 조직, 균질 하 고 접시에 야간 보육에 대 한 한 천 세균성 희석. 다음 날, 식민지 상처 당 CFU를 결정 하기 위해 계산 합니다.
- 상처 가장자리와 상처 (cm2)의 측정 영역을 통해 상처 치유 맞는 원형 ROI를 측정 하 고 대 시간 (그림 2C) 기준에서 변화를 플롯.
7입니다. 통계
참고: 모든 데이터 표시 됩니다으로 의미 ±SEM. p < 0.05 통계적으로 간주 됐다
- Holm Sidak 메서드를 사용 하 여 하루에 두 그룹 간의 차이점을 결정, 알파 = 0.05, 그리고 일관 된 sd. 가정 없이 각 시간 포인트를 개별적으로 분석 하는 방법
- Tukey 다중 비교 posttest 가진 일방통행 ANOVA에 의해 같은 날에 여러 그룹 간의 차이점을 비교 합니다. 실험 그룹 간의 생존 벽난로 콕스 방법으로 분석 했다.
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Representative Results
LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐는 LysM EGFP 마우스 보다 S. 구 균 감염에 더 취약
S. 구 균 이 연구, ALC290618, 에 사용 된의 스트레인 라이브 하 고 적극적으로 metabolizing 박테리아에서 발광 신호를 생성 하는 럭 스 구조를 포함 하는 플라스 미드와 함께 건설 되었다. 쥐에 주사 하는 경우 경도 측정 박테리아 감염 된 상처를 내에서 부담 하 vivo에서 생물 발광 영상 (BLI) 기법을 사용할 수 있습니다. 두 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐와 LysM EGFP 쥐 부상 되었고 1 x 107 CFU S. 구 균 감염의 민감성을 비교 하는 상처에 S. 구 균 의 감염. LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐 보여주었다 LysM EGFP 쥐 증명 LysM EGFP × MyD88의 80% 치 사 율 0% 동안 LysM EGFP 쥐의 치 사 율에 비해 감염의 첫 8 일 동안-/- 생쥐 보다 감염에 더 큰 민감도 (그림 3A) 실험의 전체 15 일 기간입니다. 마우스의 두 변종 감염, 다음 ~ 5% 체중 잃었지만 LysM EGFP 쥐 되는 원래 무게 하루 2, LysM-EGFP × MyD88-/- 생쥐 손실된 무게 (그림 3B)를 재기 하지 않았다 하는 동안. S. 구 균 감염의 상처 폐쇄가 했다; 2 개의 긴장 사이 다른 그러나, sterilely 부상된 LysM EGFP × MyD88-/- 이전에 보고 된19로 LysM EGFP 마우스 (그림 3C)에 비해 상처 치유에 중요 한 결함을 했다. 그리고 전체 동물 이미징 세균성 부담을 매일 측정 하 사용 빠르면 하루 1, LysM-EGFP × MyD88-/- 상처 LysM EGFP 상처 보다 더 높은 세균성 부담 했다. LysM-EGFP 쥐 감염을 제어 하 고 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐 동물 죽음 (3D 그림,E)까지 당일 4 plateaued 세균성 부담 증가 전시 하는 동안 상처, vivo에서 라스 신호를 감소. 함께, 이러한 데이터는 LysM EGFP 쥐에 비해 S. 구 균 감염 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐의 증가 자화 율을 보여 줍니다.
장애인은 호 중구 매매 S. 구 균 에 감염 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐 LysM EGFP 쥐에 비해
LysM-EGFP 마우스 생산 인코딩된 EGFP 단백질 때문에 녹색 형광 neutrophils Lysozyme M 발기인12의 다운스트림. 이 마우스 경도 vivo에서 호 중구 매매 피부 S. 구 균 에 대 한 응답 연구 활용 되었습니다 감염13,,1420,,2122. LysM EGFP 및 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐 생산 상처에 호 중구 속도 론, 비교 6 m m 전체 두께 피부 상처 등에 관리 그리고 마우스 매일 몇 군데 있었다. 상처에 호 중구 매매 40% 감소 LysM EGFP × MyD88-/- LysM-EGFP 마우스 (그림 4A, C)에 비해에서 관찰 되었다. 1 x 107 CFU S. 구 균 의 부상 직후 도입 되었다, 마우스의 두 변종에 감쇠 했다 호 중구 매매 하지만 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐와 S. 구 균 감염에 더 민감한 호 중구 모집을 존중 합니다. LysM-EGFP × MyD88는-/- 상처 (그림 4B) LysM-EGFP 상처에 15% 감소에 비해 매매 초기 neutrophil 감염 50% 감소. LysM-EGFP 마우스 또한 감염 (그림 4A,C) LysM-EGFP × MyD88-/- 쥐, 호 중구 수 증가 수에 비해의 나중 단계 동안 상처에 훨씬 더 많은 neutrophils 모집도는 지속적인 세균 부담 존재입니다. 함께, 이러한 데이터는 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐 S. 구 균 감염에 걸릴 그들의 일치 호 중구 모집에 결함을가지고 보여줍니다.
그림 1: OD600 CFU 사이의 상관 관계는 ALC2906에 대 한 건의. 3-4 ALC2906 SH1000 식민지 한 천 배지에서 포착 하 고 숙박 문화에 대 한 10 µ g/mL 페니 TSB에 전송 했다. 다음 날, 정지 TSB에 10 µ g/mL 페니와 함께 하는 1시 50분 분할 되었고 경작. 광학 밀도 600 nm (OD600)는 분 광 광도 계를 사용 하 여 2 시간 후 정기적으로 측정 되었다. 각 측정에서 박테리아 및 야간 보육에 대 한 한 천 배지 위에 aliquoted 얼음 차가운 PBS에 희석된 1:100,000 했다. CFUs 초기 농도 계산 하는 다음 날을 계산 하 고 OD600상관 했다. N = 4 다른 OD600 측정 실험. 당 3 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 데이터 분석에 대 한 관심사 (ROIs)의 대표 지역. 동등한 크기의 ROIs 상처에 집중 되었다 vivo에서 씨, vivo에서 FLI 신호를 분석 하 고 총 속 (초당 광자)를 측정 했다. 상처 폐쇄를 측정, ROI는 맞게 상처 가장자리에 그리고 지역 (2cm)를 측정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐는 LysM EGFP 쥐에 비해 S. 구 균 감염에 더 취약. LysM-EGFP 및 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐 관리 되었다 6 m m는 등에 상처 및 1 x 107 CFU 발광 S. 구 균 또는 멸 균 식 염 수의 감염. 동물 매일 감시 되었다 고 생존 (A)와 (B) 체중 기록 했다. 동물 상처 크기 측정 (C)와 (D) 세균성 발광을 매일 몇 군데 있었다. (E) 대표적인 발광 이미지 감염된 LysM EGFP LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐에서 묘사 된다. 눈금 막대 = 3 m m. 데이터 대표 그룹 당 7-16 쥐 A, C, 그리고 D 및 당 3 쥐 b 그룹로 평균 ±SEM. 표현 * p = 0.05, * * p = 0.01, * * *p = 0.001, *p < 0.0001 사이 감염 (A, B, < / c18 >와 D) 또는 (C) 그룹을 감염 되지 않은. 통계적 의미 벽난로 콕스 테스트 (A) 및 Holm Sidak 방법 (B-D)를 사용 하 여 결정 했다 알파 = 0.05, 그리고 각 시간 포인트 일관 된 sd. 제발 여기를 클릭 보기는 더 큰 가정 하지 않고 개별적으로 분석 이 그림의 버전.
그림 4: LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐 감염 된 상처에 결함이 있는 호 중구 모집이 있다.
LysM-EGFP 및 LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐 관리 되었다 6 m m는 등에 상처 및 1 x 107 CFU 발광 S. 구 균 또는 멸 균 식 염 수의 감염. 동물 (A, B) 호 중구 콘텐츠 측정 하 매일 몇 군데 있었다. (C) 대표 형광 이미지는 감염 되 고 감염 되지 않은 LysM EGFP LysM EGFP × MyD88-/- 생쥐에서 묘사 된다. 눈금 막대 = 5 mm. 데이터 대표 그룹 당 8-16 쥐 고로 평균 ±SEM. 표현 됩니다 * p < 0.05 * * p < 0.01, 그리고 * * * p < 0.001 사이 감염 그룹 및 # p < 0.01 사이 감염 되지 않은 그룹 (A) 또는 (B) 그래프에 그려져 있습니다. 통계적 의미 Holm Sidak 방법 (A)를 사용 하 여 결정 했다 알파 = 0.05, 그리고 각 시간 포인트 일관 된 SD 및 일방통행 ANOVA (B), 가정 하지 않고 개별적으로 분석 Tukey 다중 비교 후 테스트 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
S. 구 균 감염 모델 발광 S. 구 균 을 활용 하는 전체 동물 vivo에서 광학 이미징의 고급 기술 함께에서 형광 호 중구 기자 마우스에서 감염 고급는 타고 난의 우리의 지식을 감염에 면역 반응입니다. 이전 LysM EGFP 마우스를 사용 하 여 연구는 최대 S. 구 균 감염 된 상처를 감염의 첫 24 시간 동안을 1 x 107 호 중구 모집14, 그리고 상처 모집 neutrophils 확장 그들의 반감기 1.5 일에서 5 일 S. 구 균에 대 한 응답-감염 된 상처22. 감염을 방지 하기 위해 쥐에 의해 적응은 생존 전략은 인신 매매 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPC)의 감염 된 상처를 그들이 TLR2/MyD88/PGE2 살 균 EGFP+ 호 중구로 확장 하는 골 수에서 종속 방식으로21. 또한, extramedullary granulopoiesis S. 구 균 을 구출 하기 위해 호 중구의 필수적인 소스 감염 MyD88-/- 생쥐 치명적인 패 혈 증13에서 제공 합니다. 강포한 유형 쥐로 LysM EGFP 쥐에서 HSPC 입양 전송 지역 호 중구 생산 과정 및 S. 구 균 상처13,21내 combatting의 중요성 검사 가능 하 게. 그것은 또한 상처; 호 중구 수가 정확 하 게 보정 가능 상처에 호 중구 수를 1 x 107 호 중구, 보다 큰 1 x 106 EGFP 신호 선형 상관 그리고 탐지의 한계는 6 m m 상처14약 1 x 106 호 중구.
우리의 대표 결과에 경도 neutrophil 및 LysM EGFP 및 LysM EGFP × MyD88-/-의 상처에서 미 균 활동을 비교합니다. 우리의 지식,이 세균 부담과 neutrophil 야생 유형 및 감염의 확인을 통해 경도 immunocompromised 쥐 사이 매매를 비교 하 여이 첫 번째 연구 이다. MyD88-/- 스트레인에, 호 중구 매매 강포한 유형 쥐 MyD88 50% 감소에 비해 15% 감소 elicited는 S. 구 균 감염으로 인 한 호 중구 모집 감쇠의 정도 특정 관심의-/ -. S. 구 균 은 직접 (예:, α-독 소, Panton 발렌타인 leukocidin, 및 Chemotaxis 억제 단백질23 호 중구 매매 억제 하기 위해 알려진 독성 요인의 수를 생산 하 여 호스트의 면역 반응을 회피 하기 위해 수 , 24), 고 우리의 나타냅니다 MyD88 신호, 가능성이 TLR2, TLR4, IL-1R를 통해 호스트 면역 반응을 회피 하기 위해 S. 구 균에 의해 고용 전략을 극복 하기 위해 필수적입니다. 독성 요인-녹아웃 S. 구 균 긴장 골수성 세포 밀매13에 그들의 효과 특성을이 모델에 사용할 수 있습니다. 또한, LysM EGFP × MyD88-/- 마우스와 함께에서 공부 하는 때이 모델 combatting 독성 요인의 병원 성 효과에 신호 하는 MyD88의 역할을 강조 한다.
이 프로토콜을 잘못 수행 하는 경우 연구에 다양성을 소개 수에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 부상 및 감염 절차는 다른 마우스 질병 모델에 비해 간단 하지만 그것의 복잡 한 없는 것은 아니다. 피부 펀치 생체 검사는 매우 샤 프 하 고 피부 아래 spinotrapezius 근육으로 쉽게 자를 수 있다. 이 근육과는 근 막 손상 호 중구 모집 변경 하 고 쥐와 하지 상처 내 중심으로 더 많은 침략 S. 구 균 감염에서 결과 사이 가변성을 증가 한다. Spinotrapezius 근육에 상당한 손상 마우스 연구에서 제외 해야 합니다.
이 모델에 오차의 또 다른 소스는 발광에 온다 vivo에서 라스 신호 및 성장 속도 변경할 수 있습니다 시간이 지남에 S. 구 균 긴장. ALC2906 변형 수정된 럭 스 오 페론 S. 구 균 박테리아에 의해 삭제 될 수 있습니다 발광 신호를 생성 하는 데 필요한 Photorhabdus luminescens 구조에서 포함 된 셔틀 플라스 미드 포함 시간25이상 선택 없이 국물 문화 SH1000 식민지의 97 %3 일에 발광 신호 생산. 이 주파수는 5 일에 53% 떨어졌다 10 일26에 21%. 따라서, 나중 시간 지점에서 감염 과정, vivo에서 라스 신호 가능성이 시작 됩니다 약간 (< 1 로그 차이) 실제 비보에 세균성 부담을 과소 평가. 도착 및 박테리아의 작업 주식을 자주 교체 시 플라스 미드를 유지 하기 위해 항생제 선택과 S. 구 균 의 신선한 글리세롤 주식 아래로 고정 하는 것이 중요 하다 (즉,, 3 개월 마다)의 손실을 방지 하는 것을 도울 수 있는 문화 유지 관리 동안 발광 구성 합니다. 발광 S. 구 균 의 새로운 변종 안정적으로 통합된 발광 구조27,28 를 포함 하 고이 모델에 사용 된 ALC2906 변형 개선 가능성이 있습니다.
이 모델은 유용 공부 지역화 된 피부 S. 구 균 감염, 한계가 있다. 세균성 짐의 vivo에서 라스 신호 상처과 인접 한 피부에 제한 됩니다. 모델 패 혈 증, 등 깊은 침입 감염에 대 한 신뢰할 수 있는 판독을 제공 하지 않습니다 그리고 혈 류 또는 신장13에 박테리아의 보급 측정 하 동물을 안락사 해야 합니다. 최신 고 밝게 설계 발광 긴장 생성 된 있는 내부 장기27,28에서 vivo에서 라스 신호 탐지를 허용할 수 있습니다. 또한, 경도 탐지 및 호 중구 매매의 모니터링 다른 측정할 수 없는 일반적으로 S. 구 균 감염, 호흡기 등을 인수 하 고 혈액 감염. 감소 된 감도 때문에 조직 autofluorescence이이 모델의 한계 이기도합니다. 최근에 개발한 케첩 마우스 Ly6G 발기인 아래 TdTomato RFP를 활용 하 고 있습니다로 인해 LysM EGFP 마우스 보다 더 높은 신호 대 소음 비 감소 RFP 채널11에 조직 자동 형광.
이 모델에서 vivo에서 라스와 FLI 방출 신호 사이 잠재적인 누화 토론의 가치 이지만 무시할 수 있습니다. 만약 우리가 빛 자극 없이 실험을 수행 하 고만 520/20 필터를 사용 하 여 생체 조건 FLI EGFP 신호를 수집, 우리 준수 하지 않는 감염 된 생쥐에서 어떤 감지할 수 신호 수집 된 신호는 vivo에서 FLI EGFP 신호에서 안에서 보여주는 박테리아 (데이터 표시 되지 않음)의 vivo에서 씨 신호의 겹칩니다. 이것은 주로 1 초 FLI vivo에서 그리고 vivo에서 씨 1 분 520/20의 465/30 nm 및 방출 필터의 특정 여기 파장 필터에 대 한 신호 수집 시간 nm. 이러한 설정은 vivo에서 라스 신호에서 기여 없이 vivo에서 FLI EGFP 신호의 최적의 검출에 대 한 수 있습니다. 이 최고의 3D 그림 및 그림 4A사이 y의 크기 순서를 비교할 때 보여 줍니다. Vivo에서 씨에서 신호는 약 약 vivo에서 라스 신호는 무시할 수 FLI vivo에서에서 관찰 된 신호의 1% 미만 나타내는 vivo에서 EGFP FLI 신호 보다 적습니다.
우리는이 모델의 미래 응용 프로그램 연구원 발견 및 S. 구 균 독성 요인, 특성화 및 테스트 새로운 치료제 전 임상 동물 모델으로 증폭 하 여 S. 구 균 감염을 취소 하는 것을 목표로 하는 데 도움이 됩니다 기대는 타고 난 면역 반응입니다.
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Disclosures
로이드 S. 밀러 MedImmune, 화, Regeneron, 그리고 찬 순 Shiong Nanthealth 기초 및 보고 작업에 관련 되지 않은 컨설팅 수수료 Noveome Biotherapeutics와 찬 순 Shiong Nanthealth 재단에서 교부 금 지원을 받고 있다 에이 종이. 다른 저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 연구소의 건강 보조금 R01 AI129302 (S.I.S.) 하 고 약리학의 교육 프로그램에 의해 지원 되었다: UC 데이비스에서 머리 맡에서 벤치 (NIH T32 GM099608 L.S.A에). 분자와 게놈 이미징 (CMGI) 캘리포니아 대학 데이비스에서 최상의 기술적 지원을 제공 했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
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