Summary
ويرد وصف نهج للكشف في الوقت الحقيقي للاستجابة المناعية الفطرية لإصابة جلدية وعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية من الفئران. بمقارنة ليسم-اجفب الفئران (التي تملك العَدلات الفلورسنت) مع ليسم-اجفب نيوزيلند سلالة الماوس العوز، ونحن نتقدم فهمنا للإصابة، ووضع نهج لمكافحة العدوى.
Abstract
المكوّرات العنقودية الذهبية الإصابات (S. aureus)، بما في ذلك البقع المقاومة للميثيسيلين، عبئا هائلا على نظام الرعاية الصحية. مع معدلات الإصابة بعدوى المكوّرات س. تسلق سنوياً، هناك طلب لإجراء بحوث إضافية في القدرة الإمراضية لها. تعزيز فهمنا للاستجابة المضيف الممرض نماذج حيوانية للأمراض المعدية ويؤدي إلى تطوير علاجات فعالة. العَدلات دور أساسي في الاستجابة المناعية الفطرية الذي يتحكم بعدوى المكوّرات س. عن طريق تشكيل خراج الحائط قبالة العدوى وتسهل إزالة البكتيرية؛ عدد العَدلات تسلل التهاب جلد المذهبة س. غالباً ما يرتبط بنتائج المرض. ليسم-اجفب الفئران، التي تمتلك المعززة أخضر نيون البروتين (اجفب) إدراجها في منطقة المروج م Lysozyme () (معبراً عنها بالدرجة الأولى العَدلات)، عندما تستخدم بالاقتران مع fluorescence أسرة الحيوانات الحية في تصوير (FLI) تقديم وسائل القياس الكمي هجرة العَدلات نونينفاسيفيلي وطوليا إلى إصابة الجلد. عندما يقترن طرحه المذهبة س. السلالة ومتسلسلة المجراة في تصوير طرحه كله الحيوانية (BLI)، فمن الممكن طوليا رصد ديناميات تجنيد العَدلات وعبء البكتيرية في المجراة في الموقع العدوى في الفئران تخديره من بداية العدوى بالقرار أو الموت. الفئران أكثر مقاومة لعدد من عوامل الفوعة تنتجها في المذهبة س. أن تيسر الاستعمار الفعلي والإصابة في البشر. الفئران العوز تقديم نموذج حيوانات أكثر حساسية للنظر في استمرار المذهبة س. الالتهابات وقدرة علاجية لتعزيز الاستجابات المناعية الفطرية. هنا، نحن تميز الردود في الفئران ليسم-اجفب التي قد تم تربيتها للفئران التي تفتقر إلى MyD88 (ليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران) جنبا إلى جنب مع الفئران البرية من نوع ليسم-اجفب للتحقيق في المذهبة س. الجلد عدوى الجرح. الكشف المتزامن المتعدد الأطياف تمكين دراسة ديناميات تجنيد العَدلات باستخدام المجراة في FLI، عبء البكتيرية باستخدام BLI في الحية، والتئام طوليا ونونينفاسيفيلي على مر الزمن.
Introduction
المكوّرات العنقودية الذهبية (S. aureus) تستأثر بغالبية الجلد والتهابات الأنسجة الرخوة (ستيس) في الولايات المتحدة1. حدوث مقاومة مثسلين المذهبة س. (الجرثومة) التهابات زيادة مطردة على مدى العقدين الماضيين الماضي2، تحفيز دراسة آليات استمرار واكتشاف استراتيجيات جديدة للعلاج. هو معيار العناية لهذه الجرثومة الالتهابات الجهازية العلاج بالمضادات الحيوية، ولكن أصبحت هذه الجرثومة مقاومة متزايدة للمضادات الحيوية على مدى الساعة3 وهذه الأدوية يمكن أن تقلل من ميكروبيومي المفيدة للمضيف، مما تسبب في آثار سلبية على الصحة، لا سيما في 4من الأطفال. الدراسات الإكلينيكية وقد فحص استراتيجيات بديلة لعلاج هذه الجرثومة التهابات5، ولكن ترجمة هذه النهج إلى العيادة وقد ثبت تحديا بسبب ظهور عوامل الفوعة إحباط المضيف الاستجابات المناعية6. تشريح ديناميات الممرض المضيف محرك الأقراص المذهبة س. ستيس، قمنا بضم موسع وقراءات الطولي لعدد العَدلات المعينين إلى السرير الجرح مع تدابير الحركية لوفرة البكتيريا والجرح بالمنطقة.
العَدلات هي الكريات البيض المتداولة الأكثر وفرة في البشر وأول المستجيبين لعدوى بكتيرية وهو7. العَدلات عنصر ضروري لاستجابة مضيف فعالة ضد العدوى S. المذهبة سبب آلياتها جراثيم، بما في ذلك إنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية، البروتياز، الببتيدات المضادة للميكروبات والاستجابات الوظيفية بما في ذلك البلعمه وفخ خارج الخلية العَدلات إنتاج8،9. إظهار البشرية المرضى الذين يعانون من عيوب وراثية في وظيفة العَدلات، مثل الداء الحبيبي المزمن ومتلازمة شيدياك-Higashi، زيادة تعرض للإصابة المكوّرات س . وبالإضافة إلى ذلك، المرضى مع الوراثية (مثل قلة العَدلات الخلقي) والمكتسبة (مثل قلة العَدلات ينظر في المرضى العلاج الكيميائي) عيوب في عدد العَدلات أيضا عرضه ل الإصابة في المذهبة س. 10. نظراً لأهمية العَدلات في تطهير العدوى S. aureus ، تعزيز قدرتها المناعية أو ضبط أعدادهم داخل آفة المذهبة س. قد يكون استراتيجية فعالة في حل العدوى.
على مدى العقد الماضي، وضعت الفئران المحورة وراثيا مع الصحفيين العَدلات فلورية لدراسة عن الاتجار بالبشر11،12. الجمع بين الفئران مراسل العَدلات مع تقنيات التصوير الحيوان كله يسمح تحليل الزمانية المكانية من العَدلات في الأنسجة والأعضاء. عندما يتم دمجها مع سلالات طرحه في المذهبة س.، من الممكن تعقب تراكم العَدلات استجابة لوفرة المذهبة س. والثبات في سياق البكتيرية ضراوة العوامل التي مباشرة وغير مباشرة التشويش أرقام العَدلات في الأنسجة المتضررة13،14،،من1516.
الفئران أقل عرضه المذهبة S. الفوعة والمناعة آليات التهرب من البشر. على هذا النحو، قد لا تكون الفئران البرية من نوع نموذج حيوان مثالي للتحقيق في مدى فعالية العلاجية لعلاج مزمن المذهبة س. ونظرا للإصابة. الفئران التي تفتقر إلى MyD88 (أي، MyD88--/-- الفئران)، عبئا ماوس المناعة يفتقر إلى مستقبلات interleukin-1 الوظيفية (إيل-1R) وعدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) إشارات، إظهار قابلية أكبر لعدوى المكوّرات س. بالمقارنة مع الفئران البرية من نوع17 وضعف في الاتجار العَدلات إلى موقع عدوى المكوّرات س. بالجلد18. تطوير سلالة الماوس التي تمتلك مراسل العَدلات نيون MyD88--/-- الفئران قدمت نموذج بديل لتحقق فعالية العلاجات لعلاج عدوى المكوّرات س. مقارنة بالحالي العَدلات مراسل الفئران.
في هذا البروتوكول، تميز عدوى المكوّرات س في المناعة ليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران، ومقارنة بدوره الوقت والقرار للعدوى مع الفئران ليسم-اجفب. × ليسم-اجفب MyD88--/-- الفئران وضع عدوى مزمنة التي لم تحل، وتستسلم 75% للإصابة بعد 8 أيام. يحدث خلل كبير في تجنيد العَدلات الأولية ما يزيد على 72 ح المرحلة التحريضية للعدوى، وتجنيد العَدلات أقل بنسبة 50% خلال المرحلة الأخيرة من الإصابة. زيادة قابلية × ليسم-اجفب MyD88-/-- الفئران يجعل هذا خاصة سلالة نموذجا السريري دقيق تقييم فعالية تقنيات علاجية جديدة تستهدف عدوى المكوّرات S. مقارنة بالحالي النماذج التي استخدام الفئران البرية من نوع، لا سيما تقنيات تهدف إلى تعزيز الاستجابة المناعية الفطرية ضد العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم استعراض جميع الدراسات الماوس ووافقت عليها لجنة الاستخدام في "جامعة كاليفورنيا ديفيس" ورعاية الحيوان المؤسسية وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية لقانون رعاية الحيوان وقانون تمديد الأبحاث الصحية. تأكد من استخدام قفازات معقمة عند العمل مع الحيوانات.
1-الماوس المصدر والإسكان
- جني الفئران ليسم-اجفب على خلفية وراثية C57BL/6J كما هو موضح سابقا12. اشتقاق ليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران بعبور الفئران ليسم-اجفب مع MyD88--/-- الفئران على خلفية C57BL/6J.
- بيت الفئران في فيفاريوم. لهذه الدراسات، تم إيواء الحيوانات في جامعة كاليفورنيا، ديفيس في المجموعات قبل الجراحة والجراحة التالية مساكن واحد. استخدام الفئران تتراوح أعمارهم ما بين 10-16 أسبوعا.
2-إعداد البكتيرية والتقدير الكمي
- إزالة طرحه سلالة المذهبة س للفائدة من تخزين-80 درجة مئوية ذوبان الجليد على الجليد. الانتصارات على طبق أجار الدم بقرى 5%. احتضان لوحة سترياكيد في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح 16).
ملاحظة: استخدمت في هذا البروتوكول، أن سلالة ALC2906 SH1000. يتضمن هذه السلالة pSK236 بلازميد المكوك مع المروج البنسلين-البروتين 2 تنصهر فيها كاسيت مراسل لوكسابكدي من لومينيسسينس فوتوهابدوس18. - إعداد مرق الصويا تريبتيك (TSB) عن طريق خلط 0.03 غرام مسحوق TSB الواحد مل من المياه النقية، والاوتوكلاف TSB لتعقيم. عندما يبرد، إضافة أي المضادات الحيوية اللازمة باستخدام تقنية معقمة. في هذا البروتوكول، إضافة 10 ميكروغرام/مل من الكلورامفينيكول18 إلى لجان لتحديد للتعبير بلازميد المكوك pSK236، الذي يحتوي على كاسيت لوكسابكدي الإضاءة الحيوية.
- اختيار 3-4 مستعمرات منفصلة من اللوحة س المذهبة إلى TSB مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول للبدء بثقافة بين عشية وضحاها. احتضان البكتيريا في شاكر تحضين على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح 16).
- بدء ثقافة جرثومية جديدة من ثقافة بين عشية وضحاها بتمييع عينة 01:50 إلى TSB مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول. الثقافة في شاكر تحضين على 200 لفة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
- ساعتين بعد تقسيم في المذهبة س.، رصد الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) على جهاز المطياف الضوئي. مراقبة OD600 مقابل الوقت لإيجاد نمو مرحلة منتصف لوغاريتمي. لسلالة ALC2906 SH1000، OD600 0.5 منتصف لوغاريتمي ويناظر بتركيز 1 × 108 زيمبابوي/مليلتر (الشكل 1).
- يغسل OD600 عند 0.5، البكتيريا 1:1 مع دببس المثلج. الطرد المركزي البكتيريا لمدة 10 دقائق في 3000 x ز و 4 درجات مئوية. عناية صب المادة طافية وإضافة دببس برود إضافية ودوامه تماما. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 3000 x ز و 4 درجات مئوية.
- صب المادة طافية بعناية. ريسوسبيند بيليه البكتيرية في تركيز المطلوب. لهذه الدراسات، وجمع 3 مل من ALC2906 SH1000 وريسوسبيند في 1.5 مل من برنامج تلفزيوني، مضاهاة لتركيز بكتيريا لحوالي 2 × 108 زيمبابوي/مل. تبقى البكتيريا على الجليد حتى الاستخدام.
- للتحقق من تركيز البكتيريا، يؤدي إلى تمييع 100 ميليلتر من المضيفين العينة البكتيرية و 1: 100.000 في برنامج تلفزيوني. لوحة 20 ميليلتر مختبرين على صفيحة أجار. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد عن 16 h. كفوس العد عن طريق الفحص الإجمالي وحساب تركيز بكتيرية في اليوم التالي.
3-استئصالية إصابة الجلد والتطعيم المكوّرات س.
- إدارة 100 ميليلتر من 0.03 ملغ/مل البوبرينورفين هيدروكلوريد (~0.2 مغ/كغ) إلى كل الماوس عن طريق الحقن داخل.
- عشرون دقيقة بعد الحقن، الفئران المكان 2-4 في دائرة مع الأكسجين LPM 2-3 مع إيسوفلوراني 2-4%. حالما يتم تخديره تماما من الفئران، نقل الفئران واحد في كل مرة إلى مخروط الآنف متصل بالأكسجين LPM 2-3 مع إيسوفلوراني 2-4%. تحقق من يتم تخديره الفئران تماما معسر بحزم كل مخلب خلفي بين الإبهام والسبابة. المضي قدما إلى الخطوة التالية إذا لم يستجب الحيوان إلى رشة.
- حلق 1 بوصة من القسم 2 بوصة في الجزء الخلفي الماوس مع لوس أنجليس كليبرز الكهربائية وتطهير منطقة قصاصات الفراء استخدام مسح نظيفة أو شاش. تجنب استخدام محلول مزيل الشعر لأنه قد يسبب التهاب الزائدة.
- تنظيف الجزء الخلفي الماوس أولاً مع 10% بوفيدون غارقة الشاش ثم مع إيثانول 70% من غارقة شاش. تنظيف المنطقة في نمط دوامة، الانتقال إلى الخارج من وسط منطقة العمليات الجراحية. الانتظار حوالي 1 دقيقة لمنطقة العمليات الجراحية لتجف قبل الجراحة.
-
عقد حلق مؤخرة الماوس فضفاضة بين اثنين من أصابعه واضغط خزعة لكمه عقيمة 6 مم في وسط منطقة الجراحية مستعدة بقوة. عدم سحب الجلد مشدود.
- تطور الخزعة لكمه لإنشاء مخطط دائري على الجلد أن التخفيضات تماما عن طريق الجلد في قسم واحد على الأقل من المخطط التفصيلي. أن يكون حريصا على عدم قطع في رباط أو النسيج الأساسي.
- استخدام مقص معقم والملقط لقطع طريق البشرة والأدمة في أعقاب نمط دائري مطبوع الخزعة لكمه.
4- س. المكوّرات التطعيم
- ملء حقنه الأنسولين ز 28 مع إينوكولانت البكتيرية طرحه المنشود. في هذه الدراسة، إدارة بتركيز 1 × 108 زيمبابوي/مليلتر (50 ميليلتر). لا تدير أكثر من 100 ميليلتر من وحدة التخزين.
-
حقن 50 ميليلتر من إينوكولانت بين اللفافة والأنسجة في وسط الجرح في الجزء الخلفي الماوس. التأكد من أن إينوكولانت أشكال فقاعة في مركز الجرح مع الحد الأدنى من التسرب أو التشتت.
- سحب الأدمة إلى الجانب وعقد المحاقن مواز تقريبا للأنسجة ببطء دفع المحاقن الأنسجة حتى يشعر انخفاض مفاجئ في المقاومة، مما يشير إلى ثقب من اللفافة. يؤدي المحاقن داخل مركز الجرح والاستغناء عن إينوكولانت بطء بعناية. إزالة المحاقن ببطء من الحيوان.
- حقن نفس الحجم من برنامج تلفزيوني المعقمة في جروح الحيوانات مصابة كما هو موضح أعلاه.
- إرجاع الحيوان إلى قفصة. ضع القفص تحت مصباح حرارة أو فوق وسادة تدفئة، ورصد هذا الحيوان حتى التعافي من التخدير.
5-وفي فيفو BLI و FLI
- تهيئة تصوير الحيوان كله من خلال برنامج الصك. تخدير الفئران في دائرة تلقي الأوكسجين LPM 2-3 مع إيسوفلوراني 2-4%. تقديم نوسيكونيس داخل جهاز التصوير التخدير.
-
ضع الماوس الجرحى والمصابين إلى التصوير. ضع الماوس مثل الجرح مستوية قدر الإمكان. استخدام إنشاء التسلسل التالي للصورة الفئران.
- حدد التﻷلؤ و تصوير كوضع التصوير. لقد حان وقت التعرض 1 دقيقة في binning الصغيرة ووقف و/1 (التﻷلؤ) ووقف F/8 (صورة). عامل التصفية الانبعاثات مفتوح. انقر فوق الزر الحصول سجل في الصورة.
- حدد الأسفار و تصوير كوضع التصوير. هو وقت التعرض 1 s binning الصغيرة ووقف و/1 (الأسفار) ووقف F/8 (صورة) مع الطول موجي إثارة من 465/30 نانومتر وانبعاث الطول موجي 520/20 شمال البحر الأبيض المتوسط بكثافة عالية مصباح. انقر فوق الزر الحصول سجل في الصورة.
- إرجاع الحيوان إلى القفص ومراقبة حتى التعافي من التخدير.
- صورة الفئران يوميا كما هو موضح أعلاه.
6. تحليل الصور
- فتح الصور كمياً.
- ضع منطقة دائرية كبيرة للفائدة (ROI) على منطقة الجرح كاملة بما في ذلك المحيطة بالجلد لكل الماوس في الصورة. العَدلات المجراة في إشارات اجفب FLI والمجراه في BLI S. aureus إشارات تتجاوز حافة الجرح بعد عدة أيام وقد أدرجت في هذه الدراسات (الشكل 2 ألف و 2 باء). انقر فوق قياس العائد على الاستثمار ، وقيم السجل للتمويه يعني لكل الماوس. مؤامرة التمويه يعني كل إشارة (p/s) مقابل الزمن.
-
إذا هي رغبت الأرقام المطلقة من العَدلات أو س المذهبة في الجرح، إجراء التجارب التالية.
- للربط بين عدد العَدلات لإشارات اجفب FLI المجراة في، الجرح الفئران C57BL/6J كما هو موضح أعلاه، ونقل مجموعة من العَدلات المشتقة من نخاع العظم (5 × 105 إلى 1 × 107) من ليسم-اجفب أو ليسم-EGFPxMyD88-/- الجهات المانحة مباشرة فوق الجروح المختلفة. الصورة كما هو موضح أعلاه وكورليت اجفب FLI المجراة في إشارات إلى كمية معروفة من العَدلات.
- لربط المذهبة س زيمبابوي لإشارات BLI المجراة في، الجرح وتصيب الفئران كما هو موضح أعلاه. في يوم 1 العدوى بعد سجل المجراة في BLI إشارات من الفئران وعلى الفور euthanize والبرد وجثث. المكوس الجرح ومجانسة الأنسجة، ولوحة تخفيف البكتيرية في أجار للحضانة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، عد المستعمرات لتحديد زيمبابوي كل الجرح.
- لقياس تناسب شفاء الجرح عائد تعميم على حافة الجرح وقياس المنطقة الجرح (سم2) وارسم تغير كسرى من الأساس مقابل الوقت (الشكل 2).
7-الإحصاءات
ملاحظة: يتم عرض كافة البيانات كما يعني ±SEM. واعتبرت ف < 0.05 يعتد به إحصائيا
- تحديد الاختلافات بين المجموعتين في يوم واحد باستخدام الأسلوب هولم-صداق وألفا = 0.05، وتحليل كل نقطة الوقت كل على حدة، دون افتراض يتمشى في التنمية المستدامة.
- مقارنة الاختلافات بين مجموعات متعددة في نفس اليوم من ANOVA أحادي الاتجاه مع posttest مقارنات متعددة توكي. وقد تم تحليل البقاء على قيد الحياة بين المجموعات التجريبية بواسطة الأسلوب رف-كوكس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
× ليسم-اجفب MyD88--/-- الفئران يكونون أكثر عرضه للإصابة المكوّرات س. من الفئران ليسم-اجفب
وقد شيد السلالة من S. aureus المستخدمة في هذه الدراسة،، ALC290618مع بلازميد يحتوي على بنية لوكس تنتج إشارات طرحه من البكتيريا الحية ونشاط التاييض. عندما طعمت في الفئران، يمكن استخدام الإضاءة الحيوية المجراة في (BLI) تقنيات التصوير لقياس عبء البكتيريا داخل جرحا مصابة طوليا. × ليسم-اجفب MyD88--/-- الفئران والفئران ليسم-اجفب الجرحى والمصابين مع زيمبابوي في المذهبة س في الجرح لمقارنة تعرضها لعدوى المكوّرات س. 1 × 107 . × MyD88 ليسم-اجفب--/-- الفئران أظهرت قابلية أكبر للإصابة من الفئران ليسم-اجفب التي أظهرتها الفتك 80% من ليسم-اجفب × MyD88 الفئران--/-- خلال 8 أيام الأولى من الإصابة مقارنة بالفتك 0% من الفئران ليسم-اجفب خلال طوال مدة 15 يوما للتجربة (الشكل 3A). كلا سلالات من الفئران فقدت ~ 5% من وزن الجسم بعد الإصابة، ولكن الفئران ليسم-اجفب استرداد الوزن الأصلي قبل يوم 2، بينما لم يسترد × ليسم-اجفب MyD88--/-- الفئران فقدان الوزن (الشكل 3B). إغلاق الجرح حضور عدوى المكوّرات س. لم يختلف بين سلالات اثنين؛ بيد أنه أصيب ستيريليلي × ليسم-اجفب MyD88-/- عيب كبير في التئام مقارنة بالفئران ليسم-اجفب (الشكل 3)، كما ذكر سابقا19. الحيوان كله التصوير استخدمت لقياس عبء البكتيرية يوميا، وأقرب اليوم 1، ليسم-اجفب × MyD88-/- الجروح كان عبئا بكتيرية أعلى من الجروح ليسم-اجفب. الفئران ليسم-اجفب الخاضعة للعدوى وتناقص المجراة في إشارات BLI في الجرح، بينما ليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران أظهرت زيادة في عبء البكتيرية التي استقرت في يوم 4 حتى وفاة الحيوان (الشكل 3D،هاء). معا، وهذه البيانات تبين زيادة قابلية × ليسم-اجفب MyD88--/-- الفئران لعدوى المكوّرات S. مقارنة بالفئران ليسم-اجفب.
الاتجار العَدلات ضعف المصابين في المذهبة س. ليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران مقارنة بالفئران ليسم-اجفب
الماوس ليسم-اجفب تنتج العَدلات الفلورية الخضراء بسبب بروتين اجفب ترميز المصب مروج Lysozyme م12. هذا الفأر قد استخدمت لدراسة طولية المجراة في العَدلات الاتجار في استجابة ل الجلد المذهبة س. العدوى13،،من1420،،من2122. لمقارنة حركية العَدلات للجروح التي تنتج عن ليسم-اجفب وليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران، كانت تدار جرح جلد كامل سمك 6 مم على دورسوم، وتم تصويرها الفئران يوميا. ولوحظ انخفاض نسبة 40% في الاتجار العَدلات للجروح في × ليسم-اجفب MyD88-/- بالمقارنة مع الفئران ليسم-اجفب (الشكل 4 أ، ج). عندما عرض 1 × 107 زيمبابوي في المذهبة س. بعد إصابة مباشرة، الاتجار العَدلات وكان يخفف في كلا سلالات من الفئران، ولكن ليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران كانت أكثر حساسية لعدوى المكوّرات س. يتعلق بتجنيد العَدلات. الإصابة بنسبة 50% بسبب انخفاض العَدلات الأولى الاتجار إلى ليسم-اجفب × MyD88-/- الجروح مقارنة بانخفاض 15% في الجروح ليسم-اجفب (الشكل 4 باء). الفئران ليسم-اجفب أيضا تجنيد العَدلات أكثر بشكل ملحوظ للجرح خلال المراحل المتأخرة من الإصابة (الشكل 4 أ،ج) بالمقارنة مع ليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران، التي كانت غير قادر على زيادة عدد العَدلات حتى في وجود عبء البكتيرية المطرد. معا، هذه البيانات تبين أن ليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران وقد عيب في تجنيد العَدلات، وما يتسق مع على زيادة التعرض للإصابة المكوّرات س. .
الشكل 1: علاقة متبادلة بين التطوير التنظيمي600 وزيمبابوي التهم ل ALC2906. مستعمرات ALC2906 SH1000 3-4 تم انتقاؤها من صفيحة أجار وحولت إلى لجان مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول للثقافة بين عشية وضحاها. وفي اليوم التالي التعليق تم تقسيم TSB 01:50 مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول ومثقف. الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) وتم قياس في فترات منتظمة بعد ساعتين باستخدام جهاز المطياف الضوئي. وكان البكتيريا في كل قياس المخفف 1: 100.000 في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة والكوتيد على صفيحة أجار للحضانة بين عشية وضحاها. عد في اليوم التالي لحساب تركيز الأولى كفوس ومترابطة للتطوير التنظيمي600. N = 3 مع 4 OD600 القياسات المختلفة للتجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: المنطقة تمثيلاً لمصالح (رويس) لتحليل البيانات- لتحليل BLI في الحية والحية في إشارات FLI، كبيرة، كانت تتوسط رويس الحجم يعادل الجرح وتم قياس التدفق الإجمالي (الفوتونات في الثانية الواحدة). لقياس إغلاق الجرح، كان مناسباً العائد على الاستثمار إلى حافة الجرح وتم قياس المجال (سم2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ليسم--اجفب × MyD88--/-- الفئران أكثر عرضه لعدوى المكوّرات S. مقارنة بالفئران ليسم-اجفب. ليسم-اجفب وليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران كانت تدار 6 مم الجرح على دورسوم والمصابين بزيمبابوى ل طرحه في المذهبة س أو المحلول الملحي المعقم 1 × 107 . وتم رصد الحيوانات يوميا وسجلت بقاء (A) و (ب) الوزن. تم تصويرها الحيوانات يوميا للتدبير (ج) حجم الجرح والتلألؤ البكتيرية (د). (ﻫ) صور طرحه ممثل يصور من المصابين ليسم-اجفب وليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران. شريط مقياس = 3 مم. تمثل البيانات 7-16 الفئران في المجموعة ألف، جيم، ود والفئران 3 كل المجموعة باء ويتم التعبير عنها كمتوسط ±SEM. * p = 0.05، * * ف = 0.01، * * *ف = 0.001، *ف < 0.0001 المصابين بين (A، B، ود) أو وقاية الفئات (ج). دلالة إحصائية مصممة باستخدام الأسلوب صداق هولم (ب-د)، واختبار رف-كوكس (A) مع ألفا = 0.05، وكل الوقت وقد تم تحليل نقطة كل على حدة، دون تحمل التنمية المستدامة. يتفق الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم-
الشكل 4: × ليسم-اجفب MyD88--/-- الفئران بتجنيد العَدلات المعيبة للجروح المصابة.
ليسم-اجفب وليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران كانت تدار 6 مم الجرح على دورسوم والمصابين بزيمبابوى ل طرحه في المذهبة س أو المحلول الملحي المعقم 1 × 107 . تم تصويرها الحيوانات يوميا لقياس محتوى العَدلات (أ، ب). يصور الممثل الصور الفلورية (ج) من المصابين وغير المصابين ليسم-اجفب وليسم-اجفب × MyD88--/-- الفئران. شريط المقياس = 5 ملم. وتمثل بيانات 8-16 الفئران كل مجموعة ويتم التعبير عنها كمتوسط ±SEM. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، و * * * المصابين ف < 0.001 بين مجموعات ووقاية # ف < 0.01 بين المجموعات (A) أو كما هو مبين في الرسم البياني (ب). دلالة إحصائية مصممة باستخدام الأسلوب هولم-سيداك (A)، مع ألفا = 0.05، وكل الوقت وقد تم تحليل نقطة كل على حدة، دون افتراض SD متسقة، وأحادي الاتجاه ANOVA (ب)، مع توكي المتعددة-المقارنات بعد انتهاء الاختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نماذج عدوى المكوّرات س. التي تستخدم طرحه المذهبة س. الإصابة في ماوس مراسل العَدلات نيون بالاقتران مع تقنيات متقدمة للتصوير الضوئي المجراة في الحيوان كله تقدمت معرفتنا فطرية الاستجابة المناعية للعدوى. وقد أظهرت الدراسات السابقة باستخدام الماوس ليسم-اجفب أن يصل إلى تجنيد العَدلات7 1 × 10 جرحا S. aureus مصابة خلال 24 ساعة الأولى من الإصابة14، والجرح تجنيد العَدلات تمديد بهم نصف العمر من يوما ونصف يوم لمدة 5 أيام وردا على . س. في المذهبة-إصابة22من الجرح. تكتيك بقاء مقتبس من الفئران لمكافحة العدوى هو الاتجار الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (هسبك) إلى جرحا مصابة من نخاع العظام حيث أنها توسيع إلى جراثيم العَدلات اجفب+ في TLR2/MyD88/PGE2 تعتمد طريقة21. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر extramedullary جرانولوبويسيس المصابة مصدرا أساسيا من العَدلات لإنقاذ المذهبة س. MyD88--/-- الفئران من الانتان الفتاكة13. نقل هسبك التبني من الفئران ليسم-اجفب في الفئران البرية نوع يجعل من الممكن لدراسة عملية إنتاج العَدلات المحلية وأهميتها في مكافحة س المذهبة داخل جرح13،21. من الممكن أيضا لمعايرة دقة عدد العَدلات في الجرح؛ عدد العَدلات في الجروح يرتبط خطيا مع إشارة اجفب من 1 × 106 إلى أكبر من 1 × 107 العَدلات، والحد من الكشف عن حوالي 1 × 106 العَدلات في جرح 6 مم14.
في النتائج التي توصلنا إليها الممثل قارنا العَدلات طولية وحركية S. aureus في الجروح ليسم-اجفب و × ليسم-اجفب MyD88-/-. على حد علمنا، هذا هو هذه الدراسة الأولى التي تقارن عبء البكتيرية والعدلات الاتجار بين نوع البرية والفئران المناعة طوليا من خلال قرار عدوى. أهمية خاصة فهو درجة التوهين تجنيد العَدلات الناجمة عن عدوى المكوّرات س في السلالة-/- MyD88، الذي آثار انخفاض 15% في الاتجار العَدلات في الفئران البرية نوع مقارنة بانخفاض 50% في MyD88--/ -. س المذهبة قادرة على التملص من الاستجابة المناعية للمضيف بإنتاج عدد من عوامل الفوعة المعروف غير مباشر تمنع الاتجار العَدلات (أي، α-السمية ليوكوسيدين بانتون-عيد الحب وانزيمية البروتين المثبطة23 , 24)، والنتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن يشير إلى MyD88، المحتمل عن طريق TLR2، TLR4، وايل-1R، أمر حاسم في التغلب على الاستراتيجيات التي يستخدمها س المذهبة للتهرب من الاستجابات المناعية المضيف. فوعة عامل خروج المغلوب المذهبة س. يمكن استخدام سلالات في هذا النموذج لوصف تأثيرها على الخلية النقوي الاتجار13. علاوة على ذلك، عند دراسة بالاشتراك مع ليسم-اجفب × MyD88-/- الماوس، هذا النموذج يبرز دور MyD88 الإشارات في مكافحة آثار عوامل الفوعة المسببة للأمراض.
وهناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول، إذا كان إجراء غير صحيح يمكن إدخال تقلب في الدراسات. الإجراءات مما أدى إلى إصابة وعدوى واضحة مقارنة بنماذج أخرى المرض الماوس، ولكن ليس من دون تعقيدات لها. خزعات الجلد لكمه حادة جداً، ويمكن بسهولة أن يقتطع العضلات سبينوترابيزيوس تحت الجلد. إتلاف هذه العضلة واللفافة لها يغير تجنيد العَدلات ويزيد التباين بين الفئران وما ينتج مرض المكوّرات س. أكثر الغازية التي لا تركز داخل الجرح. ينبغي استبعاد الفئران مع إلحاق أضرار كبيرة بالعضلات سبينوترابيزيوس من الدراسات.
مصدرا آخر للخطأ في هذا النموذج يأتي من تغييرات في طرحه المذهبة S. ضغطاً على مر الزمن، والتي يمكن أن تغير المجراة في BLI الإشارات وحركية النمو. سلالة ALC2906 يحتوي بلازميد مكوك الذي يحتوي على مشغل معدلة لوكس من بناء لومينيسسينس فوتورهابدوس المطلوب لإنتاج إشارات طرحه، التي يمكن التخلص من بكتيريا المكوّرات س. على مدى الساعة25. في ثقافة مرق دون التحديد، أنتج 97% مستعمرات SH1000 إشارات طرحه في اليوم 3. هذا التردد انخفض إلى 53% في يوم 5 و 21 في المائة في 10 يوم26. وهكذا، في نقاط زمنية لاحقة أثناء المعدية، إشارات BLI المجراة في المرجح ستبدأ قليلاً (< 1 سجل الفرق) يقلل من عبء البكتيرية الفعلية في فيفو . من المهم أن تجمد إلى انخفاض أسهم والغليسيرول الطازجة في المذهبة س. مع اختيار المضادات الحيوية للحفاظ على بلازميد عند الوصول واستبدال الأسهم العامل من البكتيريا كثيرا ما (أي، كل ثلاثة أشهر) يمكن أن تساعد على منع فقدان بناء طرحه أثناء صيانة الثقافة. أحدث السلالات طرحه المذهبة س. تحتوي27،ستابلي متكاملة بناء طرحه28 ومن المرجح حدوث تحسن على سلالة ALC2906 المستخدمة في هذا النموذج.
في حين أن هذا النموذج مفيد لدراسة مترجمة عن طريق الجلد المذهبة س. العدوى، لديها قيود. إشارات BLI المجراة في عبء البكتيرية قاصرة على الجرح والجلد المجاور. النموذج لا توفر قراءات موثوقة للالتهابات العميقة الغازية مثل الانتان، ويجب أن تكون euthanized الحيوانات لقياس نشر البكتيريا في مجرى الدم أو الكلي13. تم إنشاؤها بسلالات طرحه أحدث وأكثر إشراقا المهندسة التي تسمح الكشف عن المجراة في BLI إشارات من أجهزة الداخلية27،28. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن قياسه في أخرى طولية كشف ورصد الاتجار العَدلات عادة اكتسبت عدوى المكوّرات س. ، بما في ذلك الالتهاب الرئوي والتهابات في الدم. انخفاض حساسية بسبب أوتوفلوريسسينسي الأنسجة قيد أيضا من هذا النموذج. تستخدم الماوس صلصة الطماطم وضعت مؤخرا طلب تقديم العروض تدتوماتو تحت Ly6G المروج وقد يكون أعلى إشارة إلى نسبة الضوضاء من الماوس ليسم-اجفب ونظرا لتخفيض الأنسجة السيارات الأسفار في طلب تقديم العروض القناة11.
الحديث المتبادل المحتملة بين المجراة في إشارات الانبعاثات BLI و FLI في هذا النموذج جديرة بالمناقشة ولكن لا يكاد يذكر. إذا كان علينا القيام بتجارب دون الإثارة الخفيفة وجمع إلا إشارات اجفب FLI المجراة باستخدام عامل التصفية 520/20، لم نلاحظ أي إشارات ملموسة من الفئران المصابة، مما يدل على أن الإشارات التي تم جمعها يتم المجراة في اجفب FLI إشارات وليس من تداخل الإشارات BLI المجراة في البكتيريا (البيانات لا تظهر). وهذا يرجع أساسا إلى الوقت جمع الإشارات، والتي هي فقط 1 الثانية FLI المجراة في ودقيقة واحدة ل BLI المجراة في عامل تصفية إثارة محددة الطول موجي لتصفية 465/30 نانومتر، والانبعاثات من 520/20 نانومتر. تسمح هذه الإعدادات للكشف عن المجراة في إشارات اجفب FLI دون مساهمة من المجراة في BLI الإشارات الأمثل. ويتجلى هذا أفضل عند مقارنة الحجم من المحور الصادي بين 3D الشكل و الشكل 4A. الإشارات من BLI المجراة في حوالي معززات أقل من الإشارات FLI اجفب في الحية، مشيراً إلى أن إشارات BLI المجراة في ضئيلة، وتسهم بأقل من 1% الإشارات التي لوحظ من FLI المجراة.
ونتوقع من التطبيقات المستقبلية لهذا النموذج سوف تساعد الباحثين اكتشاف وتميز عوامل الفوعة في المذهبة س. ، وتكون بمثابة نموذج حيوان قبل الإكلينيكية لاختبار علاجات جديدة تهدف إلى مسح عدوى المكوّرات س. بتعزيز الاستجابة المناعية الفطرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لويد س. ميلر قد تلقت منحة الدعم من ميديموني وشركة فايزر، ريجينيرون، ومؤسسة نانثيلث قريبا-شيونج تشان ورسوم الاستشارات من بيوثيرابيوتيكس نوفيومي ومؤسسة نانثيلث قريبا-شيونج تشان التي لا علاقة لها بالعمل وأفادت في هذه الورقة. ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلفين الآخرين.
Acknowledgments
وأيده هذا العمل الوطني معاهد للصحة منح R01 AI129302 (إلى S.I.S.)، وبرنامج التدريب في علم الصيدلة: "من مقاعد البدلاء" إلى السرير في "جامعة كاليفورنيا ديفيس" (المعاهد الوطنية للصحة T32 GM099608 إلى L.S.A). الجزيئية والجينية التصوير (كمجي) في جامعة كاليفورنيا في ديفيز قدمت الدعم التكنولوجي رائع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
