Summary
En tilnærming er beskrevet for sanntids deteksjon av medfødte immunforsvaret til kutan såret og Staphylococcus aureus infeksjoner av mus. Ved å sammenligne LysM-EGFP mus (som har fluorescerende nøytrofile) med en LysM-EGFP crossbred immunodeficient musen belastning, vi forhånd vår forståelse av infeksjon og utvikling av tilnærminger til å bekjempe infeksjon.
Abstract
Gule stafylokokker (S. aureus) infeksjoner, inkludert meticillinresistante flekker, er en enorm belastning på helsevesenet. Med forekomst av S. aureus infeksjoner klatring årlig, er det et behov for ytterligere forskning i sin virusets. Dyr modeller av smittsomme sykdommer forhånd vår forståelse av vert-patogen svaret og føre til utvikling av effektive therapeutics. Nøytrofile spiller en primær rolle i medfødte immunforsvaret som styrer S. aureus infeksjoner ved å danne en byll å vegg av infeksjonen og tilrettelegge bakteriell klaring; antall nøytrofile som infiltrere en S. aureus hudinfeksjon ofte korrelerer med sykdom utfallet. LysM-EGFP mus, som har forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) i regionen for Lysozyme M (LysM)-arrangøren (uttrykt av nøytrofile), sammen med i vivo helt dyr fluorescens imaging (FLI) gir en måte å kvantifisere nøytrofile utvandring noninvasively og langs inn sårede huden. Kombinert med en bioluminescent S. aureus belastning og sekvensiell i vivo helt dyr bioluminescent imaging (BLI), er det mulig å overvåke langs både nøytrofile rekruttering dynamikk og i vivo bakterielle belastningen på stedet av infeksjon i bedøvet mus fra utbruddet av smitte til oppløsning eller død. Mus er mer motstandsdyktig mot en rekke virulens faktorer produsert av S. aureus som forenkler effektive kolonisering og infeksjon hos mennesker. Immunodeficient mus gir en mer følsomme dyr modell for å undersøke vedvarende S. aureus infeksjoner og evne til therapeutics å øke medfødte immunreaksjoner. Her har vi karakterisere svar i LysM-EGFP mus som har blitt avlet til MyD88 dårlig mus (LysM-EGFP × MyD88- / - mus) sammen med vill-type LysM-EGFP mus å undersøke S. aureus huden sår infeksjon. Multispectral samtidige oppdaging aktivert studiet av nøytrofile rekruttering dynamikken ved hjelp i vivo FLI, bakteriell byrden ved hjelp i vivo BLI, og sårtilheling langs- og noninvasively over tid.
Introduction
Gule stafylokokker (S. aureus) utgjør flertallet av hud og bløtvev infeksjoner (SSTIs) i USA1. Forekomsten av Meticillinresistente S. aureus (MRSA) infeksjoner økt jevnt over de siste to tiår2, motiverende studere mekanismer for utholdenhet og oppdagelsen av nye behandling strategier. Standarden på omsorg for MRSA-infeksjoner er systemisk antibiotika terapi, men MRSA har blitt stadig mer resistente mot antibiotika over tid3 og disse stoffene kan minske vertens gunstig microbiome, forårsaker negative helseeffekter, spesielt i barn4. Prekliniske studier har undersøkt alternative strategier for å behandle MRSA infeksjoner5, men oversette disse tilnærminger til klinikken har vist seg utfordrende på grunn av fremveksten av virulens faktorer som hindre vert immunreaksjoner6. For å analysere vert-patogen dynamikken stasjonen S. aureus SSTIs, vi kombinerer noninvasive og langsgående readouts antall nøytrofile rekruttert til såret sengen med kinetic tiltak for bakteriell overflod og såret området.
Nøytrofile er det rikeste sirkulerende leukocytt hos mennesker og de første responders til en bakteriell infeksjon7. Nøytrofile er en nødvendig komponent for en effektiv vert reaksjon mot S. aureus infeksjoner på grunn av deres bakteriedrepende mekanismer, inkludert produksjon av reaktive oksygen arter, proteaser, antimikrobielle peptider og funksjonelle svar inkludert fagocytose og nøytrofile ekstracellulære felle produksjon8,9. Menneskelige pasienter med genetiske defekter i nøytrofile funksjon, som kronisk granulomatøs sykdom og Chediak-Higashi syndrom, viser en økt mottakelighet for S. aureus infeksjoner. I tillegg pasienter med genetiske (for eksempel medfødt nøytropeni) og ervervet (for eksempel nøytropeni i kjemoterapi pasienter) feil i nøytrofile tall er også svært utsatt for S. aureus infeksjoner10. Gitt viktigheten av nøytrofile i clearing S. aureus infeksjoner, kan styrke deres immunforsvaret kapasitet eller tuning deres tall innenfor en S. aureus leksjonen være en effektiv strategi å løse infeksjon.
Det siste tiåret, er transgene mus med fluorescens nøytrofile journalister utviklet for å studere deres menneskehandel11,12. Kombinere nøytrofile reporter mus med hele dyr Bildeteknikker tillater spatiotemporal analyse av nøytrofile i vev og organer. Når kombinert med bioluminescent stammer av S. aureus, er det mulig å spore akkumulering av nøytrofile svar på S. aureus overflod og utholdenhet i sammenheng med bakteriell virulens faktorer som direkte og indirekte forurolige nøytrofile tall i berørte vev13,14,15,16.
Mus er mindre utsatt for S. aureus virulens og immun evasion mekanismer enn mennesker. Som sådan, vill-type mus kan ikke være en ideell dyremodell å undersøke effekten av en gitt terapeutisk å behandle kronisk S. aureus infeksjoner. MyD88 dårlig mus (dvs. MyD88- / - mus), en immunsupprimerte musen belastning som mangler funksjonelle interleukin-1 reseptor (IL-1R) og Toll-like reseptor (TLR) signalnettverk, Vis større mottakelighet for S. aureus infeksjoner sammenlignet vill-type mus17 og et verdifall i nøytrofile trafikken til et nettsted for S. aureus infeksjon i huden18. Utvikling av en mus stamme som besitter fluorescerende nøytrofile reporter i MyD88- / - mus har gitt en alternativ modell for å undersøke effekten av terapi for å behandle S. aureus infeksjoner sammenlignet med gjeldende nøytrofile reporter mus.
I denne protokollen, vi karakterisere S. aureus infeksjoner i immunsupprimerte LysM-EGFP × MyD88- / - mus, og sammenlign tid kurset og oppløsning av infeksjon med LysM-EGFP mus. LysM-EGFP × MyD88- / - mus utvikle en kronisk infeksjon som ikke løses, og 75% bukke til infeksjon etter 8 dager. En betydelig feil i første nøytrofile rekruttering skjer over 72 h av inflammatoriske fase av infeksjon, og 50% færre nøytrofile rekruttere under den siste fasen av infeksjon. Økt mottakelighet av LysM-EGFP × MyD88- / - mus gjør dette bestemt belastning en streng prekliniske modell for å evaluere effekten av nye terapeutiske teknikker målretting S. aureus infeksjoner sammenlignet med dagens modeller som bruke vill-type mus, spesielt teknikker å øke medfødte immunforsvaret mot infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus studier ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på UC Davis og ble utført i henhold til retningslinjene det dyr velferd gjerning og helse Research forlengelsen loven. Husk å bruke sterilt hansker når du arbeider med dyr.
1. musen kilde og bolig
- Henter LysM-eGFP mus på C57BL/6J genetisk bakgrunn som beskrevet tidligere12. Avledet LysM-EGFP × MyD88- / - mus ved krysset LysM-EGFP mus med MyD88- / - mus på C57BL/6J bakgrunn.
- Huset mus i et vivarium. For disse studiene, var dyr plassert på University of California, Davis i grupper før kirurgi og enkelt ligger etter kirurgi. Bruk mus i alderen 10-16 uker.
2. bakteriell forberedelse og måling
- Fjerne det bioluminescent S. aureus stamme av interesse fra-80 ° C lagring å tine på is. Stripe på en 5% bovin blod agar plate. Inkuber stripete platen i en fuktet inkubator på 37 ° C over natten (16 h).
Merk: I denne protokollen, ALC2906 SH1000 belastningen ble brukt. Denne belastningen inneholder shuttle plasmider pSK236 med penicillin bindende protein 2 arrangøren del luxABCDE reporter kassetten Photohabdus luminescens18. - Forberede tryptic soya kjøttkraft (TSB) ved å blande 0,03 g TSB pulver per mL av rent vann og autoklav TSB å sterilisere. Når avkjølt, Legg noen nødvendige antibiotika bruker steril teknikk. I denne protokollen, legge til 10 µg/mL chloramphenicol18 TSB velge for uttrykk for pSK236 transport plasmider, som inneholder bioluminescens luxABCDE kassetten.
- Plukk 3-4 separate kolonier fra S. aureus platen i TSB med 10 µg/mL chloramphenicol å starte en over natten kultur. Inkuber bakterier på en incubating shaker på 37 ° C over natten (16 h).
- Start en ny bakteriell kultur fra natten kultur fortynne en eksempel 1:50 i TSB med 10 µg/mL chloramphenicol. Kultur i en incubating shaker ved 200 rpm og 37 ° C.
- To timer etter deling S. aureus, overvåke optisk densitet ved 600 nm (OD600) på et spektrofotometer. Observere OD600 vs tid å finne midt logaritmisk fase vekst. For ALC2906 SH1000 belastningen, et OD600 på 0,5 midt logaritmisk og tilsvarer en konsentrasjon av 1 x 108 CFU/mL (figur 1).
- Når OD600 er 0,5, vask bakterier 1:1 med iskald DPBS. Sentrifuge bakterier i 10 min på 3000 x g og 4 ° C. Nøye Dekanter nedbryting og legge ekstra kjølt DPBS og vortex grundig. Sentrifuger igjen i 10 min på 3000 x g og 4 ° C.
- Nøye Dekanter nedbryting. Resuspend bakteriell pellet på en ønsket konsentrasjon. Disse studiene, samle 3 mL ALC2906 SH1000 og resuspend i 1,5 mL PBS, samkjøre til en bakterier konsentrasjon av ca 2 x 108 CFU/mL. Holde bakterier på is til bruk.
- For å bekrefte bakterier konsentrasjon, fortynne 100 µL av bakteriell eksempel 1:10,000 og 1:100,000 i PBS. Plate 20 µL dele på en agar plate. Ruge på 37 ° C i en fuktet inkubator for 16 h. teller CFUs av brutto undersøkelse og beregne en bakteriell konsentrasjon dagen.
3. excisional huden Wounding og kontaminert med S. aureus
- Administrere 100 µL av 0,03 mg/mL buprenorfin hydrochloride (~0.2 mg/kg) for hver musen via intraperitoneal injeksjon.
- Tjue minutter etter injeksjon, sted 2-4 mus i et kammer med 2-3 LPM oksygen med 2-4% isoflurane. Når mus er fullt anesthetized, overføre mus en å en forpart koblet til 2-3 LPM oksygen med 2-4% isoflurane. Kontroller mus er fullt anesthetized ved pinching fast hver bakre pote mellom tommelen og pekefingeren. Fortsett til neste trinn hvis dyret ikke svarer klemme.
- Barbere en 1 tommers av 2 tommers delen på baksiden av musen med elektrisk avklipt og fjerne området pels utklipp ved hjelp av en ren tørke eller gasbind. Unngå å bruke depilatory lotion fordi det kan føre til overmål betennelse.
- Ren fuktet baksiden av musen først med 10% povidon-jod fuktet gasbind og deretter med en 70% etanol gasbind. Rengjør området i en spiral mønster, flytte utover fra midten av det kirurgiske området. Vent ca 1 min for kirurgiske området tørke før kirurgi.
-
Hold den barbert bak musen løst mellom to fingre og trykk bestemt en steril 6 mm punch biopsi midt i forberedt kirurgiske området. Ikke dra huden stram.
- Vri den punch biopsy å lage en sirkulær disposisjon på huden som fullt skjærer gjennom huden i minst én del av disposisjonen. Pass på at du ikke skjære den underliggende fascia eller vev.
- Bruk sterilt saks og tang for å klippe gjennom overhuden og dermis følger det sirkulære mønsteret preget av punch biopsi.
4. S. Aureus vaksinering
- Fyll en 28 G insulinsprøyte med den ønskede bioluminescent bakteriell inoculant. I denne studien administrere en konsentrasjon av 1 x 108 CFU/mL (50 µL). Skal ikke gis mer enn 100 µL av volum.
-
Sette inn 50 µL av inoculant mellom fascia og vev i midten av såret på baksiden av musen. Kontroller at inoculant danner en boble midt i såret med minimal lekkasje eller spredning.
- Trekke dermis til side, holder sprøyten nesten parallelt til vev og langsomt trykk sprøyten i vevet til en bardus nedgang inne motstand føles, som angir piercing av fascia. Nøye lede sprøyten i midten av såret og dispensere inoculant sakte. Fjern sprøyten sakte fra dyret.
- Injisere samme volum av sterile PBS i sårene av infisert dyr som beskrevet ovenfor.
- Tilbake dyret til buret sitt. Plasser byrået under en varmelampe eller over en oppvarming pad, og overvåke dyret til utvinning fra anestesi.
5. i Vivo BLI og FLI
- Initialisere helt dyr imager gjennom instrumentet programvaren. Bedøve mus i et kammer mottar 2-3 LPM oksygen med 2-4% isoflurane. Levere bedøvelse nosecones inne imager.
-
Plass såret og infisert musen i imager. Plasser musen slik at såret er så flat som mulig. Bruk følgende sekvens opplegget for å image musene.
- Velg Luminescence og fotografere som tenkelig modus. Eksponeringstiden er 1 min på små binning og F/stopper 1 (luminescence) og F/stopper 8 (bilde). Utslipp filteret er åpen. Klikk Hent for å ta bildet.
- Velg fluorescens og fotografere som tenkelig modus. Eksponeringstiden er 1 s liten binning og F/stopper 1 (fluorescens) og F/stopper 8 (bilde) med en eksitasjon bølgelengde 465/30 nm og et utslipp bølgelengde 520/20 nm med en høy lampe intensitet. Klikk Hent for å ta bildet.
- Returnere dyr bur og skjermen til utvinning fra anestesi.
- Bildet mus daglig som beskrevet ovenfor.
6. bildeanalyser
- Åpne bilder til kvantifiseres.
- Plass et stort sirkulært område av interesse (ROI) over hele såret området, inkludert omkringliggende hud for hver musen i bildet. Nøytrofile i vivo FLI EGFP signaler og i vivo BLI S. aureus signaler går utenfor kanten såret etter flere dager og ble inkludert i disse studiene (figur 2A og 2B). Klikk Mål avkastning og registrere verdier for mener flux for hver musen. Tomt betyr fluks hver signal (p/s) versus tid.
-
Hvis absolutt antall nøytrofile eller S. aureus i såret er ønskelig, kan du utføre følgende eksperimenter.
- Til relatere nøytrofile tallene i vivo FLI EGFP signaler, sår C57BL/6J mus som beskrevet ovenfor, og overføre en rekke Ben margtransplantasjon-avledet nøytrofile (5 x 105 til 1 x 107) fra LysM-EGFP eller LysM-EGFPxMyD88- / - givere direkte på forskjellige sår. Bildet som beskrevet ovenfor og correlate i vivo FLI EGFP signaler med kjente antall nøytrofile.
- Til relatere S. aureus CFU til i vivo BLI signaler, sår og infisere mus som beskrevet ovenfor. På dag 1 etter infeksjon posten i vivo BLI signaler fra mus og umiddelbart euthanize og chill skrotter. Avgiftsdirektoratet såret, homogenize vevet og plate bakteriell fortynninger på agar for overnatting inkubasjon. Neste dag, telle kolonier å bestemme CFU per såret.
- Å måle sår helbredelse passer en sirkulær avkastning over såret kanten og måle området av såret (cm2) og tegne brøk endringen fra grunnlinjen vs tid (figur 2C).
7. statistikk
Merk: Alle data presenteres som betyr ±SEM. p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
- Fastslå forskjellene mellom to grupper på en enkelt dag med metoden Holm-Sidak, med alfa = 0,05 og analysere hvert tidspunkt, uten antar en konsekvent SD.
- Sammenligne forskjellene mellom flere grupper på samme dag av veis VARIANSANALYSE med Tukey flere-sammenligninger posttest. Overlevelse eksperimentelle undergrupper ble analysert av metoden Mantel-Cox.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LysM-EGFP × MyD88- / - mus er mer utsatt for S. aureus infeksjoner enn LysM-EGFP mus
Belastningen av S. aureus brukt i denne studien, ALC290618, ble bygget med en plasmider som inneholder lux Konstruer som produserer bioluminescent signaler fra live og aktivt metabolizing bakterier. Når inokulert i mus, benyttes i vivo bioluminescens imaging (BLI) teknikker å måle langs bakterier byrden i et infiserte sår. Både LysM-EGFP × MyD88- / - mus og LysM-EGFP mus ble såret og infisert med 1 x 107 CFU av S. aureus i såret sammenligne deres mottakelighet for S. aureus infeksjoner. LysM-EGFP × MyD88- / - mus viste større mottakelighet for infeksjon enn LysM-EGFP mus demonstrert av 80% dødelighet av LysM-EGFP × MyD88- / - mus i løpet av første 8 dager infeksjon sammenlignet med 0% dødelighet av LysM-EGFP mus under den hele 15-dagers varigheten av forsøket (figur 3A). Begge stammer mus mistet ~ 5% kroppsvekt etter smitte, men LysM-EGFP mus gjenopprettes opprinnelige vekt av dag 2, mens LysM-EGFP × MyD88- / - mus ikke gjorde gjenopprette tapt vekt (figur 3B). Såret nedleggelse i nærvær av S. aureus infeksjon var ikke forskjellig mellom de to stammene; sterilely såret LysM-EGFP × MyD88- / - hadde imidlertid betydelige feil sårheling sammenlignet med LysM-EGFP mus (Figur 3 c), som tidligere rapportert19. Hele dyr imaging ble brukt til å måle bakteriell byrden daglig, og så tidlig som i dag 1, LysM-EGFP × MyD88- / - sår hadde en høyere bakteriell byrde enn LysM-EGFP sår. LysM-EGFP mus kontrollert infeksjon og redusert i vivo BLI signaler i såret, mens LysM-EGFP × MyD88- / - mus viser en økning i bakteriell byrden som platå på dag 4 til dyr død (figur 3D,E). Sammen viser disse dataene at økt mottakelighet av LysM-EGFP × MyD88- / - mus for S. aureus infeksjoner sammenlignet med LysM-EGFP mus.
Nøytrofile menneskehandel er svekket i S. aureus infisert LysM-EGFP × MyD88- / - mus sammenlignet med LysM-EGFP mus
LysM-EGFP mus produserer grønn fluorescerende nøytrofile på grunn av en EGFP protein kodet nedstrøms av Lysozyme M promoter12. Denne musen har blitt benyttet for å studere langsgående i vivo nøytrofile menneskehandel svar dermal S. aureus infeksjoner,13,,14,,20,,21,,22. Hvis du vil sammenligne nøytrofile kinetics til sår produsert på LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus, et 6 mm tykkhet huden sår ble administrert på dorsum og mus ble fotografert daglig. En 40% nedgang i nøytrofile smuglingen til sår ble observert i LysM-EGFP × MyD88- / - forhold til LysM-EGFP mus (figur 4A, C). Når 1 x 107 CFU av S. aureus ble innført umiddelbart etter såret, nøytrofile handel ble svekket i begge stammer mus, men LysM-EGFP × MyD88- / - mus var mer følsomme for S. aureus infeksjoner med respekt til nøytrofile rekruttering. Infeksjon forårsaket en 50% nedgang i første nøytrofile smuglingen til LysM-EGFP × MyD88- / - sår sammenlignet med 15 prosents reduksjon i LysM-EGFP sår (figur 4B). LysM-EGFP mus også rekruttert betydelig mer nøytrofile til såret i løpet av infeksjon (figur 4A,C) sammenlignet med LysM-EGFP × MyD88- / - mus, som klarte å øke nøytrofile tallene selv i den tilstedeværelse av vedvarende bakteriell byrden. Sammen viser disse dataene at LysM-EGFP × MyD88- / - mus har en defekt i nøytrofile rekruttering, som er i samsvar med deres økt mottakelighet for S. aureus infeksjoner.
Figur 1: Sammenhengen mellom OD600 og CFU teller for ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 kolonier ble plukket fra en agar plate og overført til TSB med 10 µg/mL chloramphenicol for natten kultur. Neste dag, suspensjon var delt 1:50 i TSB med 10 µg/mL chloramphenicol og kulturperler. Optisk densitet ved 600 nm (OD600) ble målt i regelmessig etter 2 timer med et spektrofotometer. Hver måling var bakterier utvannet 1:100,000 i iskaldt PBS og aliquoted på en agar plate for overnatting inkubasjon. CFUs var regnet dagen for å beregne den innledende konsentrasjonen og korrelert til OD600. N = 3 med 4 forskjellige OD600 mål per forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant regionen interesser (ROIs) for dataanalyse. Hvis du vil analysere i vivo BLI og i vivo FLI signaler, store, tilsvarende størrelse ROIs var sentrert over såret og totale flux (fotoner per sekund) ble målt. For å måle såret nedleggelse, var en ROI passe såret kanten og området (cm2) ble målt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: LysM-EGFP × MyD88- / - mus er mer utsatt for S. aureus infeksjoner sammenlignet med LysM-EGFP mus. LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus ble gitt en 6 mm sår på dorsum og infisert med 1 x 107 CFU bioluminescent S. aureus eller sterilt saltvann. Dyrene ble overvåket daglig og overlevelse for (A) og (B) vekt ble registrert. Dyrene ble fotografert daglig mål (C) sår størrelse og (D) bakteriell luminescence. (E) representant bioluminescent bilder er avbildet fra infiserte LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus. Skala bar = 3 mm. Data representerer 7-16 mus per gruppe a, C, og D og 3 mus per gruppe for B og uttrykkes som betyr ±SEM. * p = 0,05 bør ** p = 0,01, ***p = 0,001, *p < 0,0001 mellom infisert (A, B, < / C18 > og D) eller infisert (C) grupper. Statistisk betydning ble bestemt Mantel-Cox test (A) og metoden Holm-Sidak (B-D), med alfa = 0,05, og hver gang punkt ble analysert, uten antar en konsekvent SD. Vennligst klikk her for å vise en større versjonen av dette tallet.
Figur 4: LysM-EGFP × MyD88- / - mus har defekt nøytrofile rekruttering til infiserte sår.
LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus ble gitt en 6 mm sår på dorsum og infisert med 1 x 107 CFU bioluminescent S. aureus eller sterilt saltvann. Dyrene ble fotografert daglig for å måle (A, B) nøytrofile innhold. (C) representant fluorescerende bilder er avbildet fra infiserte og uten LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus. Skala bar = 5 mm. Data representerer 8-16 mus per gruppe og uttrykkes som betyr ±SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, og *** p < 0,001 mellom infisert grupper og # p < 0,01 mellom infisert grupper (A) eller som avbildet på grafen (B). Statistisk betydning ble bestemt med metoden Holm-Sidak (A), med alfa = 0,05, og hver gang punkt ble analysert, uten antar en konsekvent SD, og veis VARIANSANALYSE (B), med Tukey flere-sammenligninger etter testing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. aureus infeksjoner modeller som utnytter bioluminescent S. aureus infeksjoner i fluorescerende nøytrofile reporter mus sammen med avanserte teknikker i hele dyr i vivo optisk tenkelig har avansert vår kunnskap om den medfødte immun respons på infeksjon. Tidligere studier ved hjelp av LysM-EGFP-musen har vist at opp til 1 x 107 nøytrofile rekruttere til et S. aureus infiserte sår over de første 24 timer av14og såret-rekruttert nøytrofile utvide deres half-life fra 1,5 dager til 5 dager svar på en S. aureus-infiserte sår22. En overlevelse taktikk av mus å bekjempe infeksjon er handel med blodkreft stilk og progenitor celler (HSPC) til et infiserte sår fra benmargen der de utvider til bakteriedrepende EGFP+ nøytrofile i en TLR2/MyD88/PGE2 avhengige måte21. I tillegg gir extramedullary granulopoiesis en viktig kilde av nøytrofile å redde S. aureus infisert MyD88- / - mus fra dødelige sepsis13. Adopsjon overføring av HSPC fra LysM-EGFP mus i vill type mus gjør det mulig å undersøke prosessen med lokal nøytrofile produksjon og dens betydning i bekjempe S. aureus i såret13,21. Det er også mulig å kalibrere nøyaktig antall nøytrofile i såret; nøytrofile nummer i sår korrelerer lineært med EGFP signalet fra 1 x 106 til større enn 1 x 107 nøytrofile, og grensen for påvisning er ca 1 x 106 nøytrofile i en 6 mm såret14.
I vår representant resultater sammenligne vi langsgående nøytrofile og S. aureus kinetics i sårene av LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / -. Vi vet er dette denne første studie som sammenligner bakteriell byrden og nøytrofile handel mellom wild type og immunsupprimerte mus langs gjennom oppløsning av infeksjon. Av spesiell interesse er graden av nøytrofile rekruttering demping forårsaket av S. aureus infeksjon i MyD88- / - belastningen, noe som skapte en 15% nedgang i nøytrofile menneskehandel i vill type mus sammenlignet med en 50% reduksjon i MyD88-/ -. S. aureus er stand til å unngå vertens immunforsvaret ved å produsere en rekke virulens faktorer kjent for å hemme indirekte nøytrofile handel (dvs., α-toksin Panton-Valentine leukocidin og Chemotaxis hemmende protein23 , 24), og våre resultater indikerer at MyD88 signalnettverk, sannsynligvis gjennom TLR2, TLR4 og IL-1R, er avgjørende for å overvinne strategiene ansatt av S. aureus å unngå vert immunreaksjoner. Virulens faktor-knockout S. aureus stammer kan brukes i denne modellen for å karakterisere deres effekt på myelogen celle menneskehandel13. Videre, når studerte sammen med LysM-EGFP × MyD88- / - musen, denne modellen høydepunkter rollen MyD88 signalering i bekjempe de patogene virkningene virulens faktorer.
Det er flere viktige trinn i denne protokollen som hvis utført feil kan innføre variasjon i studier. Såret og infeksjon prosedyrer er enkle sammenlignet med andre mus sykdom modeller, men det er ikke uten sin vanskelighetene. Hud punch biopsies er svært skarp og kan lett kutt i spinotrapezius musklene under huden. Skade denne muskelen og dens fascia endrer nøytrofile rekruttering og øker variasjonen mellom mus og en resulterer i en mer invasiv S. aureus infeksjoner som ikke er sentrert i såret. Mus med betydelig skade på spinotrapezius muskelen bør utelukkes fra studier.
En annen kilde til feil i denne modellen kommer fra endringer i den bioluminescent S. aureus press over tid, som kan endre i vivo BLI signaler og vekst kinetics. ALC2906 belastning inneholder en shuttle plasmider som inneholder det endrede lux operon fra Photorhabdus luminescens konstruksjon som kreves for å produsere den bioluminescent signaler, som kan bli forkastet av S. aureus bakterier over tid25. I en buljong kultur uten utvalg produsert 97% av SH1000 kolonier bioluminescent signaler på dag 3. Denne frekvensen falt 53% på dag 5 og 21% på dag 1026. Dermed på senere tidspunkt løpet smittsomme, i vivo BLI signalene vil trolig begynne å litt (< 1 Logg forskjell) undervurdere faktiske i vivo bakterielle belastningen. Det er viktig å fryse ned frisk glyserol aksjer av S. aureus med antibiotikumet utvalg å opprettholde plasmider ved ankomst og erstatte arbeider bestander av bakterier ofte (dvs., hver tredje måned) kan forhindre tap av den bioluminescent konstruksjon under kultur vedlikehold. Nyere stammer av bioluminescent S. aureus inneholder et stabilt integrert bioluminescent konstruere27,28 og er trolig en forbedring i den ALC2906 stammen brukt i denne modellen.
Mens denne modellen er nyttig å studere lokaliserte dermal S. aureus infeksjoner, har begrensninger. I vivo BLI signaler om bakterielle belastningen er begrenset til sår og tilstøtende huden. Modellen gir ikke en pålitelig avlesning for dypt invasiv infeksjoner som sepsis, og dyr må være euthanized for å måle spredning av bakterier i til blodet eller nyrene13. Nyere og lysere utviklet bioluminescent stammer er generert som kan tillate oppdaging av i vivo BLI signaler fra indre organer27,28. I tillegg langsgående gjenkjenning og overvåkingssystem av nøytrofile handel ikke kan måles i andre vanligvis ervervet S. aureus infeksjoner, inkludert luftveiene og blod infeksjoner. Redusert følsomhet på grunn av vev autofluorescence er også om begrensning av denne modellen. Nylig utviklet Catchup musen benytter en TdTomato RFP under Ly6G arrangøren og kan ha en høyere signal til støyforhold enn den LysM-EGFP mus grunn redusert vev auto fluorescens i RFP kanal11.
Den potensielle crosstalk mellom i vivo BLI og FLI utslipp signaler i denne modellen er verdig til diskusjon, men er ubetydelig. Hvis vi utfører eksperimenter uten lys eksitasjon og bare samle i vivo FLI EGFP signaler ved hjelp av 520/20-filteret, følger vi ikke noen merkbar signaler fra infiserte mus, demonstrere at samlet signaler er fra i vivo FLI EGFP signaler og ikke fra overlapping i vivo BLI signaler av bakterier (data ikke vist). Dette er hovedsakelig på grunn av signal samling tid, det er bare 1 sekund for i vivo FLI og 1 minutt for i vivo BLI et bestemt eksitasjon bølgelengde filter 465/30 nm og utslipp filter på 520/20 nm. Disse innstillingene lar for optimal påvisning av i vivo FLI EGFP signaler uten bidrag fra i vivo BLI signaler. Dette er best demonstrert ved sammenligning i størrelsesorden av y-aksen mellom figur 3D og figur 4A. Signalene fra den i vivo BLI er ca 100-fold mindre enn i vivo FLI av EGFP signaler, indikerer at i vivo BLI signalene er ubetydelig og bidra til mindre enn 1% av signaler fra i vivo FLI.
Vi forventer fremtidige anvendelser av denne modellen vil hjelpe forskere oppdage karakterisere S. aureus virulens faktorer og tjene som en pre-klinisk dyr modell å teste romanen legemiddelselskap som mål å fjerne S. aureus infeksjon ved å øke den medfødte immunforsvaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Lloyd S. Miller har fått stipend støtte fra MedImmune, Pfizer, Regeneron, og Chan snart-Shiong Nanthealth Foundation og konsulenttjenester avgifter fra Noveome Biotherapeutics og Chan snart-Shiong Nanthealth Foundation som er relatert til arbeidet som er rapportert i dette papiret. Andre forfattere ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse tilskudd R01 AI129302 (til S.I.S.) og treningsprogrammet i farmakologi: fra benken til sengen på UC Davis (NIH T32 GM099608 til L.S.A). Den molekylære og genomisk Imaging (CMGI) ved University of California Davis gitt suveren teknologisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
