Summary
En tilgang er beskrevet til real-time opdagelse af medfødte immun respons til kutane såret og Staphylococcus aureus infektion af mus. Ved at sammenligne LysM-EGFP mus (som besidder fluorescerende neutrofiler) med en LysM-EGFP krydset immundefekte mus stamme, vi fremme vores forståelse af infektion og udvikling af metoder til at bekæmpe infektion.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) infektioner, herunder methicillin resistente pletter, er en enorm byrde på sundhedssystemet. Med forekomst af S. aureus infektion klatring årligt, er der et behov for yderligere forskning i sin sygdomsfremkaldende evne. Dyremodeller for smitsomme sygdomme fremme vores forståelse af vært-patogen svar og føre til udviklingen af effektiv terapi. Neutrofiler spille en primær rolle i medfødte immun reaktion, der styrer S. aureus infektioner ved at danne en byld at væg off infektion og lette bakteriel regnskabsafslutningen; antallet af neutrofiler, at infiltrere en S. aureus hudinfektion ofte korrelerer med sygdom resultat. LysM-EGFP mus, som besidder den forbedrede grøn fluorescerende protein (EGFP) indsat i lysozym M (LysM) promotor-regionen (udtrykt primært af neutrofiler), når det bruges sammen med in vivo hele dyr fluorescens imaging (FLI) giver en middel til at kvantificere neutrofile emigration noninvasively og på langs i såret hud. Når det kombineres med en en bioluminescerende S. aureus stamme og sekventiel in vivo hele dyr en bioluminescerende imaging (BLI), det er muligt at overvåge langs både neutrofile rekruttering dynamics og in vivo bakteriel byrde i stedet for infektion i bedøvede mus fra starten af infektionen til opløsning eller død. Mus er mere modstandsdygtige over for en række virulens faktorer produceret af S. aureus , der letter effektiv kolonisering og infektion hos mennesker. Immundefekte mus giver en mere følsomme dyremodeller for at undersøge vedvarende S. aureus infektioner og therapeutics evne til at øge medfødte immunrespons. Heri, karakterisere vi svar i LysM-EGFP-mus, der har været avlet til MyD88-mangelfuld mus (LysM-EGFP × MyD88- / - mus) sammen med wild-type LysM-EGFP mus at undersøge S. aureus hud sårinfektion. Multispektrale samtidige registrering aktiveret undersøgelse af neutrofile rekruttering dynamics ved hjælp af in vivo FLI, bakteriel byrde ved hjælp af in vivo BLI, og sårheling på langs og noninvasively over tid.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) tegner sig for størstedelen af hud og bløddele infektioner (SSTIs) i USA1. Forekomsten af methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infektioner er steget støt over de sidste to årtier2, motivere studier af mekanismerne af persistens og opdagelsen af nye behandling strategier. Standarden for pleje for MRSA-infektioner er systemisk antibiotikabehandling, men MRSA er blevet mere og mere resistente over for antibiotika over tid3 og disse stoffer kan mindske værtens gavnlige microbiome, forårsager negative sundhedsmæssige effekter, især i børn4. Prækliniske studier har undersøgt alternative strategier til at behandle MRSA infektioner5, men oversætte disse tilgange til klinikken har været udfordrende på grund af fremkomsten af virulens faktorer, at forpurre vært immunrespons6. For at dissekere vært-patogen dynamics drevet S. aureus SSTIs, kombinerer vi noninvasive og langsgående udlæsninger antal af neutrofiler rekrutteret til sår sengen med kinetic foranstaltninger af bakteriel overflod og sår område.
Neutrofiler er den mest rigelige cirkulerende leukocyt i mennesker og de første respondere til en bakteriel infektion7. Neutrofiler er et nødvendigt element for en effektiv host reaktion mod S. aureus infektioner på grund af deres bakteriedræbende mekanismer, herunder produktion af reaktive ilt arter, proteaser, antimikrobielle peptider og funktionelle løsninger herunder fagocytose og neutrofile ekstracellulære fælde produktion8,9. Menneskelige patienter med genetiske defekter i neutrofile funktion som kronisk granulomatøs sygdom og Chediak-Higashi syndrom, viser en øget modtagelighed for S. aureus infektioner. Derudover, patienter med genetiske (f.eks medfødt neutropeni) og erhvervet (såsom neutropeni ses hos patienter, kemoterapi) defekter i neutrofile numre er også meget modtagelige for S. aureus infektion10. Betragtning af betydningen af neutrofiler i clearing S. aureus infektioner, kan forbedring af deres immun kapacitet eller tuning deres tal inden for en S. aureus læsion bevise en effektiv strategi for at løse infektion.
I det sidste årti, er Transgene mus med fluorescens neutrofile journalister blevet udviklet for at studere deres handel med11,12. Kombinere neutrofile reporter mus med hele dyr Billeddannende teknikker tillader spatiotemporelle analyse af neutrofiler i væv og organer. Når det kombineres med en bioluminescerende stammer af S. aureus, er det muligt at spore ophobning af neutrofiler i svar til S. aureus overflod og persistens i forbindelse med bakteriel virulens faktorer der direkte og indirekte forurolige neutrofile numre i berørte væv13,14,15,16.
Mus er mindre modtagelige for S. aureus virulens og immun unddragelse mekanismer end mennesker. Som sådan, wild-type mus ikke kan være en ideel dyremodel til at undersøge effekten af et givet terapeutiske til behandling af kronisk S. aureus infektion. MyD88-mangelfuld mus (dvs., MyD88- / - mus), en immunkompromitterede mus stamme, der mangler funktionelle interleukin-1 receptor (IL-1R) og Toll-lignende receptor (TLR) signalering, Vis større modtagelighed for S. aureus infektioner sammenlignes Wild-type mus17 og en forringelse i neutrofile handel til en lokalitet af S. aureus infektion i huden18. Udvikling af en mus-stamme, der besidder en fluorescerende neutrofile reporter i MyD88- / - mus har givet en alternativ model for at undersøge effekten af terapier til behandling af S. aureus infektion i forhold til nuværende neutrofile reporter mus.
I denne protokol, vi karakterisere S. aureus infektion i immunsvækkede LysM-EGFP × MyD88- / - mus, og sammenligne tidsforløb og opløsning af infektion med LysM-EGFP-mus. LysM-EGFP × MyD88- / - mus udvikler en kronisk infektion, der ikke løser, og 75% bukke under for infektion efter 8 dage. En væsentlig fejl i indledende neutrofile rekruttering, der opstår over 72 h af den inflammatoriske fase af infektion, og 50% færre neutrofiler rekruttere under den sidste fase af infektion. Øget modtagelighed af LysM-EGFP × MyD88- / - mus gør dette bestemt stamme en streng prækliniske model til at vurdere effekten af nye terapeutiske teknikker rettet mod S. aureus infektion i forhold til aktuelle modeller udnytte wild-type mus, især teknikker med henblik på at øge den medfødte immunrespons mod infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus undersøgelser blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget ved UC Davis og blev udført efter retningslinjerne i den animalsk velfærd opføre og sundhedsloven forskning forlængelse. Sørg for at bruge sterile handsker, når du arbejder med dyr.
1. med musen kilde og boliger
- Udlede LysM-eGFP mus på en C57BL/6J genetiske baggrund som tidligere beskrevet12. Udlede LysM-EGFP × MyD88- / - mus ved at krydse LysM-EGFP mus med MyD88- / - mus på en C57BL/6J baggrund.
- Hus mus i en vivarium. For disse undersøgelser, dyr har været opstaldet på University of California, Davis i grupper før kirurgi og enkelt opstaldet følgende kirurgi. Bruge mus i alderen 10-16 uger.
2. Bakteriers forberedelse og kvantificering
- Fjern den en bioluminescerende S. aureus stamme af interesse fra-80 ° C oplagring at tø på is. Stribe på en 5% kvæg blod agar plade. Inkuber den stribede plade i en fugtig inkubator ved 37 ° C natten over (16 h).
Bemærk: I denne protokol, ALC2906 SH1000 stammen blev brugt. Denne stamme indeholder shuttle plasmidet pSK236 med penicillin-bindende protein 2 promotor sammenvokset til luxABCDE reporter kassette fra Photohabdus luminescens18. - Forberede tryptic soja bouillon (TSB) ved at blande 0,03 g TSB pulver pr. mL rent vand og autoklave TSB at sterilisere. Når afkølet, føje eventuelle nødvendige antibiotika ved hjælp af steril teknik. I denne protokol, skal du tilføje 10 µg/mL af chloramphenicol18 til TSB vælge for udtryk for pSK236 shuttle plasmidet, som indeholder bioluminescens luxABCDE kassette.
- Pick 3-4 separate kolonier fra S. aureus plade i TSB med 10 µg/mL chloramphenicol at starte en overnight kultur. Inkuber bakterier på en kvægbruget shaker ved 37 ° C natten over (16 h).
- Start en ny bakteriekulturen fra overnight kultur ved fortynding af en prøve 1:50 i TSB med 10 µg/mL chloramphenicol. Kultur i en kvægbruget shaker på 200 rpm og 37 ° C.
- To timer efter opdeling S. aureus, overvåge den optisk tæthed på 600 nm (OD600) på et spektrofotometer. Observere OD600 vs tid til at finde midten af logaritmiske fase vækst. For ALC2906 SH1000 stammen, en OD600 af 0,5 er midten af Logaritmisk og svarer til en koncentration af 1 x 108 CFU/mL (figur 1).
- Når OD600 er 0,5, vaske bakterier 1:1 med iskold DPBS. Centrifugeres bakterier i 10 min på 3.000 x g og 4 ° C. Omhyggeligt den dekanteres og tilføje ekstra kølet DPBS og vortex grundigt. Der centrifugeres igen i 10 min. ved 3.000 x g og 4 ° C.
- Forsigtigt dekanteres. Bakteriel resuspenderes i en ønskede koncentration. For disse undersøgelser, indsamle 3 mL af ALC2906 SH1000 og resuspend i 1,5 mL PBS, korrelerede bakterier koncentration af omkring 2 x 108 CFU/mL. Holde bakterier på køl indtil brug.
- For at kontrollere bakterier koncentration, fortyndes 100 µL af bakteriel prøve 1:10,000 og 1:100,000 i PBS. Plade 20 µL delprøver på en agar plade. Der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig inkubator for 16 h. Count CFUs ved grov undersøgelse og beregne en bakteriel koncentration den følgende dag.
3. excisional huden Wounding og podning med S. aureus
- Administrere 100 µL af 0,03 mg/mL buprenorphin hydrochlorid (~0.2 mg/kg) til hver mus via intraperitoneal injektion.
- Tyve minutter efter injektion, sted 2-4 mus i et kammer med 2-3 LPM ilt med 2-4% isofluran. Når musene er fuldt bedøvede, overføre mus et ad gangen til en næsen kegle er forbundet til 2-3 LPM ilt med 2-4% isofluran. Kontrollere mus er fuldt bedøvede af fast klemme hver bageste pote mellem en tommel- og pegefinger. Fortsæt til næste trin, hvis dyret ikke reagerer på knibe.
- Barbere en 1 tomme af 2 tomme afsnit på bagsiden af musen med elektrisk trimming og rydde området af pels udklip ved hjælp af en ren tørre eller gaze. Undgå at bruge depilatory lotion, fordi det kan forårsage overskydende betændelse.
- Ren gennemblødt ryg musen først med 10% povidon-jod gennemblødt gaze og derefter med en 70% ethanol gaze. Rens området i en spiral mønster, bevæger sig udad fra midten af det kirurgiske område. Vent ca. 1 min. til det kirurgiske område tørre forud for operationen.
-
Hold den glatbarberet bagsiden af musen løst mellem to fingre og tryk fast på en steril 6 mm punch biopsi på midten af den forberedte kirurgisk område. Ikke træk huden stram.
- Twist punch biopsi for at oprette en cirkulær disposition på huden, som fuldt skærer gennem huden i mindst én sektion af dispositionen. Pas på ikke at skære i den underliggende fascia eller væv.
- Brug steril saks og pincet til at skære gennem epidermis og dermis efter cirkelmønster præget af punch biopsi.
4. S. Aureus podning
- Fyld en 28 G insulin sprøjte med den ønskede en bioluminescerende bakterielle inoculant. I denne undersøgelse, administrere en koncentration af 1 x 108 CFU/mL (50 µL). Ikke administrere mere end 100 µL af volumen.
-
Injicér 50 µL af inoculant mellem fascia og væv i midten af sår på ryggen af musen. Sikre, at inoculant danner en boble på midten af såret med minimal lækage eller dispersion.
- Trække dermis til side og hold sprøjten næsten parallelt med vævet langsomt skubbe sprøjten ind i vævet, indtil et pludseligt fald i modstand er følte, som angiver piercing i fascia. Omhyggeligt føre sprøjten ind i midten af såret og undvære inoculant langsomt. Fjern sprøjten langsomt fra dyret.
- Indsprøjtes den samme mængde af steril PBS i sårene af ikke-inficerede dyr, som beskrevet ovenfor.
- Returnere dyret til sit bur. Placer buret under en varmelampe eller oven på en varmepude, og overvåge dyret indtil recovery fra anæstesi.
5. i Vivo BLI og FLI
- Initialiser hele dyr imager gennem instrumentet software. Bedøver mus i et kammer modtager 2-3 LPM ilt med 2-4% isofluran. Levere anæstesi til nosecones inde imager.
-
Sted den sårede og inficerede mus i imager. Placer musen, således, at såret er så fladt som muligt. Brug de følgende sekvens set-up til at afbilde mus.
- Vælg Luminescence og fotografere som imaging-tilstand. Eksponeringstiden er 1 min på små binning og f-stop 1 (luminescens) og f-stop 8 (fotografi). Filteret emission er åben. Klik på knappen erhverve at registrere billedet.
- Vælg fluorescens og fotografere som imaging-tilstand. Eksponeringstiden er 1 s på små binning og f-stop 1 (Fluorescens) og f-stop 8 (fotografi) med en excitation boelgelaengden 465/30 nm og en emission bølgelængde 520/20 nm med en høj lampe intensitet. Klik på knappen erhverve at registrere billedet.
- Returnere dyret til sit bur og monitor indtil recovery fra anæstesi.
- Billede mus dagligt som beskrevet ovenfor.
6. billedanalyse
- Åbne billeder til kvantificeres.
- Placer en stor cirkulær region af interesse (ROI) over hele såret området herunder omgivende hud efter hver mus i billedet. Neutrofile in vivo FLI EGFP signaler og in vivo BLI S. aureus signaler overskride sår kant efter flere dage og var inkluderet i disse undersøgelser (figur 2A og 2B). Klik på Foranstaltning ROI og registrere værdier for gennemsnitlig flux til hver mus. Afbilde den gennemsnitlige flux hvert signal (p/s) versus tid.
-
Hvis absolutte tal af neutrofiler eller S. aureus i såret er ønsket, udføre de følgende eksperimenter.
- For at korrelere neutrofile numre til in vivo FLI EGFP signaler, sår C57BL/6J mus som beskrevet ovenfor, og overføre en række knoglemarv-afledte neutrofile (5 x 105 til 1 x 107) fra LysM-EGFP eller LysM-EGFPxMyD88- / - donorer direkte på forskellige sår. Billede som beskrevet ovenfor og korrelerer det in vivo FLI EGFP signaler til det kendte antal neutrofiler.
- For at korrelere S. aureus CFU in vivo BLI signaler, sår og inficere mus som beskrevet ovenfor. På dag 1 efter infektionen optage in vivo BLI signaler fra mus og straks aflive og chill slagtekroppe. Punktafgifter såret, homogeniseres væv og plade bakteriel fortyndinger på agar i natten inkubation. Den næste dag, tælle kolonier til at bestemme CFU pr. sår.
- At måle sår healing fit en cirkulær ROI over såret kant og måle området af såret (cm2) og plot af fraktioneret ændring fra baseline vs tid (figur 2 c).
7. statistik
Bemærk: Alle data præsenteres som betyde ±SEM. Pedersen < 0,05 blev anset for statistisk signifikant
- Bestemme forskelle mellem to grupper på en enkelt dag ved hjælp af metoden Holm-Sidak, med alpha = 0,05 og analysere hvert tidspunkt individuelt, uden at påtage sig en konsekvent SD.
- Sammenlign forskellene mellem flere grupper på den samme dag af en-vejs ANOVA med Tukey multiple sammenligninger posttest. Overlevelse mellem eksperimenterende grupper blev analyseret af metoden Mantel-Cox.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LysM-EGFP × MyD88- / - mus er mere modtagelige for S. aureus infektioner end LysM-EGFP mus
Stamme af S. aureus anvendes i denne undersøgelse, ALC290618, blev bygget med et plasmid, der indeholder de lux konstruktion, der producerer en bioluminescerende signaler fra levende og aktivt metaboliske bakterier. Når podet ind i musene, kan in vivo bioluminescens imaging (BLI) teknikker bruges til at måle på langs bakterier byrde inden for et inficeret sår. LysM-EGFP × MyD88- / - mus og LysM-EGFP mus blev såret og inficeret med 1 x 107 CFU af S. aureus i såret til at sammenligne deres følsomhed over for S. aureus infektioner. LysM-EGFP × MyD88- / - mus viste større modtagelighed for infektion end LysM-EGFP mus viste af 80% dødelighed af LysM-EGFP × MyD88- / - mus i løbet af de første 8 dage af infektion sammenlignet med 0% dødelighed af LysM-EGFP mus under den hele 15-dages varighed eksperiment (figur 3A). Begge stammer af mus mistede ~ 5% legeme last efter infektion, men LysM-EGFP mus inddrives oprindelige vægt af dag 2, mens LysM-EGFP × MyD88- / - mus ikke gjorde gendanne tabte vægt (figur 3B). Såret lukning i overværelse af S. aureus infektion var ikke anderledes mellem de to stammer; sterilely sårede LysM-EGFP × MyD88- / - havde imidlertid en betydelig mangel i sårheling i forhold til LysM-EGFP mus (figur 3 c), som tidligere rapporteret19. Hele dyret imaging blev brugt til at måle bakteriel byrde dagligt, og så tidligt som i dag 1, LysM-EGFP × MyD88- / - sår havde en højere bakteriel byrde end LysM-EGFP sår. LysM-EGFP mus kontrolleret infektion og faldt in vivo BLI signaler i såret, mens LysM-EGFP × MyD88- / - mus udstillet en forøgelse af bakterielle byrde plateaued på dag 4 indtil dyrs død (figur 3D,E). Sammen, viser disse data LysM-EGFP × MyD88- / - mus øget modtagelighed for S. aureus infektioner sammenlignes LysM-EGFP mus.
Neutrofile handel er nedsat i S. aureus inficeret LysM-EGFP × MyD88- / - mus i forhold til LysM-EGFP mus
LysM-EGFP musen producerer grøn fluorescerende neutrofiler på grund af en EGFP protein kodet downstream af lysozym M promotor12. Denne mus har været udnyttet til at studere langsgående in vivo neutrofile handel med svar på dermal S. aureus infektion13,14,20,21,22. Hvis du vil sammenligne neutrofile kinetik sår produceret på LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus, en 6 mm fuld tykkelse hud sår blev administreret på dorsum, og mus blev afbildet dagligt. En 40% reduktion af neutrofile handel til sår blev observeret i LysM-EGFP × MyD88- / - i forhold til LysM-EGFP mus (figur 4A, C). Når 1 x 107 CFU af S. aureus blev indført umiddelbart efter sårede, neutrofile handel var svækket i begge stammer af mus, men LysM-EGFP × MyD88- / - mus blev mere følsomme over for S. aureus infektioner med respektere neutrofile ansættelse. Infektion forårsaget en 50% fald i indledende neutrofile handel til LysM-EGFP × MyD88- / - sår i forhold til et fald på 15% observeret i LysM-EGFP sår (figur 4B). LysM-EGFP mus også rekrutteret betydeligt mere neutrofiler på såret under de senere faser af infektion (figur 4A,C) i forhold til LysM-EGFP × MyD88- / - mus, som ikke var i stand til at øge antallet af neutrofile selv i den tilstedeværelsen af vedvarende bakteriel byrde. Sammen, viser disse data, at LysM-EGFP × MyD88- / - mus har en defekt i neutrofile ansættelse, som er i overensstemmelse med deres øget modtagelighed for S. aureus infektioner.
Figur 1: Sammenhæng mellem OD600 og CFU tæller for ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 kolonier blev plukket fra en agar plade og overført til TSB med 10 µg/mL chloramphenicol for natten kultur. Den næste dag, suspensionen blev opdelt TSB 1:50 med 10 µg/mL chloramphenicol og kulturperler. Optisk tæthed på 600 nm (OD600) blev målt i regelmæssige intervaller efter 2 timer ved hjælp af et spektrofotometer. Ved hver måling var bakterier fortyndet 1:100,000 i iskolde PBS og aliquoted på en agar plade i natten inkubation. CFUs blev optalt dagen efter for at beregne den begyndelseskoncentration og korreleret til OD600. N = 3 med 4 forskellige OD600 målinger pr. eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative region af interesse (ROIs) til dataanalyse. For at analysere in vivo BLI og in vivo FLI signaler, store, tilsvarende størrelse ROIs var centreret over såret og samlede flux (fotoner pr. sekund) blev målt. For at måle sår lukning, en ROI var egnet til sår kant og område (cm2) blev målt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: LysM-EGFP × MyD88- / - mus er mere modtagelige for S. aureus infektioner sammenlignes LysM-EGFP mus. LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus blev administreret en 6 mm sår på dorsum og inficeret med 1 x 107 CFU af en bioluminescerende S. aureus eller sterilt saltvand. Dyr var overvåges dagligt og (A) overlevelse og (B) vægt blev registreret. Dyrene blev afbildet dagligt til foranstaltning (C) sår størrelse og (D) bakteriel luminescens. (E) repræsentant en bioluminescerende billeder er afbildet fra inficerede LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus. Skalalinjen = 3 mm. Data repræsenterer 7-16 mus pr. gruppe for A, C, og D og 3 mus pr. gruppe for B og er udtrykt som gennemsnitlig ±SEM. * p = 0,05, ** p = 0,01, ***p = 0,001, *p < 0,0001 mellem inficeret (A, B, < / C18 > og D) eller inficerede (C) grupper. Statistisk signifikans var fedtfrie Mantel-Cox test (A) og metoden Holm-Sidak (B-D), med alpha = 0,05, og hver gang punkt var analyseres individuelt, uden at påtage sig en konsekvent SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: LysM-EGFP × MyD88- / - mus har defekte neutrofile rekruttering til inficerede sår.
LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus blev administreret en 6 mm sår på dorsum og inficeret med 1 x 107 CFU af en bioluminescerende S. aureus eller sterilt saltvand. Dyrene blev afbildet dagligt for at måle (A, B) neutrofile indhold. (C) repræsentative fluorescerende billeder er afbildet fra inficerede og ikke-inficerede LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / - mus. Skalalinjen = 5 mm. Data repræsenterer 8-16 mus pr. gruppe og er udtrykt som gennemsnitlig ±SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, og *** p < 0,001 mellem inficeret grupper og # p < 0,01 mellem inficerede grupper (A) eller som afbildet på grafen (B). Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af metoden Holm-Sidak (A), med alpha = 0,05, og hver gang punkt var analyseres individuelt, uden at påtage sig en konsekvent SD, og en-vejs ANOVA (B), med Tukey multiple-sammenligninger post-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. aureus infektion modeller, der udnytter en bioluminescerende S. aureus infektion i en fluorescerende neutrofile reporter mus sammen med avancerede teknikker i hele dyr in vivo optisk tænkelig har avanceret vores viden om den medfødte immun reaktion på infektion. Tidligere undersøgelser ved hjælp af LysM-EGFP musen har vist, at op til 1 x 107 neutrofiler rekruttere til en S. aureus inficerede sår over de første 24 timer af infektion14og sår-rekrutteret neutrofiler udvide deres halveringstid fra 1,5 dage til 5 dage som svar på en S. aureus-inficeret sår22. En overlevelse taktik tilpasset af mus til at bekæmpe infektion handel med hæmatopoietisk stamceller og stamceller (HSPC) til et inficeret sår fra knoglemarven, hvor de udvide til bakteriedræbende EGFP+ neutrofiler i en TLR2/MyD88/PGE2 afhængige måde21. Extramedullary granulopoiesis indeholder desuden en vigtig kilde til neutrofiler at redde S. aureus inficeret MyD88- / - mus fra dødbringende sepsis13. Adoptiv overførsel af HSPC fra LysM-EGFP mus til vildtype mus gør det muligt at undersøge processen med lokale neutrofile produktion og dens betydning i bekæmpelsen af S. aureus inden for en såret13,21. Det er også muligt at kalibrere netop antallet neutrofiler i såret; neutrofile antal i sår korrelerer lineært med EGFP signal fra 1 x 106 til større end 1 x 107 neutrofiler, og påvisningsgrænse er ca 1 x 106 neutrofiler i en 6 mm sår14.
I vores repræsentative resultater sammenligner vi langsgående neutrofile og S. aureus kinetik i LysM-EGFP og LysM-EGFP × MyD88- / -sår. Vores viden er denne første undersøgelse, der sammenligner bakteriel byrde og neutrofile handel mellem vildtype og immunkompromitterede mus på langs gennem opløsning af infektion. Af særlig interesse er graden af neutrofile rekruttering dæmpning forårsaget af S. aureus infektion i MyD88- / - stamme, som fremkaldte en 15% reduktion af neutrofile handel med vildtype mus i forhold til en 50% nedgang i MyD88-/ -. S. aureus er i stand til at unddrage sig værtens immunreaktion ved at producere en række virulens faktorer kendt for at hæmme indirekte neutrofile handel (dvs., α-toksin, Panton-Valentine leukocidin og Chemotaxis hæmmende protein23 , 24), og vores resultater viser, at MyD88 signalering, sandsynligvis gennem TLR2, TLR4 og IL-1R, er afgørende for at overvinde de strategier, der er ansat af S. aureus at unddrage sig vært immunrespons. Virulens faktor-knockout S. aureus stammer kan bruges i denne model til at karakterisere deres effekt på myeloide celler menneskehandel13. Yderligere, da studerede sammen med LysM-EGFP × MyD88- / - mus, denne model fremhæver den rolle MyD88 signalering i bekæmpelsen af de sygdomsfremkaldende virkninger af virulens faktorer.
Der er flere vigtige skridt i denne protokol, hvis udført forkert kan indføre variabilitet i undersøgelser. De sårede og infektion procedurer er ligetil i forhold til andre mus sygdomsmodeller, men det er ikke uden sine snørklede. Huden punch biopsier er meget skarpe og kan nemt skære i spinotrapezius musklen under huden. Skader denne muskel og dens fascia ændrer neutrofile rekruttering og øger variabiliteten mellem mus og en resultater i en mere invasive S. aureus -infektion, der ikke er centreret i såret. Mus med betydelige skader på spinotrapezius muskel bør udelukkes fra undersøgelser.
En anden kilde til fejl i denne model kommer fra ændringer i den en bioluminescerende S. aureus stamme over tid, som kan ændre in vivo BLI signaler og vækst kinetik. ALC2906 stammen indeholder en shuttle plasmid, der indeholder den ændrede lux operon fra Photorhabdus luminescens konstruktion, der er nødvendige for at producere en bioluminescerende signaler, som kan være kasseret af S. aureus bakterier over tid25. I en bouillon kultur uden markering produceret 97% af SH1000 kolonier en bioluminescerende signaler på dag 3. Denne frekvens faldet til 53% på dag 5 og 21% på dag 1026. Således, på senere tidspunkter under den smitsomme kursus, in vivo BLI signaler vil sandsynligvis begynde at lidt (< 1 log forskel) undervurdere den faktiske i vivo bakteriel byrde. Det er vigtigt at fryse ned frisk glycerol bestande af S. aureus med antibiotika valg at opretholde plasmid ved ankomsten og erstatte arbejder bestande af bakterier ofte (dvs., hver tredje måned) kan hjælpe med at forhindre tab af den en bioluminescerende konstruere under kultur vedligeholdelse. Nyere stammer af en bioluminescerende S. aureus indeholde et stabilt integreret en bioluminescerende konstruere27,28 , og er sandsynligvis en forbedring over den ALC2906 stamme, der anvendes i denne model.
Mens denne model er nyttige at studere lokaliserede dermal S. aureus infektioner, det har begrænsninger. In vivo BLI signalerne fra bakteriel byrde er begrænset til sår og tilstødende hud. Modellen giver ikke et pålideligt udlæsning til dyb invasive infektioner såsom sepsis, og dyr skal aflives for at måle spredningen af bakterier i blodbanen eller nyrer13. Nyere og lysere manipuleret en bioluminescerende stammer er blevet genereret, kan muliggøre påvisning af in vivo BLI signaler fra indre organer27,28. Derudover langsgående opdagelse og overvågning af neutrofile handel ikke kan måles i andre almindeligt erhvervet S. aureus infektioner, herunder luftvejssygdomme og blod infektioner. Reduceret følsomhed på grund af væv autofluorescence er også en begrænsning af denne model. Den nyligt udviklede Catchup mus udnytter en TdTomato RFP Ly6G promotor og kan have en højere signal til støjforhold end LysM-EGFP musen skyldes reduceret væv auto fluorescens i RFP kanal11.
Den potentielle krydstale mellem in vivo BLI og FLI emission signaler i denne model er værdig til diskussion, men er ubetydelig. Hvis vi udføre eksperimenter uden lys excitation og kun indsamle in vivo FLI EGFP signaler ved hjælp af filteret 520/20, overholder vi ikke nogen mærkbare signaler fra inficerede mus, viser, at indsamlet signaler fra in vivo FLI EGFP signaler og ikke fra overlapning af in vivo BLI signaler af bakterier (data ikke vist). Dette skyldes primært den signal samling tid, der er kun 1 sekund for in vivo FLI og 1 minut for in vivo BLI og en specifik excitation bølgelængde filter af 465/30 nm og emission filter 520/20 nm. Disse indstillinger giver mulighed for optimal detektion af in vivo FLI EGFP signaler uden bidrag fra in vivo BLI signaler. Dette er bedst til udtryk når man sammenligner størrelsen af y-aksen mellem figur 3D og figur 4A. Signalerne fra in vivo BLI er omkring 100 mindre end in vivo FLI af EGFP signaler, der angiver, at in vivo BLI signaler er ubetydelig og bidrage til mindre end 1% af de signaler, der er observeret fra in vivo FLI.
Vi forventer, fremtidige anvendelser af denne model vil hjælpe forskere oplev og karakterisere S. aureus virulens faktorer og tjene som en prækliniske dyremodeller til at teste nye therapeutics, der har til formål at rydde S. aureus infektion ved at øge den medfødte immunrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Lloyd S. Miller har modtaget tilskud fra MedImmune, Pfizer, Regeneron, og Chan snart-Shiong Nanthealth Foundation og høring gebyrer fra Noveome Biotherapeutics og Chan snart-Shiong Nanthealth Foundation, der er relateret til det arbejde, der er rapporteret i dette papir. Andre forfattere har intet at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed tilskud R01 AI129302 (til S.I.S.) og træningsprogram i farmakologi: fra bænken til Bedside ved UC Davis (NIH T32 GM099608 til L.S.A). Molekylær og genomisk Imaging (CMGI) på University of California Davis ydet fremragende teknologiske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
