Summary
גישה זו מתוארת זיהוי בזמן אמת של התגובה החיסונית מולדת ופצעו עורית, Staphylococcus aureus זיהום של עכברים. מאת LysM בהשוואת-EGFP עכברים (אשר מחזיקים נויטרופילים פלורסנט) עם LysM-EGFP crossbred immunodeficient עכבר זן, נוכל לקדם את ההבנה שלנו של זיהום ופיתוח של גישות כדי להילחם זיהום.
Abstract
Staphylococcus aureus זיהומים (S. aureus), לרבות עמיד methicillin כתמים, הם נטל עצום על מערכת הבריאות. עם שיעורי ההיארעות של זיהום S. aureus טיפוס מדי שנה, יש ביקוש נוספים במחקר שלה פתוגניות. מודלים חייתיים של מחלות זיהומיות לקדם את ההבנה שלנו של התגובה פתוגן-פונדקאי ולהוביל להתפתחות של הרפוי יעיל. נויטרופילים לשחק תפקיד ראשי התגובה החיסונית מולדת השולט S. aureus זיהומים על ידי יצירת מורסה קיר את הזיהום, להקל על חיסול חיידקים; המספר של נויטרופילים זה לחדור זיהום עור S. aureus לעיתים קרובות עולה בקנה אחד עם תוצאות המחלה. עכברים LysM-EGFP, אשר מחזיקים את משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) הוכנס האזור יזם ליזוזים מ' (LysM) (לידי ביטוי בעיקר על ידי נויטרופילים), בעת שימוש בשילוב עם ויוו פלורסצנטיות כל חיה הדמיה (כאשר שגיא) לספק אמצעי לכימות הגירה נויטרופילים noninvasively ו longitudinally לתוך העור הפצוע. בשילוב עם ביולומנאסן S. aureus זן והדמיה רציפים ויוו כל בעלי חיים זוהרים (בלי), זה אפשרי לעקוב longitudinally dynamics גיוס נויטרופילים והן נטל חיידקי ויוו באתר של זיהום ומורדמת עכברים מן התחלה של זיהום רזולוציה או מוות. עכברים הם עמידים יותר בפני מספר גורמים התקפה אלימה המיוצר על ידי S. aureus המאפשרים קולוניזציה יעיל ולדלקת בבני אדם. עכברים immunodeficient מספקות מודל בעלי חיים רגיש יותר לבחון מתמשך S. aureus זיהומים ואת היכולת של הרפוי כדי להגביר את תגובות מערכת החיסון המולדת. במסמך זה, נוכל לאפיין תגובות בעכברים LysM-EGFP זה יש כבר וגדל לעכברים MyD88 לקויה (LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים) יחד עם פראי-סוג עכברים LysM-EGFP לחקור זיהום הפצע העור S. aureus . זיהוי סימולטני מולטי ספקטריאליות מחקר של גיוס נויטרופילים dynamics באמצעות ויוו כאשר שגיא, נטל חיידקי באמצעות רבנות בלי ויוו, וההגדרה פצע ריפוי longitudinally, noninvasively לאורך זמן.
Introduction
Staphylococcus aureus (S . aureus) חשבונות עבור הרוב המכריע של העור וזיהומים רקמות רכות (SSTIs) ארצות הברית1. השכיחות של סטפילוקוקוס עמיד methicillin- S. aureus (MRSA) זיהומים גדל בהתמדה על העבר שני עשורים2, עידוד המחקר של המנגנונים של התמדה, הגילוי של אסטרטגיות טיפול חדשות. הטיפול לזיהומים MRSA הוא טיפול אנטיביוטי מערכתית, אבל MRSA הפכה יותר ויותר עמידים בפני אנטיביוטיקה במהלך הזמן3 , תרופות אלו יכולים להפחית microbiome מועיל של המחשב המארח, גרימת השפעות בריאותיות שליליות, בעיקר ילדים4. פרה מחקרים בחנו אסטרטגיות חלופיות לטיפול זיהומים MRSA5, אך בתרגום גישות אלה למרפאה הוכיח מאתגר בשל הופעתה של הגורמים התקפה אלימה לסכל מארח תגובות חיסוניות6. לנתח הדינמיקה פתוגן-מארח את הכונן SSTIs S. aureus , אנו משלבים לא פולשנית, המפרט האורך של המספר של נויטרופילים מגויס מיטת הפצע באמצעים קינטי השפע חיידקי פצע באזור.
הנויטרופילים הם ליקוציט במחזור הנפוץ ביותר בני האדם ואת המגיבים הראשונים זיהום חיידקי7. הנויטרופילים הם מרכיב הכרחי עבור מענה מארח יעיל נגד זיהומים S. aureus עקב מנגנונים אחרים שלהם, כולל הפקה של מינים חמצן תגובתי, פרוטאזות, פפטידים מיקרוביאלית ותגובות פונקציונלי לרבות phagocytosis נויטרופילים מלכודת חוץ-תאי ייצור8,9. בני אדם חולים עם פגמים גנטיים בתפקוד נויטרופילים, כגון מחלה גרגירומת ממושכת, תסמונת Chediak-היגאשי, מראים רגישות. מוגברת לזיהומים S. aureus . בנוסף, חולים עם גנטי (כגון נויטרופניה מולדים), שנרכש (כגון נויטרופניה לראות בחולים כימותרפיה) פגמים מספרים נויטרופילים הם גם רגישים מאוד S. aureus זיהום10. בהתחשב בחשיבות של נויטרופילים ב ניקוי S. aureus זיהומים, שיפור יכולת המערכת החיסונית שלהם או כוונון המספרים שלהם בתוך פצע S. aureus יוכיח אסטרטגיית יעיל בפתרון זיהום.
בעשור האחרון, העכברים הטרנסגניים עם כתבים נויטרופילים פלורסצנטיות פותחו ללמוד שלהם11,סחר12. שילוב כתב נויטרופילים עכברים עם כל החיות טכניקות הדמיה מאפשרת ניתוח זמן-מרחבי של נויטרופילים ב רקמות ואיברים. בשילוב עם זנים ביולומנאסן של S. aureus, ניתן לעקוב אחר ההצטברות של נויטרופילים בתגובה S. aureus שפע, התמדה בהקשר של התקפה אלימה חיידקי גורמים במישרין ובעקיפין perturb מספרים נויטרופילים הרקמה הנגועה13,14,15,16.
עכברים הם רגישים פחות התקפה אלימה S. aureus התחמקות מנגנוני החיסון מאשר בני אדם. ככזה, לא ייתכן פראי-סוג עכברים במודל חיה אידיאלי כדי לחקור את היעילות של בהתחשב טיפולית לטיפול כרוני S. aureus זיהום. MyD88 לקויה עכברים (קרי, MyD88- / - עכברים), זן העכבר immunocompromised חסר קולטן interleukin-1 תפקודית (IL-1R), אגרה דמוי קולטן (TLR) איתות, הצג רגישות גדולה יותר לזיהומים S. aureus בהשוואה פראי-סוג עכברים17 , ליקוי ב סחר נויטרופילים באתר של S. aureus זיהום העור18. התפתחות זן העכבר שמחזיק כתבת נויטרופילים פלורסנט בעכברים- / - MyD88 סיפקה מודל אלטרנטיבי לחקור את היעילות של טיפולים לטיפול זיהום S. aureus בהשוואה נויטרופילים הנוכחי כתב עכברים.
ב פרוטוקול זה, אנו מאפיינים את S. aureus זיהום בעכברים immunocompromised LysM-EGFP × MyD88- / - , להשוות את משך הזמן ואת הרזולוציה של זיהום עם העכברים LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים לפתח דלקת כרונית אינה פותרת, 75% ללקות זיהום לאחר 8 ימים. פגם משמעותי בגיוס נויטרופילים הראשונית מתרחשת מעל 72 h בשלב דלקתיות של זיהום, 50% פחות נויטרופילים לגייס בשלב האחרון של זיהום. הרגישות מוגברת של × LysM-EGFP MyD88 עכברים- / - הופכת את המסוים זן דגם פרה קפדני כדי להעריך את היעילות של טכניקות טיפוליות חדשות מיקוד S. aureus זיהום לעומת הנוכחי מודלים זה לנצל פראי-סוג עכברים, במיוחד טכניקות במטרה לשפר את התגובה החיסונית המולדת מפני זיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל עכבר מחקרים נבחנו, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה ב- UC דיוויס, בוצעו בהתאם לקווים המנחים של חוק רווחת בעלי חיים, חוק הבריאות מחקר סיומת. הקפד להשתמש בכפפות סטריליות בעת עבודה עם בעלי חיים.
1. עכבר מקור ודיור
- שואבים עכברים LysM-eGFP על רקע גנטי C57BL/6J כפי שתואר לעיל12. שואבים LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים על ידי מעבר LysM-EGFP עכברים עם עכברים- / - MyD88 על רקע C57BL/6J.
- עכבר הבית ביבר. על מחקרים אלו, שוכנו חיות ב אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס בקבוצות לפני ניתוח, ניתוח הבאים שוכנו יחיד. השתמש עכברים בין הגילאים 10-16 שבועות.
2. חיידקי והכנה כמת
- הסר את ביולומנאסן S. aureus זן עניין מ-80 מעלות צלזיוס אחסון להפשיר על קרח. פס על צלחת אגר דם שור 5%. דגירה על צלחת מרוחים חממה humidified ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (ג 16).
הערה: פרוטוקול זה, המתח ALC2906 SH1000 שימשה. זן זה מכיל את pSK236 פלסמיד הסעות עם האמרגן פניצילין מחייב חלבון 2 התמזגו בקלטת כתב luxABCDE מ Photohabdus luminescens18. - להכין מרק סויה tryptic (TSB) על ידי ערבוב 0.03 נקודות גר' אבקה TSB לכל מיליליטר מים טהורים, החיטוי TSB לחטא. מקורר, מוסיפים אנטיביוטיקה הצורך בטכניקה סטרילי. ב פרוטוקול זה, להוסיף 10 µg/mL כלורמפניקול18 TSB כדי לבחור עבור הבעת פלסמיד הסעות pSK236, אשר מכיל את הקלטת luxABCDE ביולומינסנציה.
- לבחור 3-4 מושבות נפרדות מהצלחת S. aureus לתוך TSB עם 10 µg/mL כלורמפניקול להתחיל תרבות בין לילה. דגירה חיידקים על שייקר ומוכנסות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (ג 16).
- התחל חיידקי תרבות חדשה מתרבות לילה דילול דוגמה 1:50 לתוך TSB עם 10 כלורמפניקול µg/mL. תרבות שייקר ומוכנסות ב 200 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס.
- שעתיים לאחר פיצול של S. aureusלפקח על הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) על ספקטרופוטומטרים. לבחון את יתר600 לעומת זמן למצוא את הגידול שלב אמצע-לוגריתמי. לזן של ALC2906 SH1000 ', יתר600 של 0.5 אמצע-לוגריתמי, מקביל ריכוז עונה 1 פרק 10-8 CFU/mL (איור 1).
- כאשר יתר600 0.5, לשטוף חיידקים 1:1 עם DPBS קר כקרח. Centrifuge החיידק למשך 10 דקות, ב-3,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. בזהירות decant את תגובת שיקוע ולהוסיף DPBS צוננים נוספים מערבולת ביסודיות. צנטריפוגה פעם נוספת עבור 10 דקות ב-3,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
- Decant בקפידה את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר חיידקי-ריכוז הרצוי. מחקרים אלו, לאסוף 3 מ"ל של ALC2906 SH1000, resuspend ב mL 1.5 ל- PBS, מתאם כדי ריכוז חיידקים של בערך 2 x 108 CFU/mL. לשמור על חיידקים על הקרח עד השימוש.
- כדי לוודא ריכוז חיידקים, לדלל 100 µL של חיידקי מדגם 1:10,000, כוללות ב- PBS. צלחת 20 aliquots µL על צלחת אגר. דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה humidified עבור ה 16 הרוזן CFUs בבדיקה מגעיל, לחשב ריכוז חיידקי ביום המחרת.
3. excisional Wounding העור, חיסון עם S. aureus
- לנהל µL 100 של 0.03 נקודות מ"ג/מ"ל. הבופרנורפין הידרוכלוריד (~0.2 מ"ג/ק"ג) כל העכבר באמצעות זריקה בקרום הבטן.
- פוסט-זריקה עשרים דקות, מקום 2-4 עכברים בחדר עם 2-3 LPM חמצן עם 2-4% איזופלוריין. ברגע עכברים הם מורדם לחלוטין, להעביר את העכברים אחד בכל פעם כדי קונוס האף מחובר לחמצן LPM 2-3 עם 2-4% איזופלוריין. ודא עכברים הם מורדם לחלוטין על ידי בחוזקה צובט כל כף הרגל האחורית בין האגודל לאצבע. המשך לשלב הבא, אם בעל החיים אינו מגיב בלחץ.
- לגלח 1 אינץ ' על-ידי סעיף 2 אינץ ' על הגב של העכבר עם קוצץ חשמלי ולנקות את האזור של גזירות פרווה באמצעות ניגוב נקי או גזה. הימנע משימוש קרם depilatory כי זה עלול לגרום לדלקת עודף.
- נקי האחורי של העכבר הראשון עם 10% povidone-יוד ספוג גזה ואחר כך עם אתנול 70% של ספוג גזה. נקו את האזור בדפוס ספירלה, נע החוצה מן המרכז של אזור הניתוח. המתן כ 1 דקות לאזור כירורגי להתייבש לפני הניתוח.
-
החזק המגולח מאחורי העכבר באופן רופף בין שתי אצבעות ולחץ בחוזקה ביופסיה אגרוף סטרילי 6 מ מ במרכז של אזור הניתוח מוכן. . אל תעשה את העור מתוח.
- סובב את הביופסיה אגרוף כדי ליצור קו מיתאר מעגלית על העור באופן מלא שחותך דרך העור בסעיף אחד לפחות של החלוקה לרמות. יש להיזהר לא לחתוך fascia או הרקמה הבסיסית.
- להשתמש מלקחיים ומספריים סטרילי כדי לחתוך דרך האפידרמיס בדרמיס בעקבות התבנית המעגלית מוטבע על ידי לקחת את הביופסיה.
4. ס aureus חיסון
- ממלאים מזרק אינסולין 28 גרם inoculant הרצוי חיידקים זוהרים. במחקר זה, לנהל את ריכוז עונה 1 פרק 10-8 CFU/mL (50 µL). לא לנהל יותר מ 100 µL של אמצעי אחסון.
-
מזריקים µL 50 של inoculant בין fascia רקמה במרכז של הפצע על הגב של העכבר. ודא כי inoculant הטפסים בועה במרכז הפצע עם דליפה מינימלי או פיזור.
- משוך הדרמיס לצד, החזק את המזרק כמעט במקביל הרקמה ולאחר לאט לדחוף את המזרק לתוך הרקמה עד לירידה פתאומית התנגדות מורגשת, המציינת נוקבת של fascia. בזהירות להוביל את המזרק לתוך המרכז של הפצע, לוותר על inoculant לאט. הסר את המזרק לאט החיה.
- מזריקים באותו אמצעי אחסון של PBS סטרילי לתוך הפצעים של בעלי חיים נגוע כמתואר לעיל.
- להחזיר את החיה לכלוב שלו. למקם את הכלוב מתחת למנורת חום או על גבי כרית החימום, ולעקוב אחר בעל החיים עד ההתאוששות מן ההרדמה.
5. ב מתה על Vivo ו זאת ביחד
- אתחל םלצה כל בעלי חיים דרך התוכנה כלי נגינה. עזים ומתנגד עכברים בחדר קבלת חמצן LPM 2-3 עם 2-4% איזופלוריין. להעביר nosecones בתוך םלצה הרדמה.
-
הנח את העכבר פצועים ואף נגוע לתוך םלצה. מיקום העכבר כך הפצע הוא שטוח ככל האפשר. השתמש את קביעת רצף הבאים כדי התמונה העכברים.
- בחר הפריה חוץ גופית , לצלם מצב הדמיה. זמן החשיפה הוא 1 דקות binning קטן ו- F/להפסיק 1 (הפריה חוץ גופית), F/להפסיק 8 (צילום). מסנן פליטה פתוחה. לחץ על לחצן ייבוא כדי להקליט את התמונה.
- בחר פלורסצנטיות , לצלם מצב הדמיה. הגיע הזמן חשיפה 1 s binning קטן, F/להפסיק 1 (זריחה) ו- F/להפסיק 8 (צילום) עם אורך גל עירור של 465/30 nm ו של ננומטר אורך גל 520/20 פליטה בעוצמה המנורה גבוה. לחץ על לחצן ייבוא כדי להקליט את התמונה.
- להחזיר את החיה לכלוב של צג עד ההתאוששות מן ההרדמה.
- התמונה עכברים מדי יום כמפורט לעיל.
6. ניתוח תמונות
- תמונות פתוח ניתן לכמת.
- מיקום אזור עגול גדול עניין (ROI) מעל אזור הפצע כולו כולל שמסביב עור עבור כל העכבר בתמונה. נויטרופילים ויוו שמסמן כאשר שגיא EGFP ויוו מתה על S. aureus אותות להרחיב מעבר לקצה פצע לאחר מספר ימים, נכללו במחקרים אלה (איור 2A ו- 2B). לחץ על רועי למדוד ערכי רשומה עבור השטף הממוצע עבור כל עכבר. מגרש שטף הממוצע של כל אות (p/s) לעומת פעם.
-
אם מספרים מוחלטים של נויטרופילים או S. aureus בפצע הם הרצויה, לבצע את הניסויים הבאים.
- לתאם מספרים נויטרופילים על האותות כאשר שגיא EGFP ויוו, פצע עכברים C57BL/6J כמתואר לעיל, ולאחר להעביר מגוון של נויטרופילים הנגזרות מח עצם (5 x 105 ל 1 x 107) LysM-EGFP או תורמים- / - LysM-EGFPxMyD88 ישירות מעל לפציעות שונות. התמונה כפי שתואר לעיל, correlate EGFP כאשר שגיא ויוו אותות לכמות הידוע של נויטרופילים.
- תשבחות S. aureus CFU האותות רבנות בלי ויוו, פצע ולהדביק על עכברים כמתואר לעיל. ביום 1 לאחר הפגיעה הרשומה ויוו רבנות בלי אותות מן העכברים ומיד המתת חסד ולהירגע הגוויות. לסלק את הפצע, homogenize את הרקמה, צלחת דילולים חיידקי על אגר במשך לילה הדגירה. למחרת, לספור מושבות כדי לקבוע CFU לכל הפצע.
- כדי למדוד את בכושר ריפוי הפצע של רועי מעגלית מעל הקצה הפצע, למדוד האזור הפצע (2ס מ), מגרש את השינוי החלקי מקו לעומת זמן (איור 2C).
7. סטטיסטיקה
הערה: כל הנתונים מוצגים ±SEM רעה. p < 0.05 נחשבו סטטיסטית
- לקבוע את ההבדלים בין שתי הקבוצות ביום יחיד באמצעות השיטה הולם-Sidak עם אלפא = 0.05, לנתח כל נקודת זמן בנפרד, מבלי בהנחה SD. עקבית
- להשוות הבדלים בין קבוצות מרובות באותו יום על ידי חד-כיווני אנובה עם posttest השוואות מרובות Tukey. הישרדות בין קבוצות הניסוי נותחה על ידי שיטת האח-קוקס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים רגישים יותר לזיהומים S. aureus מאשר עכברים LysM-EGFP
המתח של S. aureus השתמשו במחקר זה, ALC290618, נבנה עם פלסמיד המכיל הבונה לאקס המייצר אותות ביולומנאסן של חיידקים חיים פעיל חילוף חומרים. כאשר מחוסן לתוך עכברים, ויוו ביולומינסנציה הדמיה (בלי) טכניקות ניתן למדוד longitudinally נטל חיידקים בתוך פצע מזוהם. LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים ועכברים LysM-EGFP היו פצועים, נגוע עונה 1 פרק 107 CFU של S. aureus בתוך הפצע כדי להשוות את הרגישות לזיהום S. aureus . LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים הראו רגישות גדולה יותר לזיהומים מאשר עכברים LysM-EGFP הפגינו מאת lethality 80% של LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים 8 הימים הראשונים של זיהום לעומת 0% הקטלניות של עכברים LysM-EGFP במהלך משך 15 יום שלם של הניסוי (איור 3 א). שני זנים של עכברים איבד משקל הגוף ~ 5% בעקבות זיהום, אבל LysM-EGFP עכברים התאושש המשקל המקורי על ידי יום 2, בעוד LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים לא התאושש לאיבוד משקל (איור 3B). סגירת הפצע בנוכחות זיהום S. aureus לא היה שונה בין שני זנים; עם זאת, × LysM-EGFP sterilely הפצועים MyD88- / - היה פגם משמעותי ריפוי הפצע לעומת עכברים LysM-EGFP (איור 3C), כפי שדווחה בעבר19. כל החיה הדמיה שימש כדי למדוד את הנטל חיידקי מדי יום, והיה מוקדם ככל יום 1, LysM-EGFP × MyD88- / - פצעים נטל חיידקי גבוה יותר מאשר פצעים LysM-EGFP. LysM-EGFP עכברים מבוקר זיהום וירידה ויוו רבנות בלי אותות בתוך הפצע, בעוד LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים הציג גידול חיידקי העול plateaued ביום 4 עד המוות בבעלי חיים (איור תלת-ממד,E). יחד, נתונים אלה מדגימים את הרגישות מוגברת של LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים לזיהום S. aureus לעומת עכברים LysM-EGFP.
סחר נויטרופילים פגום ב- S. aureus נגוע LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים לעומת עכברים LysM-EGFP
העכבר LysM-EGFP מייצרת ירוק ניאון נויטרופילים עקב חלבון EGFP מקודד במורד הזרם יזם ליזוזים מ'12. העכבר הזה יש כבר מנוצל ללמוד האורך ויוו נויטרופילים סחר בתגובה עורי S. aureus זיהום13,14,20,21,22. כדי להשוות קינטיקה נויטרופילים לפצעים המיוצר על LysM-EGFP, LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים, פצע בעור מלא עובי 6 מ מ היה מנוהל על dorsum, עכברים היו עם תמונה מדי יום. 40% ירידה סחר נויטרופילים לפצעים נצפתה ב LysM-EGFP × MyD88- / - לעומת עכברים LysM-EGFP (איור 4A, ג). כאשר עונה 1 פרק 107 CFU של S. aureus הוצג מיד לאחר פציעתו, סחר נויטרופילים היה הקלוש של שני זני עכברים, אבל LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים היו רגישים יותר לזיהומים S. aureus עם הכבוד גיוס נויטרופילים. דלקת הנגרמת של 50% ירידה נויטרופילים הראשונית סחר LysM-EGFP × MyD88- / - לפצעים לעומת ירידה של 15% שנצפתה פצעים LysM-EGFP (איור 4B). LysM-EGFP עכברים גם גייס נויטרופילים יותר באופן משמעותי על הפצע במהלך בשלבים מאוחרים יותר של זיהום (איור 4A,C) בהשוואה ל- LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים, אשר לא הצליחו להגביר את מספרים נויטרופילים, אפילו נוכחות של הנטל חיידקי מתמשכת. יחד, נתונים אלה מדגימים כי LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים יש פגם בגיוס נויטרופילים, אשר עולה בקנה אחד עם שלהם רגישות מוגברת לזיהומים S. aureus .
איור 1: מתאם בין OD600 CFU נחשב ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 המושבות היו שנקטפו צלחת אגר, הועבר לתוך TSB עם 10 µg/mL כלורמפניקול לתרבות לילה. למחרת, ההשעיה היה לפצל 1:50 TSB עם 10 µg/mL כלורמפניקול, תרבותי. צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) נמדד לאחר 2 שעות שימוש ספקטרופוטומטרים במרווחי זמן קבועים. כל אחת מהמידות החיידק היה כוללות מדולל ב- PBS קר כקרח, aliquoted על גבי צלחת אגר במשך לילה הדגירה. CFUs היו ספרתי ביום המחרת כדי לחשב את הריכוז ההתחלתי, בקורלציה OD600. N = 3 עם מדידות600 OD שונים 4 לכל ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אזור מייצגים אינטרסים (ROIs) לניתוח נתונים. כדי לנתח בלי ויוו ואת אותות כאשר שגיא ויוו, גדולים, המקבילה ROIs בגודל היו ממורכז על הפצע, נמדד סך השטף (פוטונים לשניה). כדי למדוד את סגירת הפצע, רועי היה להתאים לקצה הפצע, נמדד שטח (2ס מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים רגישים יותר לזיהומים S. aureus לעומת עכברים LysM-EGFP. LysM-EGFP ו- LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים נוהלו 6 מ"מ על dorsum פצע, נגוע עונה 1 פרק 107 CFU של ביולומנאסן S. aureus או מלח סטרילית. בעלי חיים היו תחת פיקוח יומיומי, הישרדות (A) ו- (B) משקל נרשמו. בעלי חיים היו עם תמונה מדי יום ועד גודל הפצע מידה (C) (D) חיידקי הפריה חוץ גופית. (E) להחליפן בתמונות ביולומנאסן מתוארים נגועים LysM-EGFP, LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים. סרגל קנה מידה = 3 מ מ. נתונים לייצג 7-16 עכברים לכל קבוצה A, C, ו- D ו- 3 עכברים לכל קבוצה עבור B, מבוטא ±SEM מרושע. * p = 0.05, * * p = 0.01, * * *p = 0.001, *p < 0.0001 בין נגוע (A, B < / סי18 > ו- D) או uninfected (ג) קבוצות. מובהקות סטטיסטית נקבע באמצעות מבחן מדף-קוקס (A) ושיטת הולם-Sidak (B-D), עם אלפא = 0.05, ואני כל הזמן נקודת נותחו בנפרד, מבלי בהנחה SD. עקבית אנא לחץ כאן כדי להציג גדול יותר הגירסה של הדמות הזו.
איור 4: LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים חייב גיוס נויטרופילים פגומים פצעים נגועים.
LysM-EGFP ו- LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים נוהלו 6 מ"מ על dorsum פצע, נגוע עונה 1 פרק 107 CFU של ביולומנאסן S. aureus או מלח סטרילית. בעלי חיים היו עם תמונה מדי יום כדי למדוד את תוכן נויטרופילים (A, B). (ג) להחליפן בתמונות פלורסנט מתוארים נגוע, לבריא LysM-EGFP, LysM-EGFP × MyD88- / - עכברים. סרגל קנה מידה = 5 מ מ. הנתונים ייצגו 8-16 עכברים לכל קבוצה, מבוטא ±SEM מרושע. * p < 0.05, * * p < 0.01, ו * * * p < 0.001 בין נגוע קבוצות, # p < 0.01 בין uninfected קבוצות (A) או את מתואר בגרף (B). מובהקות סטטיסטית נקבע באמצעות השיטה הולם-Sidak (א), עם אלפא = 0.05, ואני כל הזמן נקודת נותחו בנפרד, מבלי בהנחה, עקבי SD ו חד-כיווני אנובה (B), עם Tukey מרובות-מההשוואות לאחר הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. aureus זיהום מודלים לנצל ביולומנאסן S. aureus זיהום ב עכבר כתב נויטרופילים פלורסנט בשילוב עם טכניקות מתקדמות של כל חיה דימות אופטי ויוו המתקדמת שלנו ידע מולד התגובה החיסונית לזיהום. מחקרים קודמים באמצעות העכבר LysM-EGFP הראו כי למעלה עונה 1 פרק 107 נויטרופילים לגייס כדי פצע מזוהם S. aureus במשך 24 השעות הראשונות של זיהום14ו נויטרופילים גייס הפצע להאריך מחצית החיים שלהם מ- 1.5 ימים עד חמישה ימים בתגובה S. aureus-נגוע הפצע22. טקטיקה הישרדות הותאם על ידי עכברים כדי להילחם זיהום היא סחר של גזע hematopoietic, ובתאים (HSPC) כדי פצע מזוהם ממח העצם שבו התפשטותם אחרים EGFP+ נויטרופילים ב TLR2/MyD88/PGE2 אופן התלויים21. בנוסף, extramedullary granulopoiesis מספק מקור חיוני של נויטרופילים להציל S. aureus נגוע MyD88 עכברים- / - אלח דם קטלני13. העברה המאמצת של HSPC מ- LysM-EGFP עכברים לתוך פראי סוג עכברים מאפשר לבחון את תהליך ייצור נויטרופילים המקומי וחשיבותו ב הייהוד שלה S. aureus בתוך הפצע13,21. זה גם אפשרי לכייל בדיוק את המספר של נויטרופילים בפצע; מספר נויטרופילים הפצעים באופן ליניארי להרכב האיתות EGFP עונה 1 פרק 106 ' גדול מ- 1 x 107 נויטרופילים, המגבלה של זיהוי נויטרופילים6 כ עונה 1 פרק 10 הפצע של 6 מ מ14.
התוצאות נציג שלנו אנו משווים נויטרופילים האורך וקינטיקה S. aureus על הפצעים של LysM-EGFP, LysM-EGFP × MyD88- / -. לידע שלנו, זהו המחקר הראשון אשר משווה את הנטל חיידקי ואת נויטרופילים סחר בין פראי סוג עכברים immunocompromised longitudinally דרך ברזולוציה של זיהום. עניין מיוחד היא מידת הגיוס נויטרופילים הנחתה הנגרמת על ידי זיהום S. aureus MyD88- / - המתח, אשר elicited לירידה 15% נויטרופילים בבני אדם פראי סוג עכברים לעומת 50% ירידה MyD88-/ -. S. aureus הוא מסוגל להתחמק התגובה החיסונית של המחשב המארח על ידי ייצור מספר גורמים התקפה אלימה ידוע לעכב בעקיפין סחר נויטרופילים (קרי, α-הרעלן פנטון-ולנטיין leukocidin, חלבון מעכבות כימוטקסיס23 , 24), התוצאות שלנו מציינות כי MyD88 איתות, ככל הנראה דרך TLR2, TLR4 ו- IL-1R, הוא קריטי כדי להתגבר על האסטרטגיות המועסקים על ידי S. aureus כדי להתחמק תגובות מערכת החיסון של הפונדקאי. התקפה אלימה פקטור-נוק אאוט S. aureus זנים ניתן להשתמש במודל זה כדי לאפיין את השפעתם על התאים מיאלואידית סחר13. עוד יותר, כאשר למד יחד עם LysM-EGFP × MyD88- / - העכבר, מודל זה מדגיש את התפקיד של MyD88 איתות ב הייהוד שלה השפעות פתוגניים הגורמים התקפה אלימה.
ישנם מספר שלבים קריטיים פרוטוקול זה אם נעשתה באופן לא תקין יכול להציג השתנות במחקרים. התהליכים ופצעו ולדלקת הם פשוט לעומת דגמים אחרים של מחלת בעכבר, אך זה לא בלי מורכבותם. ביופסיות ניקוב עור חד מאד, יכול לחתוך בקלות לתוך השריר spinotrapezius מתחת לעור. נזק השריר הזה ואת שלה fascia הפיצולים גיוס נויטרופילים ומגביר את השתנות בין עכברים ותוצאות של דלקת S. aureus פולשניים יותר הוא לא מרוכז בתוך הפצע. עכברים עם נזק משמעותי לשריר spinotrapezius לא להיות כלולים מחקרים.
מקור נוסף של שגיאה במודל זה נובע שינויים ביולומנאסן S. aureus מאמץ לאורך זמן, אשר יכול לשנות ויוו רבנות בלי אותות וקינטיקה צמיחה. המתח ALC2906 מכיל את פלסמיד הסעות המכיל את אופרון ששונה לאקס מן המבנה Photorhabdus luminescens הנדרש כדי לייצר את הסימנים זוהרים, אשר יכול להיות מושלך על ידי החיידק S. aureus מעל הזמן25. בתרבות מרק ללא בחירה, 97% של המושבות SH1000 המיוצר אותות ביולומנאסן ביום 3. בתדר זה ירד ל-53% ביום 5 ו- 21% על יום 1026. לפיכך, בשלבים מאוחרים יותר זמן במהלך הקורס זיהומיות, האותות רבנות בלי ויוו כנראה יתחיל מעט (< יומן 1 ההבדל) להמעיט בפועל ויוו בנטל חיידקי. זה חשוב להקפיא את מניות גליצרול טריים של S. aureus עם הבחירה אנטיביוטי כדי לשמר את פלסמיד בעת ההגעה והעזיבה החלפת מניות עבודה של חיידקים בתדירות גבוהה (קרי, כל שלושה חודשים) יכול לסייע במניעת אובדן לבנות זוהרים בזמן תחזוקה תרבות. זנים חדשים של ביולומנאסן S. aureus מכיל27,stably משולב לבנות זוהרים28 , סביר להניח שיפור מעל המתח ALC2906 בשימוש במודל זה.
מודל זה הוא שימושי ללמוד עורי מקומי S. aureus זיהומים, יש לו חוקים. האותות רבנות בלי ויוו מהנטל חיידקי מוגבל הפצע ואת העור סמוכים. המודל אינו מספק readout אמין של זיהומים עמוק פולשניים כגון אלח דם, חיות חייב להרדימם כדי למדוד את הפצתו של חיידקים למחזור הדם או הכליות13. זנים מהונדסים בהיר ורענן יותר זוהרים נוצרו זה יכולים להרשות הגילוי של ויוו רבנות בלי אותות מן האיברים הפנימיים27,28. בנוסף, האורך זיהוי וניטור של סחר נויטרופילים לא יכול להימדד בשני נפוץ רכשה זיהומים S. aureus , כולל נשימה ודם זיהומים. רגישות מופחתת בשל רקמת autofluorescence הוא גם מגבלה של מודל זה. העכבר הקטשופ שפותחו לאחרונה מנצל של RFP TdTomato תחת האמרגן Ly6G, עשוי אות גבוה יותר ליחס רעש יותר מהעכבר LysM-EGFP בשל לצמצם רקמות פלורסצנטיות אוטומטי RFP ערוץ11.
Crosstalk פוטנציאלי בין ויוו רבנות בלי, כאשר שגיא פליטה אותות במודל זה הוא ראוי לדיון אבל הוא זניח. אם אנחנו מבצעים ניסויים ללא עירור אור ולאסוף רק אותות כאשר שגיא EGFP ויוו באמצעות מסנן 520/20, לנו אסור לצפות כל אותות ניכר עכברים נגועים, הממחיש את אותות שנאספו אותות כאשר שגיא EGFP ויוו ולא חפיפה של אותות רבנות בלי ויוו של החיידק (נתונים לא מוצג). זאת בעיקר בשל זמן אוסף האות, וזה רק לשנייה אחת כאשר שגיא ויוו, 1 דקה על רבנות בלי ויוו, מסנן גל עירור מסוים של מסנן 465/30 ננומטר, פליטה של 520/20 ננומטר. הגדרות אלה מאפשרות גילוי אופטימלית של אותות כאשר שגיא EGFP ויוו ללא התרומה ויוו רבנות בלי אותות. הוכח בצורה הטובה ביותר כאשר משווים את סדר גודל של ציר ה-y בין דמות תלת-ממד איור 4A. אותות רבנות בלי ויוו הוא כ 100-fold פחות הסימנים כאשר שגיא של EGFP ויוו, המציין כי האותות רבנות בלי ויוו זניחים ולתרום פחות מ 1% של האותות הבחינו מפני כאשר שגיא ויוו.
אנו מצפים יישומים עתידיים של מודל זה יעזור החוקרים לגלות, לאפיין את הגורמים התקפה אלימה S. aureus לשמש מודל בעלי חיים פרה-קליניים כדי לבדוק את הריפוי שמטרתם לנקות S. aureus זיהום על-ידי האצת תגובה חיסונית מולדת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לויד מילר ס קיבל מענק תמיכה MedImmune, פייזר, Regeneron, צ'אן מוקדם-Shiong Nanthealth קרן ואת דמי ייעוץ של חברת Noveome וקרן Nanthealth מוקדם-Shiong Chan שאינן קשורות לעבודה דיווח נייר זה. המחברים האחרים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים R01 AI129302 (כדי רפ), את תוכנית האימונים בפרמקולוגיה: מן הספסל אל מיטתה ב UC דייוויס (NIH T32 GM099608 אל L.S.A). מולקולרית של גנומית הדמיה (CMGI) ב אוניברסיטת קליפורניה דיוויס סיפק תמיכה טכנולוגית מעולה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
