Summary
Un approccio è descritto per la rilevazione in tempo reale della risposta immunitaria innata di ferite cutanee e Staphylococcus aureus infezione dei topi. Di confronto LysM-EGFP topi (che possiedono i neutrofili fluorescenti) con un LysM-EGFP incrociate topo immunodeficiente, abbiamo anticipato la nostra comprensione dell'infezione e lo sviluppo di approcci per combattere l'infezione.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) infezioni, compresi meticillina resistente alle macchie, sono un enorme onere per il sistema sanitario. Con tassi di incidenza di infezione da Staphylococcus aureus arrampicata annualmente, c'è una domanda per ulteriori ricerche nelle sua patogenicità. Modelli animali di malattia infettiva avanzano la nostra comprensione della risposta ospite-patogeno e portano allo sviluppo di terapie efficaci. I neutrofili svolgono un ruolo primario nella risposta immunitaria innata che controlla le infezioni da S. aureus formando un ascesso per muro fuori l'infezione e facilitare lo spazio batterico; il numero dei neutrofili che infiltrarsi un'infezione della pelle di S. aureus spesso correla con risultato di malattia. Topi LysM-EGFP, che possiedono la proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) inserita nella regione del promotore di lisozima M (LysM) (espressa principalmente dai neutrofili), quando utilizzato in combinazione con imaging in vivo animale intero fluorescenza (FLI) forniscono un mezzi di quantificazione del neutrofilo emigrazione non invadente e longitudinalmente in pelle ferita. Quando combinato con un bioluminescenti Staphylococcus aureus strain e sequenziale in vivo imaging intero animale bioluminescente (BLI), è possibile monitorare longitudinalmente sia le dinamiche di reclutamento dei neutrofili e la carica batterica in vivo presso il sito di infezione nei topi anestetizzati dall'inizio dell'infezione alla risoluzione o alla morte. I topi sono più resistenti a una serie di fattori di virulenza prodotta da S. aureus che facilitano efficace colonizzazione e l'infezione in esseri umani. Topi immunodeficienti forniscono un modello animale più sensibile per esaminare persistente S. aureus infezioni e la possibilità di terapeutica per amplificare la risposta immune innata. Nel presente documento, ci caratterizzano le risposte in topi LysM-EGFP che sono stati allevati per topi MyD88-carenti (LysM-EGFP × MyD88- / - topi) insieme con selvaggio-tipo LysM-EGFP topi per indagare lo Staphylococcus aureus pelle infezione della ferita. Rilevazione simultanea multispettrali abilitato studio delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili utilizzando in vivo FLI, carica batterica utilizzando BLI in vivo e cicatrizzazione longitudinalmente e non invadente nel corso del tempo.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) rappresenta la maggior parte della pelle e infezioni dei tessuti molli (SSTI) in Stati Uniti d'America1. L'incidenza di meticillino-resistenti Staphylococcus aureus (MRSA) infezioni è aumentato costantemente sopra il passato due decenni2, motivare lo studio dei meccanismi di persistenza e la scoperta di nuove strategie di trattamento. Lo standard di cura per le infezioni da MRSA è la terapia antibiotica sistemica, ma MRSA è diventato sempre più resistente agli antibiotici nel corso tempo3 e questi farmaci possono diminuire microbiome benefico dell'host, causando effetti negativi sulla salute, soprattutto in bambini4. Studi preclinici hanno esaminato le strategie alternative per il trattamento di infezioni di MRSA5, ma tradurre questi approcci alla clinica ha dimostrato difficile a causa di comparsa di fattori di virulenza che contrastare host le risposte immunitarie6. Per sezionare le dinamiche di ospite-patogeno tale unità S. aureus SSTI, uniamo non invadente e letture longitudinale del numero di neutrofili reclutati al letto della ferita con misure cinetiche dell'abbondanza batterica e la zona ferita.
I neutrofili sono il più abbondanti leucociti circolanti negli esseri umani e i primi soccorritori ad un' infezione batterica7. I neutrofili sono una componente necessaria per una risposta efficace ospite contro le infezioni da Staphylococcus aureus dovuto i loro meccanismi battericidi, compresa la produzione delle specie reattive dell'ossigeno, proteasi, peptidi antimicrobici e le risposte funzionali tra cui la fagocitosi e trappola extracellulari del neutrofilo produzione8,9. I pazienti umani con difetti genetici in funzione dei neutrofili, come la malattia granulomatosa cronica e la sindrome di Chediak-Higashi, mostrano un aumento della suscettibilità alle infezioni di S. aureus . Inoltre, pazienti con genetiche (come la neutropenia congenita) e acquisite (quali neutropenia vista nei pazienti di chemioterapia) difetti nei numeri del neutrofilo sono anche altamente suscettibili di S. aureus infezione10. Data l'importanza dei neutrofili in compensazione le infezioni da S. aureus , rafforzandone la capacità immunitaria o tuning loro numeri all'interno di una lesione di S. aureus può rivelarsi una strategia efficace nel risolvere l'infezione.
Nell'ultimo decennio, topi transgenici con i giornalisti del neutrofilo di fluorescenza sono stati sviluppati per studiare il loro traffico di11,12. Combinando i topi reporter del neutrofilo con tecniche di imaging animale intero consente analisi spazio-temporale dei neutrofili in tessuti e organi. Quando combinato con bioluminescenti ceppi di Staphylococcus aureus, è possibile tracciare l'accumulo di neutrofili in risposta all'abbondanza di S. aureus e persistenza nel contesto della virulenza batterica fattori che direttamente e indirettamente perturbare i numeri dei neutrofili nel tessuto colpito13,14,15,16.
I topi sono meno suscettibili di meccanismi di evasione di virulenza e immunitario di S. aureus che gli esseri umani. Come tale, topi wild-type non possono essere un modello animale ideale per studiare l'efficacia di un dato terapeutico per il trattamento cronico S. aureus infezione. Topi MyD88-carenti (cioè, MyD88- / - topi), un ceppo di topo immunocompromessi che manca di recettore funzionale interleuchina-1 (IL-1R) e del recettore Toll-like (TLR) segnalazione, Visualizza una maggiore suscettibilità all'infezione di S. aureus rispetto al topi wild-type17 e un danno del neutrofilo traffico a un sito di S. aureus infezione nella pelle18. Sviluppo di un ceppo di topo che possiede un reporter fluorescente del neutrofilo nei topi di MyD88- / - ha fornito un modello alternativo per indagare l'efficacia di terapie per trattare l'infezione di S. aureus rispetto alla corrente del neutrofilo topi reporter.
In questo protocollo, ci caratterizzano lo Staphylococcus aureus infezione nei LysM-EGFP × MyD88- / - topi immunocompromessi e confrontare il decorso e la risoluzione dell'infezione con i topi LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88- / - topi sviluppano un'infezione cronica che non si risolve, e 75% soccombere all'infezione dopo 8 giorni. Un difetto significativo in iniziale reclutamento dei neutrofili si verifica oltre 72 h della fase infiammatoria della infezione, e meno del 50% neutrofili reclutano durante la seconda fase dell'infezione. L'aumentata suscettibilità del × LysM-EGFP MyD88 topi- / - rende questo particolare ceppo un rigoroso modello preclinico per valutare l'efficacia di nuove tecniche terapeutiche targeting per S. aureus infezione rispetto agli attuali modelli che utilizzare topi wild-type, soprattutto tecniche con l'obiettivo di aumentare la risposta immunitaria innata contro l'infezione.
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Protocol
Tutti gli studi del topo sono stati esaminati e approvati dal comitato di uso presso UC Davis e istituzionali Animal Care e sono state eseguite secondo le indicazioni dell'Animal Welfare Act e la legge di estensione di ricerca salute. Assicurarsi di utilizzare guanti sterili quando si lavora con gli animali.
1. mouse fonte e custodia
- Derivare LysM-eGFP topi su una priorità bassa genetica C57BL/6J come descritto in precedenza12. Derivare LysM-EGFP × MyD88- / - topi da incrocio topi LysM-EGFP con MyD88- / - topi su uno sfondo di C57BL/6J.
- Mouse della casa in un vivaio. Per questi studi, gli animali sono stati alloggiati presso l'Università di California, Davis in gruppi prima di chirurgia e unica ospitata dopo chirurgia. Utilizzare topi fra le età di 10-16 settimane.
2. quantificazione e preparazione batterica
- Rimuovere la bioluminescenti ceppo S. aureus di interesse da-80 ° C stoccaggio per scongelare su ghiaccio. Striscia su una piastra di agar sangue bovino del 5%. Incubare la piastra striata in un incubatore a 37 ° C durante la notte (16h).
Nota: In questo protocollo, è stato utilizzato il ceppo di ALC2906 SH1000. Questo ceppo contiene la navetta plasmide pSK236 con il promotore di proteine leganti la penicillina 2 fusi con cassetta di reporter del luxABCDE da Photohabdus luminescens18. - Preparare il brodo di soia triptico (TSB) 0,03 g di polvere TSB millilitri di acqua pura ed autoclave TSB per sterilizzare. Quando raffreddato, aggiungere qualsiasi antibiotici necessari utilizzando una tecnica sterile. In questo protocollo, è necessario aggiungere 10 µ g/mL di cloramfenicolo18 a TSB per selezionare per l'espressione del plasmide navetta pSK236, che contiene la cassetta di luxABCDE di bioluminescenza.
- Raccogliere 3-4 colonie separate dalla piastra di S. aureus in TSB con 10 cloramfenicolo µ g/mL per avviare una coltura durante la notte. Incubare i batteri su un agitatore per incubazione a 37 ° C durante la notte (16h).
- Iniziare una nuova coltura batterica dalla cultura pernottamento diluendo un campione 01:50 in TSB con cloramfenicolo di 10 µ g/mL. Cultura in uno shaker incubando a 200 giri/min e 37 ° C.
- Due ore dopo la scissione lo S. aureus, monitorare la densità ottica a 600 nm (OD600) su uno spettrofotometro. Osservare il OD600 vs tempo per trovare la crescita fase metà-logaritmica. Per il ceppo di ALC2906 SH1000, un OD600 di 0,5 è metà-logaritmico e corrisponde ad una concentrazione di 1 x 108 CFU/mL (Figura 1).
- Quando OD600 è 0,5, lavare i batteri 1:1 con DPBS ghiacciata. Centrifugare i batteri per 10 min a 3.000 x g e a 4 ° C. Con cautela decantare il supernatante e aggiungere ulteriori DPBS refrigerati e vortice accuratamente. Centrifugare nuovamente per 10 min 3.000 x g e a 4 ° C.
- Attentamente e decantare il supernatante. Risospendere il pellet batterico ad una concentrazione desiderata. Per questi studi, raccogliere 3 mL di ALC2906 SH1000 e risospendere in 1,5 mL di PBS, correlando ad una concentrazione di batteri di circa 2 x 108 UFC/mL. Mantenere i batteri sul ghiaccio fino all'utilizzo.
- Per verificare la concentrazione di batteri, diluire 100 µ l del campione batterica 1: 10.000 e 1: 100.000 in PBS. Aliquote di µ l piastra 20 su una piastra di agar. Incubare a 37 ° C in un incubatore per 16 h. Count CFUs da esame lordo e calcolare una concentrazione batterica il giorno seguente.
3. excisional pelle ferire e inoculazione con S. aureus
- Amministrare 100 µ l di cloridrato di buprenorfina 0,03 mg/mL (~0.2 mg/kg) per ogni mouse tramite l'iniezione intraperitoneale.
- Venti minuti dopo l'iniezione, topi posto 2-4 in una camera con l'ossigeno di 2-3 l/min con 2-4% isoflurane. Una volta che topi sono completamente anestetizzati, trasferire i topi uno alla volta per un cono di naso collegato all'ossigeno di 2-3 l/min con 2-4% isoflurane. Verificare topi sono completamente anestetizzati pinzando saldamente ogni zampa posteriore tra il pollice e l'indice. Se l'animale non risponde per il pizzico, procedere al passaggio successivo.
- Radere un 1 pollici da 2 pollici sezione sul retro del mouse con tagliatori elettrici e cancellare l'area di ritagli di pelliccia, utilizzando un panno pulito o una garza. Evitare di usare la crema depilatoria perché può causare l'infiammazione in eccesso.
- Pulire il retro del mouse prima con garza imbevuto con il 10% di iodio di povidone e poi con un 70% di etanolo imbevuto garza. Pulire l'area in un modello a spirale, lo spostamento verso l'esterno dal centro dell'area chirurgica. Attendere circa 1 minuto per l'area chirurgica ad asciugare prima della chirurgia.
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Tenere il rasato indietro il mouse senza stringere tra due dita e premere con fermezza una biopsia del punzone sterile 6 mm al centro dell'area chirurgica preparata. Non tirare la pelle tesa.
- Torcere la biopsia del punzone per creare un contorno circolare sulla pelle che attraversa completamente la pelle in almeno una sezione del contorno. Fare attenzione a non tagliare la fascia o del tessuto sottostante.
- Usare forbici sterili e pinze per tagliare attraverso l'epidermide e derma seguendo il modello circolare improntato dalla biopsia punch.
4. S. aureus inoculazione
- Riempire una siringa da insulina 28 G con l'inoculante batterico bioluminescente desiderata. In questo studio, amministrare una concentrazione di 1 x 108 UFC/mL (50 µ l). Non somministrare più di 100 µ l di volume.
-
Iniettare 50 µ l di inoculante tra la gronda e tessuto nel centro della ferita sul retro del mouse. Garantire che l'inoculante forma una bolla al centro della ferita con perdite minime o dispersione.
- Tirare il derma al lato, tenga la siringa quasi parallelo al tessuto e spingere lentamente la siringa nel tessuto finché non si avverte un'improvvisa diminuzione della resistenza, che indica il piercing della fascia. Attentamente la siringa conducono al centro della ferita ed erogare l'inoculante lentamente. Rimuovere la siringa lentamente dall'animale.
- Iniettare il volume stesso di PBS sterile nelle ferite degli animali non infetti come descritto sopra.
- Restituire l'animale alla sua gabbia. Posizionare la gabbia sotto una lampada di calore o sulla sommità di un rilievo di riscaldamento e monitorare l'animale fino al recupero dall'anestesia.
5. in Vivo BLI e FLI
- Inizializzare l'animale intero imager attraverso software dello strumento. Anestetizzare topi in una camera di ricevere ossigeno di 2-3 l/min con 2-4% isoflurane. Somministrare anestetici per la Musetti anteriori all'interno il dispositivo di imaging.
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Inserire il mouse ferito e infetto il riproduttore d'immagini. Posizionare il mouse in modo che la ferita è più piatta possibile. Utilizzare il seguente set-up di sequenza per i topi di immagine.
- Selezionare per vedere e fotografare come la modalità di imaging. Il tempo di esposizione è 1 min a piccolo binning e F/stop 1 (luminescenza) e F/stop 8 (fotografia). Il filtro di emissione è aperto. Fare clic sul pulsante Acquisisci per registrare l'immagine.
- Selezionare fluorescenza e fotografare come la modalità di imaging. Il tempo di esposizione è 1 s al piccolo binning e F/stop 1 (fluorescenza) e F/stop 8 (fotografia) con una lunghezza d'onda di eccitazione di 465/30 nm e un'emissione lunghezza d'onda 520/20 nm con un'intensità alta lampada. Fare clic sul pulsante Acquisisci per registrare l'immagine.
- Restituire l'animale alla sua gabbia e monitor fino al recupero dall'anestesia.
- Topi immagine ogni giorno come descritto sopra.
6. image Analysis
- Apri immagini da quantificare.
- Collocare una grande area circolare di interesse (ROI) sopra la zona intera ferita tra cui pelle per ogni mouse nell'immagine circostante. La conta dei neutrofili in vivo che fli EGFP segnali e segnali di BLI S. aureus in vivo si estendono oltre il bordo della ferita dopo diversi giorni e sono stati inclusi in questi studi (Figura 2A e 2B). Fare clic su Misura di ROI e documentando i valori per flusso medio per ogni mouse. Tracciare il flusso medio di ogni segnale (p/s) rispetto al tempo.
-
Se il numero assoluto di neutrofili o S. aureus nella ferita è desiderato, eseguire i seguenti esperimenti.
- Per correlare i numeri del neutrofilo ai segnali FLI EGFP in vivo, ferita topi C57BL/6J come descritto sopra e trasferire una gamma dei neutrofili derivate da midollo osseo (5 x 105 a 1 x 107) da LysM-EGFP o LysM-EGFPxMyD88- / - donatori direttamente sulla cima di diverse ferite. Immagine come descritto sopra e correlare l'in vivo FLI EGFP segnali la quantità conosciuta di neutrofili.
- Per correlare lo Staphylococcus aureus CFU per i segnali BLI in vivo, ferita e infettare i topi come descritto sopra. Il 1 ° giorno post-infezioni record in vivo BLI segnali dai topi e immediatamente eutanasia e chill carcasse. Asportare la ferita, omogeneizzare il tessuto e piastra batteriche diluizioni su agar per incubazione overnight. Il giorno successivo, colonie di conteggio per determinare CFU per ferita.
- Per misurare la vestibilità guarigione della ferita un ROI circolare sopra il bordo della ferita e misurare l'area della ferita (cm2) e tracciare il cambiamento frazionario dal basale rispetto al tempo (Figura 2).
7. statistiche
Nota: Tutti i dati sono presentati come media valori. p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi
- Determinare le differenze tra i due gruppi in un solo giorno, utilizzando il metodo di Holm-Sidak, con alfa = 0.05 e analizzare ogni punto di tempo individualmente, senza assumere un coerente SD
- Confrontare le differenze tra più gruppi nello stesso giorno di One-way ANOVA con il post-test di Tukey multiplo-confronti. Sopravvivenza tra gruppi sperimentali è stato analizzato con il metodo di rivestimento per camini-Cox.
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Representative Results
LysM-EGFP × MyD88- / - topi sono più suscettibili di infezione da S. aureus che topi LysM-EGFP
Il ceppo di S. aureus utilizzato in questo studio, ALC290618, è stato costruito con un plasmide contenente il costrutto di lux che produce segnali bioluminescenti da batteri vivi e attivamente metabolizzante. Quando inoculate nei topi, bioluminescenza in vivo (BLI) tecniche di imaging può essere utilizzato per misurare longitudinalmente onere di batteri all'interno di una ferita infetta. Entrambi i LysM-EGFP × MyD88- / - topi e topi LysM-EGFP sono stati feriti e infettati da 1 x 107 CFU di S. aureus nella ferita per confrontare la loro suscettibilità all'infezione da S. aureus . LysM-EGFP × MyD88- / - i topi hanno mostrato una maggiore suscettibilità all'infezione che topi LysM-EGFP dimostrano da 80% letalità di LysM-EGFP × MyD88- / - topi durante i primi 8 giorni di infezione rispetto a 0% letalità dei topi LysM-EGFP durante il 15 giorni tutta la durata dell'esperimento (Figura 3A). Entrambi i ceppi di topi perso ~ 5% del peso corporeo dopo l'infezione, ma topi LysM-EGFP recupero peso originale dal giorno 2, mentre topi di LysM-EGFP × MyD88- / - non hanno recuperato il peso perduto (Figura 3B). La chiusura della ferita in presenza di infezione da S. aureus non era differente fra i due ceppi; Tuttavia, sterilmente feriti LysM-EGFP × MyD88- / - ha avuto un difetto significativo nella guarigione arrotolata rispetto ai topi LysM-EGFP (Figura 3), come precedentemente segnalato19. Animale intero imaging fu utilizzato per misurare la carica batterica al giorno, e già nel giorno 1, LysM-EGFP × MyD88- / - ferite hanno avute un maggiore onere batterico che LysM-EGFP ferite. I topi LysM-EGFP controllato infezione e diminuiscono in vivo BLI segnali nella ferita, mentre LysM-EGFP × MyD88- / - topi hanno esibito un aumento della carica batterica che plateaued il giorno 4 fino alla morte degli animali (Figura 3D,E). Insieme, questi dati dimostrano la suscettibilità aumentata di topi di LysM-EGFP × MyD88- / - per S. aureus infezione rispetto ai topi LysM-EGFP.
Traffico del neutrofilo è alterata in S. aureus infettato LysM-EGFP × MyD88- / - topi confrontati ai topi LysM-EGFP
Il mouse LysM-EGFP produce neutrofili verdi fluorescenti a causa di una proteina EGFP codificato a valle del promotore lisozima M12. Questo mouse è stato utilizzato per lo studio longitudinale in vivo del neutrofilo traffico in risposta a cutaneo S. aureus infezione13,14,20,21,22. Per confrontare la cinetica del neutrofilo per ferite prodotte su LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - mice, una ferita di pelle completo di spessore 6 mm è stata amministrata sul dorsum, e topi erano imaged ogni giorno. × LysM-EGFP MyD88- / - rispetto ai topi LysM-EGFP (Figura 4A, C) è stata osservata una diminuzione del 40% nel traffico del neutrofilo alle ferite. Quando 1 x 107 CFU di S. aureus è stato introdotto subito dopo la ferita, traffico del neutrofilo è stato attenuato in entrambi i ceppi di topi, ma LysM-EGFP × MyD88- / - topi erano più sensibili all'infezione di S. aureus con riguardo al reclutamento dei neutrofili. Infezione causata un 50% riduzione iniziale del neutrofilo traffico LysM-EGFP × MyD88- / - ferite confrontato ad una diminuzione di 15% osservata nelle ferite LysM-EGFP (Figura 4B). Topi LysM-EGFP reclutato anche significativamente più neutrofili alla ferita durante le fasi successive dell'infezione (Figura 4A,C) rispetto al LysM-EGFP × MyD88- / - topi, che erano in grado di aumentare il numero dei neutrofili anche nella presenza di carica batterica sostenuta. Insieme, questi dati dimostrano che i LysM-EGFP × MyD88- / - mouse hanno un difetto nel reclutamento dei neutrofili, che è coerenza con la loro predisposizione aumentata all'infezione di S. aureus .
Figura 1: Correlazione tra OD600 e CFU conta per ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 colonie sono stati selezionati da una piastra di agar e trasferiti nel TSB con 10 cloramfenicolo µ g/mL per la coltura durante la notte. Il giorno successivo, la sospensione è stata divisa 01:50 in TSB con cloramfenicolo di 10 µ g/mL e coltivate. Densità ottica a 600 nm (OD600) è stata misurata a intervalli regolari dopo 2 ore utilizzando uno spettrofotometro. A ogni misurazione i batteri è stato diluito 1: 100 000 in PBS freddo ghiaccio e aliquotati su una piastra di agar per incubazione overnight. CFUs sono stati contati il giorno seguente per calcolare la concentrazione iniziale e correlato a OD600. N = 3 con 4 differenti misure di600 OD ogni esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentante regione di interesse (ROI) per l'analisi dei dati. Per analizzare BLI in vivo e in vivo FLI segnali, grandi, ROIs dimensioni equivalenti sono stati centrati sulla ferita e flusso totale (fotoni al secondo) è stata misurata. Per misurare la chiusura della ferita, un ROI era adatta al bordo della ferita e zona (cm2) è stata misurata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: LysM-EGFP × MyD88- / - topi sono più suscettibili alle infezioni di S. aureus rispetto ai topi LysM-EGFP. LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - topi sono stati amministrati un 6mm ferita sul dorsum e infettato da 1 x 107 CFU di bioluminescenti S. aureus o soluzione fisiologica sterile. Gli animali sono stati controllati giornalmente e sopravvivenza (A) e (B) peso sono stati registrati. Gli animali erano imaged giornalmente per dimensioni della ferita di misura (C) e (D) batterica luminescenza. (E) rappresentante bioluminescenti immagini sono raffigurati da infetto LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - topi. Barra della scala = 3 mm. dati rappresentano 7-16 topi per gruppo per A, C, e D e 3 topi per gruppo per B e sono espressi come valori medi. * p = 0,05, * * p = 0,01, * * *p = 0,001, *p < 0,0001 tra infettati (A, B, < / C18 > e D) o non infetti (C) gruppi. Significatività statistica è stata determinata mediante il test di Mantel-Cox (A) e il metodo di Holm-Sidak (B-D), con alfa = 0,05 e ogni volta punto è stato analizzato singolarmente, senza assumere un coerente SD. per favore clicca qui per vedere una più grande versione di questa figura.
Figura 4: LysM-EGFP × MyD88- / - mouse hanno difettivo reclutamento dei neutrofili a ferite infette.
LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - topi sono stati amministrati un 6mm ferita sul dorsum e infettato da 1 x 107 CFU di bioluminescenti S. aureus o soluzione fisiologica sterile. Gli animali erano imaged giornalmente per misurare il contenuto del neutrofilo (A, B). (C) immagini fluorescenti rappresentative sono raffigurati da infetti e non infetti LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - topi. Barra della scala = 5 mm. dati rappresentano 8-16 topi per gruppo e sono espressi come valori medi. * p < 0,05, * * p < 0.01, e * * * p < 0,001 tra infettati gruppi e n. p < 0.01 tra non infetti gruppi (A) o come raffigurato nel grafico (B). Significatività statistica è stata determinata utilizzando il metodo di Holm-Sidak (A), con alfa = 0,05 e ogni volta punto è stato analizzato singolarmente, senza assumere un SD coerente e One-way ANOVA (B), con i multiplo-confronti di Tukey post-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Modelli di infezione di S. aureus che utilizzano bioluminescenti S. aureus infezione in un mouse fluorescente del neutrofilo reporter in combinazione con tecniche avanzate di animale intero in vivo imaging ottico hanno avanzato la nostra conoscenza dell'innata risposta immunitaria all'infezione. Utilizzando il mouse LysM-EGFP gli studi precedenti hanno indicato che fino a 1 x 107 neutrofili recluta per una ferita infetta di S. aureus sopra le prime 24 ore dell'infezione14e ferita-reclutato neutrofili estendono loro emivita da 1,5 giorni a 5 giorni in risposta a un S. aureus-infettati ferita22. Una tattica di sopravvivenza adattata da topi per combattere le infezioni è il traffico di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici (HSPC) per una ferita infetta dal midollo osseo dove si espandono in neutrofili in un TLR2/MyD88/PGE2 battericidi-EGFP+ modo dipendente21. Inoltre, extramedullary granulopoiesis fornisce una fonte essenziale di neutrofili per salvare S. aureus infettati MyD88- / - mice da sepsi letale13. Trasferimento adottivo di HSPC dai topi LysM-EGFP in topi wild type permette di esaminare il processo di produzione del neutrofilo locale e la sua importanza nella lotta contro lo Staphylococcus aureus all'interno di una ferita13,21. È anche possibile calibrare con precisione il numero dei neutrofili nella ferita; numero dei neutrofili in ferite correla linearmente con segnale EGFP da 1 x 106 a maggiore di 1 x 107 neutrofili, e il limite di rilevazione è circa 1 x 106 neutrofili in una ferita di 6 mm14.
Nei nostri risultati rappresentativi confrontiamo longitudinale del neutrofilo e cinetica di S. aureus nelle ferite del LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / -. A nostra conoscenza, questo è il primo studio che confronta la carica batterica e neutrofilo traffico tra wild type e topi immunocompromessi longitudinalmente attraverso la risoluzione dell'infezione. Di particolare interesse è il grado di attenuazione di reclutamento dei neutrofili causata tramite l'infezione di S. aureus nel ceppo MyD88- / - , che ha suscitato una diminuzione di 15% nel traffico del neutrofilo in topi wild type confrontati ad una diminuzione del 50% in MyD88-/ -. S. aureus è in grado di eludere la risposta immunitaria dell'ospite producendo un numero di fattori di virulenza che inibiscono indirettamente traffico del neutrofilo (cioè, α-tossina, leucocidina di Panton-Valentine e chemiotassi proteina inibitoria23 , 24), e i nostri risultati indicano che la segnalazione MyD88, probabilmente attraverso IL-1R, TLR2 e TLR4 è fondamentale per superare le strategie impiegate da S. aureus di eludere la risposta immune dell'ospite. Fattore di virulenza-knockout S. aureus ceppi possono essere utilizzati in questo modello per caratterizzare il loro effetto sul traffico delle cellule mieloidi13. Inoltre, quando studiato in combinazione con il LysM-EGFP × MyD88- / - mouse, questo modello evidenzia il ruolo di MyD88 segnalazione nel combattere gli effetti patogeni di fattori di virulenza.
Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che se eseguita in modo non corretto può introdurre una certa variabilità in studi. Le procedure di ferimento e di infezione sono semplici rispetto ad altri modelli di malattia del mouse, ma non è senza la sua complessità. Biopsie di pelle sono molto taglienti e possono facilmente tagliati nel muscolo spinotrapezius sotto la pelle. Danneggiare questo muscolo e la sua fascia altera il reclutamento dei neutrofili e aumenta la variabilità tra topi e un risultati in un'infezione più invasiva di S. aureus che non è centrata all'interno della ferita. Topi con danni significativi al muscolo spinotrapezius dovrebbero essere esclusi dagli studi.
Un'altra fonte di errore in questo modello viene da cambiamenti nella bioluminescenti ceppo S. aureus nel corso del tempo, che può alterare in vivo BLI segnali e cinetica di crescita. Il ceppo ALC2906 contiene un plasmide di navetta contenente l'operone modificate lux da Photorhabdus luminescens costrutto che è necessaria per produrre i segnali bioluminescenti, che possono essere scartati dal batterio Staphylococcus aureus nel corso del tempo25. In un brodo di coltura senza selezione, il 97% delle colonie SH1000 prodotto bioluminescenti segnali il giorno 3. Questa frequenza è sceso al 53% il giorno 5 e 21% il giorno 1026. Così, a intervalli di tempo più tardi durante il decorso, i segnali BLI in vivo probabilmente comincerà a leggermente (< differenza 1 log) sottovalutare l'onere effettivo in vivo batterica. È importante bloccare giù scorte fresche glicerolo di S. aureus con selezione antibiotica per mantenere il plasmide all'arrivo e sostituire frequentemente lavoro scorte di batteri (cioè, ogni tre mesi) può aiutare a prevenire la perdita della costrutto bioluminescente durante la manutenzione di cultura. Più recenti sforzi di bioluminescenti S. aureus contengono un costrutto bioluminescenti stabilmente integrato27,28 e sono probabilmente un miglioramento sopra il ceppo di ALC2906 utilizzato in questo modello.
Mentre questo modello è utile per studiare cutanea localizzata S. aureus infezioni, ha dei limiti. I segnali BLI in vivo della carica batterica è limitato per la ferita e la pelle adiacente. Il modello non fornisce una lettura affidabile per infezioni profonde invasive quali sepsi, e gli animali devono essere euthanized per misurare la diffusione di batteri al flusso sanguigno o reni13. Più recenti e più luminoso ingegnerizzati bioluminescenti ceppi sono stati generati che può consentire la rilevazione di segnali BLI in vivo da organi interni27,28. Inoltre, la rilevazione longitudinale e monitoraggio del traffico del neutrofilo non può essere misurati in altri comunemente acquisito infezioni da Staphylococcus aureus , compreso respiratorio e infezioni del sangue. Ridotta sensibilità a causa del tessuto autofluorescenza è anche una limitazione di questo modello. Utilizza il mouse di Catchup sviluppato di recente una RFP TdTomato sotto il promotore di Ly6G e può avere un più alto rapporto segnale-rumore del mouse LysM-EGFP dovuto ridotto tessuto auto in fluorescenza la RFP canale11.
Il potenziale crosstalk tra segnali di emissione BLI e FLI in vivo in questo modello è degno di discussione ma è trascurabile. Se noi eseguire esperimenti senza luce di eccitazione e solo raccogliere segnali di FLI EGFP in vivo usando il filtro 520/20, non osservare eventuali segnali apprezzabili da topi infetti, dimostrando che i segnali raccolti sono da in vivo FLI EGFP segnali e non da sovrapposizione di segnali BLI in vivo dei batteri (dati non mostrati). Ciò è principalmente dovuto il tempo di raccolta del segnale, che è solo 1 secondo per FLI in vivo e 1 minuto per BLI in vivo e un filtro di lunghezza d'onda di eccitazione specifico di 465/30 nm ed emissione filtro di 520/20 nm. Queste impostazioni consentono per rilevazione ottimale di in vivo FLI EGFP segnali senza contributo da in vivo BLI segnali. Questo è meglio dimostrato quando si confrontano l'ordine di grandezza dell'asse y tra Figura 3D e Figura 4A. I segnali dalla BLI in vivo è circa 100 volte meno che i segnali di FLI di EGFP in vivo, che indica che i segnali BLI in vivo sono trascurabili e contribuiscono a meno dell'1% dei segnali osservati da FLI in vivo.
Ci aspettiamo che le applicazioni future di questo modello aiuterà i ricercatori scoprire e caratterizzare i fattori di virulenza di S. aureus e servire come modello animale pre-clinico per testare nuove terapie che mirano a eliminare S. aureus infezione, stimolando la risposta immunitaria innata.
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Disclosures
Lloyd S. Miller ha ricevuto sovvenzioni dalla MedImmune, Pfizer, Regeneron e Chan Soon-Shiong Nanthealth Foundation e consulenza tasse da Noveome Biotherapeutics e la Fondazione di Nanthealth Chan Soon-Shiong che non sono correlati al lavoro segnalato in questa carta. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da nazionale istituti di salute sovvenzioni R01 AI129302 (al s.i.s.) e il programma di formazione in farmacologia: da banco al capezzale presso UC Davis (NIH T32 GM099608 a Silvana). Il molecolare e Imaging Genomic (CMGI) presso la University of California Davis fornito eccellente supporto tecnologico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
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