Summary
광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.
Abstract
종양 spheroids 암 연구 및 항 암 신약의 3 차원 (3D) 세포 문화 모델 개발 되었습니다. 그러나, 현재, 높은 처리량 modalities 이미징 밝은 필드 또는 형광 탐지를 활용 하 여 수 없습니다 제한 된 빛이 침투, 형광 염료의 확산으로 인해 종양 회전 타원 체의 전반적인 3D 구조를 해결 하 고 깊이-resolvability. 최근, 우리 실험실 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 레이블 및 비 파괴적인 3D 96 잘 접시에 다세포 종양 spheroids의 경도 특성 분석을 수행 하려면 양식 적임 이미징의 사용을 시연 했다. 10 월은 높이 약 600 µ m까지 성장 하는 종양 spheroids의 3D 형태학 상과 생리 적인 정보를 얻는 능력. 이 문서에서는, 높은 처리량 (HT-10 월) 10 월 이미징 시스템을 전체 다 잘 판 검사 및 종양 spheroids의 3D 10 월 데이터를 자동으로 가져옵니다 설명 합니다. 프로토콜에 HT-10 월 시스템 및 건설 지침의 세부 사항을 설명합니다. 3D 10 월 데이터에서 하나 3d 렌더링은 회전 타원 체의 전체 구조를 시각화할 수 및 직교 분할 영역 크기와 볼륨의 형태학 정보에 따라 종양 회전 타원 체의 경도 성장 곡선을 특성화 고의 성장 모니터링 광학 내장 감쇄 대비에 따라 종양 회전 타원 체에 죽은 셀 영역입니다. 우리는 약물 검사로 biofabricated 샘플을 특성화에 대 한 HT-10 월에는 높은 처리량 이미징 형식으로 사용할 수 있습니다 보여줍니다.
Introduction
암은 세계1죽음의 두 번째 주요 원인. 암을 대상으로 하는 약물을 개발 하는 것은 환자에 대 한 중요 한 중요성 의입니다. 그러나, 그것은 새로운 항 암 약의 90% 이상 효능과 임상 실험2에서 예기치 않은 독성의 부족 때문에 개발 단계에서 실패 추정. 이유의 일부는 약 발견2 의 다음 단계에 대 한 복합 효능 및 독성의 예측 값이 제한 된 결과 제공 하는 복합 심사에 대 한 간단한 2 차원 (2D) 세포 문화 모델의 사용에 표시 될 수 있습니다. , 3 , 4. 최근 3 차원 (3D) 종양 회전 타원 체 모델 항 암 약물 발견3,,45 에 대 한 임상 관련 생리 및 약리 데이터를 제공 하도록 개발 되었습니다 6,7,,89,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,,2122,23, 24,25. 때문에 이러한 spheroids 종양에서 vivo에서의 조직-특정 속성을 흉내낼 수 있다, 영양소와 산소 등 약물 저항19를 이러한 모델의 사용 뿐만 아니라 그라데이션, hypoxic 코어 수 잠재적으로 단축 약물 발견 타임 라인, 투자 비용을 절감 하 고 보다 효과적으로 환자에 게 신약을가지고. 중요 한 방법 중 하나 3D 종양 회전 타원 체 개발에 복합 효능 평가 모니터링 회전 타원 체 성장과 재발 치료9,26에서 것입니다. 이렇게 종양 형태, 그것의 직경 및 고해상도 이미징 형식으로 볼륨의 양적 characterizations 필수적입니다.
밝은 분야, 위상 대비7,9,,2224, 형광 현미경 검사 법8,,916, 등 기존의 이미징 형식 18,22 회전 타원 체의 직경의 측정을 제공할 수 있지만 3 차원 공간에서 회전 타원 체의 전체 구조를 확인할 수 없습니다. 회전 타원 체; 프로브 빛의 침투를 포함 하 여 이러한 제한에 기여 하는 많은 요인 회전 타원 체;에 형광 염료의 확산 내부 또는 강한 흡수 및 산란; 회전 타원 체의 반대 표면에 흥분된 형광 염료에서 발광 형광 신호 그리고 이러한 깊이 resolvability 이미징 형식. 이 종종 부정확 한 볼륨 측정 리드. Spheroids에서 괴 사 성 코어의 개발 vivo에서 종양6,10,15,,1925괴 사를 모방합니다. 이 병 적인 특징은 2D 셀 문화19,25,,2728에서 가능성이. 500 µ m 직경, 3 층 동심 구조 보다는 더 큰 회전 타원 체 크기와 증식 세포의 외부 층, 무부하 셀, 중간 계층 및 회 저 성 코어를 포함 하 여 관찰 될 수 있다 회전 타원 체6,10 ,15,,1925, 산소와 영양분의 부족으로 인해. 라이브 및 죽은 세포 형광 이미징 괴 코어의 경계를 접근 하는 표준 방식입니다. 그러나, 다시,이 형광 염료와 가시광선의 침투의 실제 형태로 개발 모니터링 하 괴 코어로 검색을 방해.
대체 3D 적임 이미징, 종양 spheroids 하 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 도입 되었습니다. 10 월은 수 있는 레이블 무료, 비-파괴적인 3D 데이터에서 최대 바이오 메디컬 이미징 기술 1-2 mm 깊이 생물 조직29,30,31,,3233 34. 10 월 샘플의 다른 깊이에서 다시 흩어져 신호 낮은 일관성 간섭계를 사용 하 여 고 가로 세로 방향에서 마이크론 수준의 공간 해상도에서 재건된 깊이 해결 이미지를 제공 합니다. 10 월 안과35,,3637 그리고 제품은38,39에 널리 채택 되었습니다. 이전 연구는 관찰 하 생체 외에서 의 형태 (예를 들어, Matrigel) 지하실 멤브레인 매트릭스에 종양 spheroids 고 photodynamic 치료40,41에 대 한 그들의 응답을 평가 10 월을 사용 했습니다. 최근, 우리의 그룹 체계적으로 모니터링 하 고 다 잘 플레이트42에 3D 종양 spheroids의 성장 활동을 계량 높은 처리량 10 월 영상 플랫폼을 설립. 접근 및 레이블 없는 괴 사 성 조직 감지 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 복을 사용 하 여 3D 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다. 이 종이 어떻게 OCT 영상 플랫폼 건설 되었고 종양 spheroids의 고해상도 3D 이미지를 고용의 세부 사항을 설명 합니다. 회전 타원 체 직경 및 볼륨의 정확한 측정을 포함 하 여 3 차원 종양 spheroids의 성장 활동의 단계별 정량 분석은 기술 된다. 또한, 내장 광 감쇠 대비에 따라 OCT를 사용 하 여 괴 사 성 조직 영역의 비파괴 탐지의 방법은 제공 됩니다.
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Protocol
1입니다. 셀의 준비
- 자격 갖춘된 공급 업체에서 셀 라인을 얻을.
참고: 셀의 셀 라인에서 문화 미디어 또는 기판 (Matrigel 같은 지하실 막 매트릭스)의 도움으로 회전 타원 체를 형성할 수 있다 확인 하십시오. 9 문학 또는 검사에 대 한 사전 실험의 한 라운드를 수행. - 셀 라인 공급 업체에서 제공 하는 특정 절차에 따라 냉동된 셀 동 일반 절차 다른43을찾을 수 있습니다.
- 25 cm2 문화 플라스 크에 1-2 구절에 대 한 셀을 문화. 셀 3D 세포 배양에 사용할 수 있습니다.
- 매일 세포의 건강 상태를 모니터링 하 고 표준 조건 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도)에서 인큐베이터에 그들을 유지 하는 것. 필요에 따라 미디어를 새로 고칩니다.
주: DMEM (4.5 g/L 포도 당), 1% 항생제-antimycotic, 10% 태아 둔감 한 혈 청의 문화 매체 구성 됩니다. Subculture 셀 문화 플라스 크에서 합류를 도달 하기 전에. 공급 업체에서 제공 하는 셀 문화 지침을 따릅니다. 일반 절차 elsehwhere44찾을 수 있습니다. - 다음과 같은 일반 프로토콜9에 따라 멀티 잘 접시에 3D 세포 배양을 수행 합니다.
- 문화 미디어 문화 플라스 크에서 제거 하 고 버퍼링 멸 균된 인산 염 (PBS, 37 ° C에가 열)와 그것을 씻어.
- 3 분에 대 한 플라스 크에 트립 신 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, 0.5%)의 1 mL을 추가 하 여 셀을 resuspend. 그런 다음, 문화 미디어는 트립 신을 희석 하기 위해 추가.
- 15 mL 원심 분리기 튜브 및 500 x g 및 실 온에서 5 분 동안 원심 분리기에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
- 상쾌한을 제거 하 고 미리 데워 진된 문화 매체의 4 mL와 셀 resuspend. 샘플 hemocytometer 셀 셀 농도 결정 하기 위해 계산 대에 한 방울 플라스틱 (예를 들어, 3000 셀/mL) 시드를 위한 적절 한 농도에 세포를 희석.
참고: 다중 잘 플레이트 (96-글쎄, 384-잘 또는 1536-잘)의 각 유형과 각 셀 라인에 대 한 회전 타원 체의 초기 세포 농도 최적화 합니다. - 매우 낮은 첨부 (울 라) 라운드 바닥 다 잘 판에 씨앗 셀. 추가 셀 서 스 펜 션의 200 µ L에 3000 셀/mL의 농도에서 각각 잘 잘 마다 약 600 세포.
- RT에서 7 분, x g 350의 속도 또는 사용할 수 있는 최저 속도에서 시드 후 바로 접시 어댑터를 사용 하 여 전체 격판덮개 원심.
참고: 원심 분리기는 단일, 균일 한 회전 타원 체 형성을 촉진 하는 잘의 중심에 세포를 수집 도움이 됩니다. 원심 분리기 단계 종양 spheroids를 처음 한 번만 수행 됩니다. 그것은 종양 spheroids 성장을 시작 하는 때 반복 하지 것 이다. - 문화 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 멀티 잘 플레이트를 유지 하 고 매 3 일 문화 미디어를 새로 고칩니다.
참고: 다른 3D 문화 조건에 대 한 성장 시간이 달라질 수 있습니다. 우리의 연구에서 3000 셀/mL 사용 됩니다 U-87 MG와 HCT 116 셀 라인을 모두 96 잘 접시에는 회전 타원 체 HCT 116 셀 4\u20127 일에서 ~ 500 μ m를 성장할 수 있도록. 일반 미디어 보충 및 성장 요인 다른 회전 타원 체 모델 기반 3D 문화 프로토콜을 추가 하십시오. - 그들의 성장의 종 적 연구에 대 한 모든 3\u20124 일 종양 spheroids의 10 월 이미지를 수행 합니다.
참고: 10 월 영상에 대 한 권장된 시간 포인트 4 일, 7 일, 하루 11, 하루 14, 하루 18 및 한 일 것입니다.
2. 높은 처리량 10 월 플랫폼 이미징
참고: 참조를 참조 하십시오 작업29,30,31,32,33,34 원리의 철저 한 검토 및 10 월의 응용 프로그램에 대 한. 참조 그림 1 과 황 외. 이미징 시스템이이 연구에 사용 된 사용자 지정의 자세한 42 .
- 종양 회전 타원 체 이미징 OCT 시스템에 대 한 적절 한 광대역 라이트 소스를 선택 합니다.
참고: 여기, superluminescent 다이오드 (SLD, 그림 1A,B) ~ 1,320의 중앙 파장으로 nm와 ~ 110 nm 대역폭 광대역 광원으로 사용 되었다. - 참고 팔과 회로도 ( 그림 1A를 자세한 내용은B 참조) 다음 OCT 시스템의 샘플 팔을 생성 합니다. OCT 시스템을 건설 하기 위하여 광학 부품의 목록에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 확인 된 참조 팔과 샘플 팔의 광학 경로 길이 밀접 하 게 일치 합니다.
- 분석기, 10 월의 분석기 디자인의 세부 사항 또는 선택 하 여 일치 하는 상업 분석기는 겨냥 틀, 격자는, F-θ 렌즈 및 라인 스캔 카메라 (참조 그림 1 c 설치34)를 포함 하 여 구성 된 광원의 중심 파장 분석기 전체 레이저 대역폭, 간섭 패턴의 느린 워시 아웃을 제공 하 고 높은 광자 수집 효율을 커버에 올바르게 정렬 됩니다 있는지 확인 합니다.
- 샘플 팔 힘, 총 깊이, 깊이 종속 감도, 축 해상도, 초점, 측면 해상도의 깊이 이미징 등 다음과 같은 통계를 포함 하 여 OCT 시스템의 성능 특징. 깊이 종속 감도, 축 해상도 및 초점의 깊이 측정 하기 위해 견본으로 약한 반사 (예를 들어, 중립 밀도 필터 거울)를 배치 합니다. 장소는 USAF 해상도 측면 해상도 확인 하려면 샘플으로 테스트 차트 대상.
참고: 참조34,45 10 월 성능 및 이러한 통계45하 프로토콜의 통계의 정의 대 한 참조 합니다. 우리의 연구에 사용 된 사용자 정의 10 월 시스템에 대 한 측정 된 매개 변수 목록은 표 1 을 참조 하십시오. - 다른 우물 (참조 그림 1B)에 이미지 종양 spheroids에 다 잘 플레이트의 수평 이동을 제공을 자동화 한 번역 단계를 선택 합니다. 다 잘 판 모든 우물의 전체 스캔 되도록 여행 범위 108 m m x 72 m m 보다 큰 무대를 사용 합니다. 소프트웨어 제어는 2D 또는 3D 자동화 한 번역 단계를 사용 하 여 각의 정확한 위치 및 높은 처리량 이미징 OCT 시스템의 자동화를 가능 하 게.
- 플레이트 어댑터를 사용 하거나 디자인 접시 홀더 (3D 인쇄) 고정된 위치에 다 잘 접시를.
- 다른 우물에서 초점 비행기의 변화를 최소화 하기 위해 모든 10 월 이미징 수행 하기 전에 기울이기 및 기울이기 무대와 회전 무대 (참조 그림 1 D), 변환 단계에 장착 된 2D를 사용 하 여 멀티 잘 플레이트의 회전을 수정 합니다. OCT 이미지 (그림 1A)에서 그들의 상대 위치를 모니터링 하는 경우 D2, D11, B6, D6, G6 지도 우물으로 사용 합니다.
- 우물 OCT 이미지 (그림 1E)에서 동일한 수평 위치에 유지 되도록 접시의 가장자리 단계 움직임의 방향으로 병렬 있도록 접시의 회전을 조정 합니다. 우물 이미지 (그림 1 층) 10 월에 대 한 동일한 수직 위치에 유지 되도록 광학 테이블에 평행 하 격판덮개의 기울기를 조정 합니다.
참고: 조정 틸팅 각도 초점의 모든 우물의 OCT 이미지 품질을 최적화 도움이 됩니다. 그러나, 다른 스에서 문화 미디어의 높이 회전 타원 체 이미지의 defocusing으로 이어질 수 있는 광학 경로 변경 될 수 있습니다. 자동 초점 10 월 최적화 된 이미지 품질을 달성 하기 위해 이미징의 초점 비행기 제어를 구현할 수 있습니다. 조정 단계는 다음과 같은 문제로 인해 종양 회전 타원 체의 10 월 이미지 품질을 해결 되지 않으면: 회전 타원 체 감싸지 초기 시드 위치; biofabricated 세포 외 매트릭스;에 포함 된 경우 회전 타원 체 상승 불 쌍 한 접시 잘 바닥의 높이의 큰 변형을 품질. 이미징 시스템의 성능을 최적화 하기 위해 자동 초점 또는 자기 정렬 기능 추가 소프트웨어 제어를 구현할 수 있습니다. - 사용자 지정 컴퓨터 프로그램을 사용 하 여 OCT 이미지 획득 및 각 잘 순차적으로 데이터를 수집 하려면 단계 운동 제어.
3. 10 월 검사 및 종양 Spheroids의 처리
- 종양 spheroids의 10 월 이미징의 날, 인큐베이터에서 다 잘 접시를 가져가 라. 이미징 시스템 OCT에서 다 잘 접시를 전송 합니다. 플레이트 어댑터 위에 놓습니다.
참고: 종양 spheroids의 10 월 영상 폴리스 티 렌 접시 뚜껑 또는 해제와 함께 수행할 수 있습니다. 그러나, 우물에서 증발 때문에 뚜껑에 물 condensations는 광선 전송에 영향을 미칠 하 고 덜 최적의 10 월 이미지는 spheroids에서 저조한 빛 경로 왜곡 수 있습니다. - 번역 단계의 z 방향을 따라 이동 하 여 접시의 높이 조정 합니다. ~ 100-200 초점 평면 위치 유지 depth-wise 비 균등의 효과 최소화 하기 위해, 각 회전 타원 체의 위쪽 표면 아래 μ m 초점 프로 파일.
- 그것의 개발 단계에 따라 전체 종양 회전 타원 체를 사용자 정의 소프트웨어에서 적절 한 10 월 스캔 범위 (예를 들어, 1 m m x 1 m m)를 설정 합니다. 저장 매개 변수 는 설정을 저장을 클릭 합니다.
- 사용자 정의 소프트웨어를 사용 하 여 spheroids를 포함 하는 접시의 모든 우물을 위한 종양 spheroids 하나 하나의 3D OCT 이미지. 미리 보기 이미지를 볼을 OCT 이미지 획득을 취득 버튼 클릭 미리 보기 버튼을 클릭 합니다.
주: 무대를 동작 하지 않을 때 10 월 회전 타원 체 데이터 수집 됩니다 확인 하십시오. 회전 타원 체는 일반적으로 U-하단 중앙에 잘 있습니다. 그러나,는 회전 타원 체 무대 가속 또는 감속 문화 미디어에서 회전 타원 체의 관성으로 인해 문화 미디어에 이동 될 수 있습니다. - 10 월 구조 이미지 사용자 지정 c + + 처리 코드를 생성 하는 종양 spheroids의 3D 10 월 데이터 프로세스 집합. 10 월 데이터의 후 처리의 순서도 그림 2A 를 참조 하십시오.
참고: 생성 된 3D 10 월 구조 이미지 그림 4A 참조.- Drexler와 후 지 모토34 및 지 그 외 의 장 5 참조 46 10 월 데이터의 후 처리 단계에 대 한 세부 설명 모든 3 개 차원에서 픽셀 크기를 보정. 다시 수정된 비늘에 OCT 구조 이미지를 확장.
참고: 10 월 이미지의 축 방향 (z-방향) 거리 참조 팔과 샘플 팔의 광학 경로 차이의 측정 이다. 따라서, 샘플 (n)의 굴절률 리 스케일링에 대 한 축 방향으로 픽셀 크기를 보정 하는 때 고려 될 필요가 있다. 우리의 연구에 사용 하는 n = 1.37 종양 회전 타원 체42의 굴절률.
- Drexler와 후 지 모토34 및 지 그 외 의 장 5 참조 46 10 월 데이터의 후 처리 단계에 대 한 세부 설명 모든 3 개 차원에서 픽셀 크기를 보정. 다시 수정된 비늘에 OCT 구조 이미지를 확장.
- 회전 타원 체의 중심에 걸쳐 3 개의 횡단면 XY, XZ, YZ 평면에 있는 2D OCT 이미지를 사용 하 여 회전 타원 체 이미지의 콜라주를 생성 합니다. 그림 3C-전자 회전 타원 체 이미지의 합성의 대표적인 출력에 대 한 참조. 사용 하 여 MATLAB 함수 dftregistration47, 모든 회전 타원 체의 중심은 약 같은 위치에 있는 모든 spheroids에 대 한 이미지 등록을 수행 합니다.
- 상업 또는 사용자 정의 소프트웨어를 사용 하 여 회전 타원 체의 3 차원 렌더링을 얻을.
참고: 다음 단계는 상용 소프트웨어를 사용 하 여 종양 spheroids의 3D 렌더링을 얻을 하는 방법을 보여 줍니다.- 소프트웨어에 3D 10 월 데이터를 로드 합니다.
- Surpass 패널을 클릭 합니다. 그런 다음 추가 새 볼륨을 클릭 합니다. 3D 렌더링에 사용할 혼합 모드를 선택 합니다.
- 마우스 포인터를 사용 하 여 이미지를 드래그 하 여 각도 조정 합니다.
4. 형태학 정량화 3D 종양 Spheroids의
참고: MATLAB에서 사용자 지정 코드가 작성된이 정량화를 처리합니다. 과정을 시작 하려면 실행 단추를 클릭 합니다. Spheroids의 형태학 정량화의 단계의 순서도 그림 2B 를 참조 하십시오.
- 회전 타원 체 직경, 높이 및 지름 기반 볼륨 계량.
- 세 개의 횡단면 XY, XZ, YZ 평면 교차는 회전 타원 체의 중심에서에서 2D 10 월 이미지를 선택 합니다.
- 각각 직경 및 XY, XZ 평면에서 회전 타원 체의 높이 측정 합니다.
- 회전 타원 체 직경 기반 볼륨을 사용 하 여 계산:
, 종양의 구형 모양의 추정 된.
- 회전 타원 체 복 기반 볼륨 계량.
- 얼룩을 제거 하려면 회전 타원 체의 10 월 구조 데이터에 3D 평균 필터를 적용 합니다.
- 캐니에 지 검출48 필터, 프레임별으로를 사용 하 여 잘 아래에서 종양 회전 타원 체 지역 분리 적절 한 임계값을 갖는 종양 spheroids 세그먼트.
- 3 차원 데이터에 대 한 연결 복 그룹 (기본 제공 함수 참조: bwconncomp).
- 그룹에서 연결 복 각 및 각 그룹에 대 한 (수동으로 선택), 회전 타원 체 중심 사이의 평균 거리를 계산 합니다. 최소 평균 거리와 회전 타원 체 지역 그룹으로 식별 합니다.
- 복 지역 내에서 회전 타원 체의 수를 계산 하 고은 회전 타원 체의 총 볼륨 저조한 개별 복 (볼륨/복)의 실제 볼륨에 의해 증식.
, 종양의 구형 모양의 추정 된.5. 죽은 셀 지역 3D 종양 Spheroids의 검출
참고: 균질 매체, 10 월 다시 흩어져 강도 (I(z)) 깊이의 기능으로 검색 기술 될 수 있다 맥주 Lambert 법률49여: 
z 깊이 나타냅니다 어디, μ 는 광 감쇠 계수, 그리고 나0 샘플을 사고 강도 이다. 따라서 파생된 광 감쇠 계수는으로 표현 될 수 있습니다: 
. 10 월 이미지는 종종 눈금에 표시 됩니다, 이후 10 월 강도 프로필의 기울기 파생 광 감쇠 계수를 검색할 수 있습니다. 그림 2C 광 감쇠 맵 생성의 순서도 참조 하십시오.
- 회전 타원 체 밖에 서 원하지 않는 영역을 제거 하는 분할을 수행 합니다. 10 월 이미지에서를 얼룩 잡음을 억제 하기 위해 3 차원 평균 필터를 수행 합니다.
- Pixel-wise 얻을 광 감쇠 계수 선형에 의해 로그 스케일 10 월 강도 프로필 특정 깊이 범위 (이동 창), 슬로프, 추출 및-1을 곱하면 기울기/2.
참고: 세그먼트 회전 타원 체 지역 내 각 복에 감쇠 계수는 계산 10 복 깊이 창 깊이 (~ 40 μ m)에서 10 월 강도 프로필의 기울기에 따라 윈도우 중앙에 위치한 복으로. - (5.1 및 5.2 단계) 위의 방법 프레임에 각 축 검사 및 세그먼트 회전 타원 체의 모든 복에 대 한 광 감쇠 계수는 계산 될 때까지 세그먼트 회전 타원 체 지구를 포함 하는 3D 데이터 집합의 각 프레임에 적용 됩니다.
- 감쇠 영역을 강조 표시 하는 이진 임계 처리를 수행 합니다.
참고: 황 외. 히스토그램 분석을 사용 하 여 감쇠의 임계값의 결정에 대 한 42 . - (혼합) 죽은 셀 영역을 원본 이미지에 binarized의 광 감쇠 지도 강조 표시 합니다. 죽은 세포의 3 차원 분포를 시각화 하는 혼합된 감쇠 지도의 3D 렌더링 이미지를 생성 합니다.
6. 조직학 및 Immunohistochemistry
참고: 조직학 및 immunohistochemistry (IHC) 종양 spheroids의 이미지 스테인드 해당 10 월 결과와 상관 관계를 가져옵니다.
- 선택한 시간 지점에서 조직학 및 IHC 얼룩에 대 한 다중 잘 플레이트에서 1-2 종양 spheroids를 선택 합니다. 1 mL 피 펫 팁을 피 펫을 사용 하 여 우물에서 1.5 mL 원심 분리기 튜브는 회전 타원 체를 전송.
참고: 1 mL 피 펫 팁 팁의 오프닝은 회전 타원 체의 구조를 손상 되지 않도록 종양 회전 타원 체의 크기 보다 큰 되도록 전송 하기 전에 잘라. - 각 종양 회전 타원 체 10% 포름알데히드 및 48 h에 대 한 수정으로 가득 단일 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 수집 합니다.
- 기술을 포함 하는 표준 파라핀을 사용 하 여, 각 회전 타원 체에 대 한 조직학 및 IHC 프로세스를 수행 합니다.
참고: 얼룩 5 μ m 두께의 섹션 hematoxylin과 오신 (H & E) 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉 끝 (TUNEL) apoptosis 감지 라벨 종양 spheroids입니다. 되며의 counterstaining TUNEL에 적용 됩니다. 디지털 슬라이드 스캐너 스테인드 샘플을 검사 하 고 고해상도 얻을 하는 데 사용 되었다 조직학 그리고 IHC 이미지.
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Representative Results
96 잘 접시에 Spheroids의 높은 처리량 광학 일관성 단층 촬영 화상 진 찰
그림 3 HT-10 월 3 일에 HCT 116 종양 spheroids 96 잘 접시의 검사의 결과 전시 한다. 전체 접시의 순차 스캔 오른쪽 아래 우물 (H12)에서 시작합니다. 그림 3B HT-10 월 시스템의 소프트웨어 구현에 대 한 흐름 차트가 표시 됩니다. 기다려야 다음 음, ~ 2 접시 이동 후 한 회전 타원 체 데이터 수집 하 고 처리 했다, 휴식, 다음 회전 타원 체 데이터를 수집 하는 회전 타원 체를 허용 하는 s. 각 10 월 데이터 1024 복, 2.3 m m3x 0.84 x 1.0의 실제 볼륨에 대응 x 400 x 400으로 구성 됩니다. 그림 3C en 얼굴 의 합성 처리 된 데이터에서 생성 된 HCT 116 spheroids의 10 월 이미지를 보여줍니다. 결과 다른 2D 높은 처리량 이미징 시스템22에서 이미지와 비교. OCT의 3D 이미징 기능을 감안할 때, 96 우물 (그림 3D) 회전 타원 체 높이 모니터링 및 수직 방향으로 회전 타원 체 이질성을 시각화에서 2D 횡단면 회전 타원 체 이미지의 콜라주를 또한 생성할 수 있었다 우리. 회전 타원 체 3D 렌더링 이미지의 합성은 또한 가능 모든 미리 정의 된 각도 (그림 3E)에서 전반적인 3D 형태를 시각화 하 고는 회전 타원 체의 둥근 정도 평가 합니다. Note 전체 10 월 이미징 및 프로세스 전체 96 잘 접시 것 ~ 21 분 및 25 분 라인 스캔 카메라 각각 92 및 47 kHz의 속도에서 실행 되는 시간. 예를 들어 비디오 1 를 참조 하십시오.
경도 형태 및 생리 적 종양 회전 타원 체의 모니터링
우리는 여러 시간 포인트 접시에서 종양 spheroids의 10 월 구조 이미지를 획득, 한 추가 종양 spheroids의 형태 및 생리 적 정보를 측정 하 여이 데이터를 분석 수 우리. 그림 4 는 종양 spheroids 특성화 고 정보를 가져오는 경도 형태학 상과 생리 적인 그들 로부터 다른 접근을 보여준다.
그림 4B 종양 회전 타원 체를 시각화 하는 다른 방법을 보여 줍니다. 상용 또는 무료 소프트웨어의 도움으로 우리 소프트웨어에 3D 데이터를 로드 하 고 종양 회전 타원 체 (3D 렌더링)의 "볼륨"을 만들 수, 3D 공간에서 종양 회전 타원 체의 전체 구조를 보여 주는. 적절 한 임계 처리와 함께 우리는 종양 회전 타원 체 (그림 4B)는 회전 타원 체를 세그먼트 하 고 볼륨을 측정 하는 데 사용할 수의 표면 플롯을 생성할 수 있습니다. 우리 또한 다른 방향 (그림 4B, XZ, YZ, 및 XY)에서 다른 단면 평면에서 직교 슬라이드 (수직 슬라이드)를 생성 하 고 직경 및 이러한 직교 슬라이드에서 종양 회전 타원 체의 높이 측정 수 있습니다.
여러 시간 지점에서 동일한 회전 타원 체의 10 월 데이터를 수집, 형태소 정보를 계량 하 고 그것의 경도 변경 내용을 표시 하는 회전 타원 체의 성장 곡선을 생성 수 우리. 그림 4C 는 HCT 116 종양 회전 타원 체 21 일에 대 한 모니터링 되 고 있는의 대표 데이터를 보여 줍니다. 세그먼트 데이터를 수직 슬라이드, 직경, 높이 모든 시간 지점에 대 한 회전 타원 체의 복 기반 볼륨 테이블에 나열 된를 측정 했습니다. 우리는 또한 비교에 대 한 직경 기반 볼륨을 계산합니다. 크기 및 볼륨 성장 곡선, 각각 구성 했다. 성장 곡선에서 우리는 HCT 116 종양 회전 타원 체가 하루 11 전에 볼륨에서 선형 성장 패턴에 따라 볼 수 있습니다. 이 시간 포인트 전에 회전 타원 체는 성장 유지 하 고 상대적으로 일정 한 모양을 유지. 그러나, 11 일 후는 회전 타원 체 중단, 평평 하 게 되었고 21 일에 완전히 붕괴. 복 셀 기반 볼륨의 성장 곡선은 명확 하 게 하루 11 후 점차 감소 볼륨으로 추세를 보여줍니다.
10 월 데이터를 바탕으로, 2D 횡단면 이미지에서 픽셀에 의해 광 감쇠를 분석 하 여 종양 spheroids 내의 죽은 세포의 분포의 생리 적인 정보를 또한 얻을 수 있습니다 우리. 그림 2 및 프로토콜 5에 나와 있는 방법 다음 우리 양적 죽은 셀 영역을 결정 하 고 모니터링 시간의 기능으로이 지역의 성장 수 있습니다. 그림 4D 종양 회전 타원 체의 죽은 세포 영역 증가의 경도 추적의 대표적인 결과 보여줍니다. 높은 광 감쇠 했다, 빨간색으로 강조 표시 하는 영역 표시 레이블된 괴 지역. 14 일 개발 중 광 감쇠 지도 렌더링 하는 3 차원에서 확대, 괴 사 성 지역의 증가 나타내는 빨간 분야를 볼 수 있었습니다. 괴 지역 증가의 백분율로, 종양 회전 타원 체는 완벽 한 모양을 유지 하지 수 없습니다. 따라서, 그들은 것 경향이 있다 하 고 축소, 어떤 그림 4C에 종양 형태학의 모니터링의 경도 볼 수 있었다.
제안 된 비파괴 죽은 조직 지역 탐지 기술은 해당 이미지 조직학 및 IHC 여 HCT 116 종양 회전 타원 체의 10 월 광 감쇠 지도 비교 하 여 확인 했습니다. 그림 4D 하루 14 HCT 116 회전 타원 체와 같은 비교를 제공합니다. OCT 감쇠 사이 좋은 일치 하는 지도 및 H & E와 TUNEL 해당 조각을 발견 했다, H & E와 TUNEL 조각 10 월 높은 감쇠의 윤곽에서 파생 된 대시 선으로 표시 된 영역 내에서 기능을 분석 하 여 표시 했다 영역입니다. H & E 조각에 죽은 조직 지역 파선 영역 내에 있는 적은 밀도 및 집계 구조에 의해 표시 되었다. TUNEL 조각, 좋은 일치 하는 높은 감쇄 지역과 TUNEL 표시 된 apoptotic 세포 지역 사이 관찰 되었다.
그림 1: 종양 회전 타원 체 이미징에 대 한 높은 처리량 광학 일관성 단층 촬영 (HT-10 월) 시스템의 구축. HT-10 월 시스템의 개략도 (A). 96 잘 접시의 다이어그램 OCT 시스템 옆 플롯 됩니다. 5 웰 스 (D2, D11, B6, D6, G6) 노란색에서 표시 (D) 단계의 미세 조정에 사용 됩니다. (B) HT-10 월 시스템의 실제 구성. 시스템의 각 부분에 사용 되는 광학 부품 재료의 표를 참조 하십시오. (C) 분석기 HT-10 월 시스템에 대 한 디자인. (D) 단계 HT-10 월 시스템에 대 한 설치. 6 축 단계 10 월 수집 및 단계 운동 간의 동기화의 적절 한 맞춤은 높은 처리량 이미징에 대 한 필요 합니다. (E)와 (F) 다른 우물의 최종 이미지 기울이기 및 회전의 효과 보여 줍니다. 회전 하면 가로로 기울이기으로 이어질 것입니다 다른 우물의 수직 이동 하는 동안 이동 하기 다른 우물의 OCT 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 종양 spheroids의 10 월 이미지에 대 한 데이터 처리. 10 월 데이터에 대 한 일반적인 사후 처리 단계 (A) 순서도. (B) 종양 회전 타원 체의 형태학 정량화의 순서도. (C) 종양 회전 타원 체의 죽은 셀 영역 검출의 순서도. 눈금 막대: 모든 subfigures에 대 한 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 높은 처리량 10 월 96 잘 스캔 플레이트 포함 U-87 MG 종양 spheroids. (A) 96와 실제 설치-잘 목표 아래 접시. (B) 흐름 차트 HT-10 월 시스템의 소프트웨어 구현. 합성 96 en 얼굴 (C), 횡단면 (D)와 3D 렌더링 된 최대 강렬 투 상 (MIP) (E)의 10 월의 하루 3 HCT 116 spheroids 처리 된 데이터에서 생성 된 이미지. 모든 subfigures에 대 한 눈금 막대: 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 경도 형태학 및 3D 10 월 데이터와 종양 Spheroids을의 생리의 정량화. 일반 10 월 후 처리 후 종양 회전 타원 체의 (A) 획득 3D 10 월 구조 이미지. OCT 데이터에서 우리가 어떤 방향으로 (B) 종양 회전 타원 체의 구조를 3D 표면 플롯 및 XZ, YZ 및 XY 직교 분할 영역을 생성할 수 있습니다. 경도 단일 종양 회전 타원 체 (C), 그것의 직경, 높이 복 기반 볼륨 ( 재료의 테이블에에서 나열 된) 특성화 모니터링과 21 일 동안 크기 및 볼륨 성장 곡선을 플롯을 수행할 수 있습니다. 개발입니다. 개발, 회전 타원 체로 예제에서 그것은 하루 11에 중단 되었고 하루 21에 완전히 붕괴. 우리 더 경도 광학 내장 감쇄 대비 (D)에 따라 종양 회전 타원 체의 생리 적 상태를 모니터링할 수 있습니다. 3D 렌더링 이미지 종양 회전 타원 체의 모양과 14 데 하루 7에서에서 죽은 셀 영역의 성장을 보였다. 빨간색으로 높은 감쇠 표시 된 죽은 셀 영역 조직학으로 일치 했다 고 immunohistochemical (IHC) 결과. 10 월 감쇠 지도, H & E, 그리고 TUNEL 그림 4D 에서 결과 참고. 42에서 수정 됩니다. 스케일 바: 모든 subfigures에 대 한 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: 종양 spheroids의 높은 처리량 10 월 영상. 3D 10 월 영상, 기본 10 월 처리 및 단계 움직임의 워크플로 5 배 속도와 비디오에 제시 했다. Spheroids의 처리 10 월 구조 이미지의 미리 보기도 제시 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
종양 활동은 매우 그것의 형태학 상 구조에 관련이 있다. 유사한 특성 성장 곡선 2D 셀 문화에 대 한 모니터링, 3D 종양 spheroids에 대 한 성장 곡선을 추적 이다 또한 다른 세포에 대 한 장기적인 회전 타원 체 성장 동작에 대 한 기존의 접근. 특히, 우리 종양 저하 또는 직접 성장 곡선에 반영 하는 종양 재 성장을 분석 하 여 약물 응답을 특징 수 있습니다. 따라서, 3 차원 종양 spheroids, 크기, 볼륨, 성장 곡선, 파생 등의 정량적 평가 종양 spheroids의 특성화 및 복합 효과의 평가에 매우 중요입니다. 현재, 밝은 분야, 위상 대조를 기반으로 플랫폼을 이미징 또는 형광 이미징 일상적인 이미징 및 형태학의 분석 또는 3D 종양 spheroids8,,918의 기능에 대 한 설립 되었습니다. 22. 그러나, 그들은 한정 된 깊이 침투 수 있으므로 저해상도 깊이-resolvability 전체, 큰 종양 구조를 확인할 수 없습니다. 대표 결과에서 우리는 OCT 시간이 지남에 개발 종양 회전 타원 체의 전체 3D 구조를 증명 하고있다. 3D 10 월 영상 했던 깊이 따라 해상도 부족 기존의 이미징 형식에서 사용할 수 있는 어떤 방향 및 높은 resolvability와 모든 횡단면 회전 타원 체의 보기를 제공할 수 있습니다. 또한, 복 기반 볼륨 정량화 3D 10 월 데이터에 따라 그들의 원래 형태를 가정 하지 않고 회전 타원 체 볼륨의 정확한 정량화를 나왔고. 따라서, 우리는 증명 하고있다 10 월 3D 형태 특성 분석을 위한 종양 spheroids의 다른 세포에 대 한 특성 성장 패턴의 정확한 측정을 보장 하 고 잠재적으로 사용할 수 있는 강력한 이미징 적임 인지는 약물 반응 평가 대 한 대안입니다.
생존 테스트 형광 얼룩을 사용 하 여 약18상영을 위한 특히 종양 spheroids의 기능 분석에 대 한 인기 있는 방법은 남아 있다. 그러나, 형광 염료의 파괴적인 성격이 테스트는 끝점 연구에 적합을 나타냅니다. 우리의 대표 결과 (그림 4D), 우리는 전체 회전 타원 체 내에서 세포 생존 능력 특징 수 있습니다 다른 방법을 시연 했다. 우리의 결과 10 월 내장 광 감쇠 대비에 따라 회전 타원 체에 가능한 지역에서 죽은 셀 영역을 구별할 수 있는 보여주었다. 또한, 3D 이미징 기능과 OCT 시스템의 비 파괴적인 자연, 죽은 세포 분포의 정량적 평가 및 시내 라 죽은 세포 지역에서 회전 타원 체의 진행의 모니터링은 가능는 잠재적으로 회전 타원 체 성장 패턴의 더 귀중 한 정보를 제공 합니다. 그러나, 우리가, 우리의 대표 결과에 우리는 수 없습니다 다른 유형의 세포 죽음 모드, apoptosis와 괴 사, 이진 10 월 감쇠 지도에서 등을 차별화 하는 데 주의 해야.
약 이후 화합물 라이브러리는 광범위 한 될 수 있습니다 (> 10000), 마약 검사 중 종양 spheroids 다 잘 판에 하는 높은 처리량 및 강력한 시스템은 필수적입니다. 현재 높은 처리량 이미징 시스템에서 전체 96 잘 접시의 심사를 달성할 수 있는 < 차원에서 5 분 스캔 모드22. 10 월 전동된 스테이지의 도움으로 높은 처리량 검열 목적을 위해 적용할 수 있습니다. 하나 또한 상용 10 월 시스템 (참조 테이블의 자료 상용 10 월 시스템의 목록에 대 한) 우리의 사용자 정의 10 월 시스템에 비슷한 성능 가진 하 고 시스템에 전동된 스테이지를 통합할 수 있습니다. 그러나, 자동화 한 단계를 통합 하기 위해 상업 10 월 시스템을 수정 하 노력을 이동 해야 합니다. 또한, 사용자 정의 소프트웨어 구현 OCT 수집 트리거 및 단계 운동 트리거 사이 동기화를 실현 하기 위해이 필요 합니다. 우리의 프로토 타입 HT-10 월 시스템에 대 한 2-18 초에서는 단일 종양 회전을 타원 체, 카메라 속도의 선택에 따라 3D 10 월 데이터를 얻으려고 했다. 따라서, 총 획득 시간 HT-10 월 시스템을 사용 하 여 96 잘 접시 ~3.2 분으로 짧은 될 수 있습니다. 그러나, 데이터 처리, 데이터 읽기 및 쓰기 하드 드라이브, 및 단계 움직임을 포함 하 여 현재 HT-10 월 시스템에 대 한 중간 단계 남아 시간이 소요. 추가 ~ 18 분 위에 ~3.2 분 최소 데이터 수집 시간 필요할 것 이다. 총 시간 이미징 여러 측면에서 더 감소 될 수 있다: 사용 하는 고속 가변 레이저 소스50,51; 10 월 시스템의 상태--예술 중요 한 단계 (데이터 수집, 데이터 처리, 쓰기, 무대 이동)를 준비 하 여 워크플로 최적화 병렬로 처리; 사용 하는 공간 부문 멀티플렉싱 설치52와 병렬 10 월 영상. 시스템 최적화, 높은 처리량 10 월 시스템 암 약물 발견 뿐만 아니라 다른 3D 바이오 조작 샘플의 특성에 이용 될 수 있다 (예., 3 차원 조직 organoids) 다양 한 생물 의학 응용 프로그램에 대 한.
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Disclosures
저자 공개 경쟁 관심.
Acknowledgments
이 작품은 NSF에 의해 지원 되었다 IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR를 부여-TT (IIP-1640707), NIH 교부 금, R21EY026380, R01EB025209, R15EB019704 및 Lehigh 대학 시작 기금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
| Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
| 2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
| Reference Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Focusing Lens | Thorlabs | ||
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| 1D Translational Stage | Thorlabs | ||
| Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Sample Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Galvanometer | Thorlabs | ||
| Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
| Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| Objective | Mitutoyo | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Polarization Controller | Thorlabs | ||
| 30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
| Cage Rod | Thorlabs | ||
| Stage | |||
| 3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
| 2D Tilting Stage | |||
| Rotation Stage | |||
| Plate Holder | 3D printed | ||
| Spectrometer | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
| F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
| InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Component | |||
| HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
| Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
| Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
| Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
| Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
| Gloves | VWR | 89428-750 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
| Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
| Microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology & IHC | |||
| Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
| Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Commerical OCTs | |||
| SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
| SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software for Data Analyses | |||
| Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
| 3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
| 3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
| OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
| Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
| OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
| Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |
References
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