Summary
Optisk koherenstomografi (OCT), en tredimensionell bildteknik, användes till att övervaka och karaktärisera tillväxt kineticsen av flercelliga tumör spheroids. Exakt volymetriska kvantifiering av tumör spheroids använder en voxel räknar strategi och etikett-fri död vävnad upptäckt i de spheroids baserat på inneboende optisk dämpning däremot påvisades.
Abstract
Tumör spheroids har utvecklats som en tredimensionell (3D) cell kultur modell av cancer forskning och anti-cancer läkemedelsutveckling. Dock hög genomströmning imaging modaliteter utnyttja ljusa fält eller fluorescens upptäckt, för närvarande inte kan lösa övergripande 3D-strukturen för den tumör sfäroid på grund av begränsad ljuspenetrering, diffusion av fluorescerande färgämnen och djup-potentiellt. Vårt labb visade nyligen, användning av optisk koherenstomografi (OCT), en etikett-fri och icke-förstörande 3D imaging modalitet, för att utföra längsgående karakterisering av flercelliga tumör spheroids i en plattan med 96 brunnar. OCT kunde få 3D morfologiska och fysiologiska information för tumör spheroids växer upp till ca 600 µm i höjd. I denna artikel visar vi en hög genomströmning okt (HT-okt) bildsystem som genomsöker hela flera väl plattan och erhåller 3D OCT-data av tumör spheroids automatiskt. Vi beskriva detaljerna i HT-okt system och konstruktion riktlinjerna i protokollet. Från den 3D OCT-data, en kan visualisera den övergripande strukturen på sfäroid med 3D-renderade och ortogonala skivor, karakterisera längsgående tillväxtkurvan den tumör sfäroid baserat på morfologiska information om storlek och volym och övervaka tillväxten av de döda-cell regionerna i den tumör sfäroid baserat på optisk inneboende dämpning kontrast. Vi visar att HT-ULT kan användas som en hög genomströmning bildgivande modalitet för drug screening samt karaktärisera biofabricated prover.
Introduction
Cancer är den näst vanligaste orsaken till dödsfall i världen1. Utveckla läkemedel inriktning cancer är av avgörande betydelse för patienter. Dock är det beräknat att mer än 90% av nya anti-cancer läkemedel misslyckas i utvecklingsfasen brist på effekt och oväntad toxicitet i kliniska prövningar2. En del av orsaken kan hänföras till användningen av enkel tvådimensionell (2D) cell kultur modeller för sammansatta screening, som ger resultat med begränsade prediktiva värden av sammansatta effekt och toxicitet för de följande stadierna av drug discovery2 , 3 , 4. nyligen, tredimensionella (3D) tumör sfäroid modeller har utvecklats för att ge kliniskt relevanta fysiologiska och farmakologiska data för anti-cancer drug discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Eftersom dessa spheroids kan härma vävnad-specifika egenskaper för tumörer i vivo, såsom näringsämnen och syre kan gradient, hypoxisk kärna samt drog resistens19, användningen av dessa modeller potentiellt förkorta drug discovery tidslinjer, minska kostnaderna för investeringar och få nya läkemedel till patienter mer effektivt. Ett kritiskt förhållningssätt till utvärdera sammansatta effekt i 3D tumörutveckling sfäroid är att övervaka sfäroid tillväxt och återkommande under behandlingar9,26. Gör detta genom är kvantitativa karakteriseringar av tumör morfologi, som inbegriper dess diameter och volym, med högupplösta avbildningsmetoder, absolut nödvändigt.
Konventionella avbildningsmetoder, såsom ljusa fält, fas kontrast7,9,22,24och fluorescence mikroskopi8,9,16, 18,22 kan ge ett mått på den sfäroid diameter men inte kan lösa den övergripande strukturen på sfäroid i 3D-rymden. Många faktorer bidrar till dessa begränsningar, inklusive penetration av sondering ljuset i sfäroid; diffusion av fluorescerande färgerna i sfäroid; avger fluorescerande signaler från glada fluorescerande färgämnen inuti eller på den motsatta ytan sfäroid på grund av stark absorption och spridning; och djup-avveckling av dessa imaging modaliteter. Detta leder ofta till en felaktig volymmätning. Utvecklingen av nekrotisk kärnan i spheroids härmar nekros i i vivo tumörer6,10,15,19,25. Patologiska funktionen är osannolikt reproduceras i 2D cell kulturer19,25,27,28. Med en sfäroid storlek större än 500 µm i diameter, en trelagers koncentriska struktur, kan inklusive ett yttre lager av prolifererande celler, ett mellanlager av quiescent celler och en nekrotisk kärna, observeras i sfäroid6,10 ,15,19,25, på grund av brist på syre och näringsämnen. Levande och döda cellen fluorescens bildbehandling är standardmetoden att märka gränsen av nekrotisk kärnan. Dock igen, hindra genomföringar av både dessa fluorescerande färger och synligt ljus potential att sond i nekrotisk kärnan att övervaka dess utveckling i sin riktiga form.
En alternativ 3D imaging modalitet, införs optisk koherenstomografi (OCT) för att karakterisera de tumör spheroids. OCT är en biomedicinsk imaging teknik som kan förvärva etikett-fri, icke-förstörande 3D data från upp till 1-2 mm djup i biologiska vävnader29,30,31,32,33 ,34. OCT sysselsätter låg-coherence interferometri att upptäcka bakåtspritt signaler från olika djup av provet och ger rekonstruerade djup-löst bilder på micron-nivå rumsliga upplösningar i både laterala och vertikala riktningar. OCT har allmänt antagits i oftalmologi35,36,37 och angiografi38,39. Tidigare studier har använt OCT att iaktta morfologi av in vitro- tumör spheroids i basalmembranet matris (t.ex., Matrigel) och utvärdera sina svar till fotodynamisk terapi40,41. Nyligen har föreligga vår grupp en hög genomströmning OCT imaging plattform för att systematiskt övervaka och kvantifiera tillväxten kineticsen av 3D tumör spheroids i plattor med flera42. Exakt volymetriska kvantifiering av 3D tumör spheroids använder en voxel räknar strategi och etikett-fri nekrotisk vävnad upptäckt i de spheroids baserat på inneboende optisk dämpning kontrast visades. Detta dokument beskriver detaljerna i hur OCT imaging plattformen uppfördes och anställda att få högupplösta 3D-bilder av tumör spheroids. De stegvisa kvantitativa analyserna av tillväxt kineticsen av 3D tumör spheroids, inklusive noggranna mätningar av sfäroid diameter och volymer, beskrivs. Dessutom presenteras metoden för icke-destruktiv detektering av nekrotisk vävnad regioner använder ULT, baserat på inneboende optisk dämpning kontrasten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av celler
- Få cellinjer från en kvalificerad leverantör.
Obs: Kontrollera att celler från cell linjer av intresse kan bilda sfäroid i kultur media eller med hjälp av ett substrat (basalmembranet matrix som Matrigel). Titta in i den litteratur9 eller utföra en runda av inför experiment för en kontroll. - Tina de frysta celler efter det specifika förfarandet cellinje leverantören tillhandahållit. Ett allmänt förfarande kan hittas någon annanstans43.
- Odla cellerna för 1-2 passager i 25 cm2 kultur kolvar. Cellerna är sedan klar att använda för 3D cellodling.
- Övervaka hälsostatus för cellerna varje dag och underhålla dem i en inkubator under standart villkorar (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet). Uppdatera media som behövs.
Obs: Odlingssubstratet består av DMEM (4,5 g/L glukos), 1% antibiotika-antimycotic, 10% fetalt bovint serum. Subkultur celler innan de når sammanflödet i kolven, kultur. Följ den cell kultur riktlinjen som tillhandahålls av leverantören. Ett allmänt förfarande kan hittas elsehwhere44. - Utför 3D cellkultur i plattor med flera baserat på följande allmänna protokoll9.
- Ta bort kultur media från kultur kolven och tvätta det med steriliserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS, värms upp till 37 ° C).
- Att resuspendera cellerna genom att tillsätta 1 mL av trypsin etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA, 0,5%) i kolven för 3 min. Lägg sedan till kultur media för att späda ut trypsin.
- Överföra cellsuspensionen i en 15 mL centrifugrör och Centrifugera under 5 minuter vid 500 x g och rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 4 mL före värmde odlingsmedium. Överför med pipett en droppe av provet på en hemocytometer för cell inventering för att avgöra cellkoncentrationen. Späd cellerna till lämplig koncentration för sådd (t.ex., 3 000 celler/mL).
Obs: Optimera inledande cellkoncentrationen sfäroid för varje cell-rad och varje typ av flera platta (96 brunnar, 384-väl eller 1536-well). - Utsäde celler i en ultralåg fastsättning (ULA) rundkolv flera plattan. Tillsätt 200 µL celler suspension i varje brunn 3.000 celler/mL koncentration så att alla har väl ca 600 celler.
- På RT, Centrifugera hela plattan med en tallrik adapter för 7 min, direkt efter sådd, vid en hastighet av 350 x g eller den lägsta hastigheten som är tillgängliga.
Obs: Centrifugen hjälper samla celler till mitten av brunnen för att underlätta utgör en enda, enhetlig sfäroid. Centrifugera steget utförs endast en gång i början för att bilda de tumör spheroids. Det kommer inte att upprepas när de tumör spheroids börja växa. - Underhålla flera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 i en kultur inkubator och uppdatera kultur media varje 3 dagar.
Obs: Tillväxt tid kan variera för olika 3D odlingsbetingelser. I vår studie används 3 000 celler/mL för både U-87 MG och HCT 116 cellinjer i 96 brunnar, så att sfäroid kan växa till ~ 500 μm i 4\u20127 dagar för HCT 116 celler. Överväg att lägga till media kosttillskott och tillväxtfaktorer för olika sfäroid modeller, utifrån generella 3D kultur-protokollet. - Utföra OCT avbildning av tumör spheroids varje 3\u20124 dagar för en longitudinell studie av deras tillväxt.
Obs: Rekommenderade tidpunkter för OCT imaging skulle vara dag 4, dag 7, dag 11, dag 14, dag 18 och dag 21.
2. hög genomströmning okt Imaging Platform
Obs: Se refereras arbete29,30,31,32,33,34 för en grundlig översyn av principer och tillämpningar av OCT. Se figur 1 och Huang et al. 42 för detaljer anpassade ULT imaging system som används i denna studie.
- Välja en lämplig bredband ljuskälla för tumör sfäroid imaging OCT-systemet.
Obs: Här, en superluminescent diod (SLD, figur 1A,B) med en central våglängd på ~ 1 320 nm och ~ 110 nm bandbredd användes som bredband ljuskälla. - Konstruera referens arm och prov arm av OCT systemet efter schemat (se figur 1A,B för detaljer). Se Tabell för material för en lista av optiska komponenter att konstruera OCT systemet. Se till att den optiska ljuspassagelängden av referens arm och prov arm matchas nära.
- Konstruera spektrometern, inklusive en kollimator, galler, en F-theta lins och en linje-scan kamera (se figur 1 c för setup34) för detaljer av spektrometer utformningen av okt alternativt välja en kommersiell spektrometer som matchar den Center våglängd av ljuskällan. Kontrollera att spektrometern är korrekt justerad för att täcka hela laser bandbredd, att uppnå hög photon samlingseffektivitet och ger långsam wash-out av interferensmönstret.
- Prägla utförandet av OCT systemet, inklusive följande mätvärden såsom prov arm makt, total imaging djup, djup-beroende känslighet, axial upplösning, djup fokus och lateral resolution. Placera en svag reflektor (t.ex., en spegel med en neutral densitet filter) som ett prov att mäta djup-beroende känslighet, axial upplösning och skärpedjup. Placera en USAF upplösning test diagram mål som provet att kontrollera den laterala resolutionen.
Obs: Se referenser34,45 för definitioner av mätvärden av OCT prestanda och protokoll att karakterisera dessa mått45. Se tabell 1 för en förteckning över uppmätta parametrar för det anpassa OCT-system som används i vår studie. - Välj en motoriserad översättning fas att tillhandahålla horisontella rörelse av flera plattan till bild tumör spheroids i olika brunnar (se figur 1B). Använd ett skede med resor olika större än 108 x 72 mm för att säkerställa en fullständig skanning av alla brunnar av flera plattan. Använda en 2D- eller 3D motoriserad översättning scenen med programvarukontroll exakt lokalisering av varje brunn och automatisering av OCT systemet för hög genomströmning imaging.
- Använd en tallrik adapter eller designa en tallrik hållare (genom 3D printing) för att hålla flera plattan i en fast position.
- Korrigera tippning och rotation av flera plattan använder en 2D tippning etapp och en rotation monterad på translationell scenen (se figur 1 D), innan du utför någon OCT imaging för att minimera variationen i fokus planet från olika brunnar. Använda D11, D6, B6, D2, G6 som vägledande brunnarna vid övervakning av deras relativa lägen i OCT bilder (figur 1A).
- Justera rotationen av plattan för att kanterna på plattan är parallella med Stadium rörelsens riktning så att brunnarna ligger kvar på samma horisontella positioner i OCT bilder (figur 1E). Justera de vippning av plattan vara parallellt med den optiska tabellen så att brunnarna ligger kvar på samma vertikala platser för OCT imaging (figur 1F).
Obs: Justering av lutande vinkel och fokus att optimera OCT bildkvalitet för alla brunnarna. Variationer av höjden av kultur media i olika brunnar kan dock orsaka förändringar i optiska banor vilket kan leda till oskärpa av sfäroid bilden. Autofokus kan genomföras för att styra fokalplanet OCT Imaging för att uppnå optimerad bildkvalitet. Höjdjustering steg löser inte fattiga OCT bildkvaliteten den tumör sfäroid på grund av följande problem: den sfäroid decentrering på grund av initial sådd läge; sfäroid höjd när inbäddade i biofabricated extracellulära matriser; stackars plattan kvalitet med stora variationer av höjden av väl bottnar. Ytterligare programvarukontroll med auto-fokus eller egen justering funktioner kan genomföras för att optimera prestanda för ULT imaging system. - Använda en anpassad datorprogram för att styra OCT bild förvärv och scenen rörelsen för att samla in data från varje väl sekventiellt.
3. okt skanning och bearbetning av tumör Spheroids
- På dagen för den OCT avbildning av tumör spheroids, ta flera plattan från inkubatorn. Överföra flera plattan under ULT imaging system. Placera den ovanpå plattan adaptern.
Obs: OCT avbildning av tumör spheroids kan utföras med polystyren plattan locket på eller av. De vatten condensations på locket på grund av avdunstning från brunnarna kan dock påverka ljustransmission och snedvrida den lätta vägen, ger mindre optimal OCT-bilder från spheroids. - Justera höjden på plattan genom att flytta längs z-riktningen av översättning scenen. Upprätthålla fokalplan position på ~ 100 – 200 μm nedanför den övre ytan på varje sfäroid, att minimera effekten av de icke-enhetligt depth-wise fokal profil.
- Ange ett korrekt OCT skanning (t.ex., 1 x 1 mm) i den anpassa programvaran för att täcka den hela tumören sfäroid enligt dess utvecklingsstadier. Klicka på Spara parametrar för att spara inställningen.
- Använda anpassade programvaran för att förvärva 3D OCT-bilder av tumör spheroids taget för alla brunnar i plattan som innehåller spheroids. Klicka på Förhandsgranska för att visa den förhandsgranskade bilden och klicka på Skaffa för att förvärva OCT bilden .
Observera: Kontrollera att OCT sfäroid uppgifterna samlas in när scenen inte är i rörelse. Sfäroid finns oftast i mitten av U-botten väl. Sfäroid kan dock flyttas i kultur media när scenen accelererande eller saktar in på grund av trögheten i sfäroid i kultur media. - Bearbeta 3D OCT datamängder av tumör spheroids att generera OCT strukturella bilder med en anpassad C++ bearbetning kod. Se figur 2A för ett flödesschema för efterbearbetning av OCT data.
Obs: Se figur 4A för genererade 3D OCT strukturella bilder.- Se kapitel 5 i Drexler och Fujimoto34 och Jian o.a. 46 för detalj beskrivningar av efterbehandling steg i OCT data. Kalibrera pixelstorlek i alla tre dimensioner. Re skala OCT strukturella bilderna på korrigerade skalor.
Obs: Avståndet i axiell riktning (z-riktningen) av OCT bilder är ett mått på optisk väg skillnaden mellan referens arm och prov arm. Brytningsindex för provet (n) behöver således beaktas vid kalibrering pixelstorlek i axiell riktning för justeringen. I vår studie, använder vi n = 1,37 som brytningsindex för tumör sfäroid42.
- Se kapitel 5 i Drexler och Fujimoto34 och Jian o.a. 46 för detalj beskrivningar av efterbehandling steg i OCT data. Kalibrera pixelstorlek i alla tre dimensioner. Re skala OCT strukturella bilderna på korrigerade skalor.
- Skapa kollage av sfäroid bilder med 2D OCT-bilder i tre tvärsnittsdata XY, XZ och YZ-plan över centroiden sfäroid. Se figur 3 c–E för representativa produktionen av collage av sfäroid bilder. Utföra bildregistrering för alla de spheroids, med den MATLAB funktion dftregistration47, för att säkerställa att centroids alla sfäroid ligger ungefär på samma plats.
- Hämta 3D-rendering av den sfäroid använder en kommersiell eller anpassad programvara.
Obs: Följande steg visar hur du skaffar den 3D-renderingen av tumör spheroids använder en kommersiell programvara.- Ladda 3D OCT data in i programvaran.
- Klicka på panelen överstiga . Klicka på Lägg till ny volym. Välj blandningsläget för 3D-rendering .
- Justera visningsvinkeln genom att dra bilden med muspekaren.
4. morfologiska kvantifiering av 3D tumör Spheroids
Obs: En anpassad skriftlig kod i MATLAB bearbetar denna kvantifiering. Klicka på knappen Kör för att starta processen. Se figur 2B för flödesschemat stegen av morfologiska kvantifiering av spheroids.
- Kvantifiera sfäroid diameter, höjd och diameter-baserat volym.
- Välj 2D OCT bilder i tre tvärsnittsdata XY, XZ och YZ plan som korsar centroiden sfäroid.
- Mät diametern och höjden av sfäroid i XY och XZ flygplan, respektive.
- Beräkna diameter-baserade sfäroid volymen med:
, med en presumtion om den sfärisk formen av tumör.
- Kvantifiera voxel-baserad sfäroid volym.
- Använda ett 3D-snitt filter på OCT strukturella data sfäroid ta bort fläckar.
- Segmentera tumör spheroids med filtret Canny edge detection48 , bildruta för bildruta, med en lämplig tröskel skiljer tumör sfäroid regionen från väl botten.
- Gruppera bindväv voxlar för 3D-data (se inbyggd funktion: bwconncomp).
- Beräkna det genomsnittliga avståndet mellan varje bindväv voxel i gruppen och den sfäroid centroiden (manuellt valt), för varje grupp. Identifiera regionen sfäroid som gruppen med det minsta genomsnittliga avståndet.
- Räkna antalet voxlar inom regionen sfäroid och sedan multiplicera med den faktiska volymen en enskilda voxel (volym/voxel), vilket ger den totala volymen av sfäroid.
, med en presumtion om den sfärisk formen av tumör.5. döda-cellen regionen detektion av 3D tumör Spheroids
Obs: I ett homogent medium, OCT bakåtspritt intensitet upptäcks som en funktion av djup (jag(z)) kan beskrivas genom de öl-Lambert lag49: 
, där z representerar djupet, μ är optisk dämpning koefficient, och jag0 är incident intensiteten till provet. Därav härledda optisk dämpning koefficienten kan uttryckas som: 
. Eftersom OCT bilder är ofta ritade på en logaritmisk skala, kan lutningen på OCT intensitet profilen hämtas för att härleda koefficienten som optisk dämpning. Se figur 2 c för ett flödesschema av generation av optisk dämpning kartor.
- Utföra segmentering för att ta bort oönskade områden utanför sfäroid. Utför 3D genomsnittliga filter för att undertrycka speckle buller som är inneboende i OCT bilder.
- Få pixel-wise optisk dämpning koefficienter av linjär montering loggskala OCT intensitet profilen över ett visst djupintervall (rörliga fönster), extrahera dess lutning och multiplicera lutningen med -1/2.
Obs: Dämpning koefficienten på varje voxel inom regionen segmenterade sfäroid beräknas baserat på sluttningen av OCT intensiteten profil i ett 10-voxel djup fönster (~ 40 μm i djup), med den voxel ligger i mitten av fönstret. - Tillämpa metoderna ovan (steg 5.1 och 5.2) på varje axial skanning i en ram och varje bildruta i en 3D datamängd som innehåller regionen segmenterade sfäroid tills optisk dämpning koefficienter för alla voxlar i regionen segmenterade sfäroid beräknas.
- Utför den binära tröskelvärde för att markera regionen hög-dämpning.
Obs: Se Huang et al. 42 för fastställandet av tröskelvärdet i regionen hög-dämpning med hjälp av histogrammet analys. - Markera binarized optisk dämpning kartan på den ursprungliga bilden att märka regionen döda-cell (blandning). Generera 3D-renderade bilden av blandade dämpning kartan att visualisera 3D fördelningen av regionen döda-cell.
6. histologi och immunohistokemi
Obs: Histologi och immunhistokemi (IHC) målat bilder av tumör spheroids erhålls för att korrelera med motsvarande OCT resultat.
- Vid valda tidpunkter, Välj 1-2 tumör spheroids från flera plattan för histologi och IHC färgning. Använd en pipett med 1 mL pipett tips för att överföra sfäroid från brunnen till ett 1,5 mL centrifugrör.
Obs: Klipp 1 mL pipettspetsen före överföringen att se till att öppnandet av spetsen är större än storleken på den tumör sfäroid att undvika att skada strukturen för sfäroid. - Samla varje tumör sfäroid i ett enda 1,5 mL mikrocentrifug rör fyllda med 10% formaldehyd och fixa för 48 h.
- Utföra de histologi och IHC processer för varje sfäroid, använder standard paraffin inbäddning tekniker.
Obs: Fläcken 5 μm tjocka delar av tumören spheroids för hematoxylin och eosin (H & E) och terminal deoxynucleotidyl transferas dUTP nick slutet märkning (TUNEL) apoptos upptäckt. En counterstaining av hematoxylin tillämpas TUNEL. En digital diascanner användes för att skanna färgas provet och få högupplösta histologiska och IHC bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hög genomströmning optisk koherens tomografi avbildning av Spheroids i en plattan med 96 brunnar
Figur 3 uppvisar resultatet av HT-okt skanning av en plattan med 96 brunnar med HCT 116 tumör spheroids på dag 3. Sekventiell genomsökning av hela plattan börjar från nedre högra brunnen (H12). Figur 3B visar flödet kartlägger av programvara genomförandet av HT-okt systemet. Efter en sfäroid data samlades in och bearbetas, plattan skulle flytta till nästa Tja, vänta ~ 2 s att tillåta den sfäroid att vila och samla nästa sfäroid data. Varje lands eller Territoriums data består av 400 x 400 x 1024 voxlar, vilket motsvarade en faktiska volymen 1,0 x 0,84 x 2,3 mm3. Figur 3 c visar ett collage av sv-face OCT bilder av HCT 116 spheroids genereras från de behandlade uppgifterna. Resultatet är jämförbart med bilder från andra 2D hög genomströmning imaging system22. Med tanke på 3D imaging funktioner för ULT, kunde vi också generera collage av 2D tvärsnittsdata sfäroid bilder från 96 brunnarna (figur 3D) för att övervaka sfäroid höjder och visualisera sfäroid inhomogenitet i vertikal riktning. Ett collage av 3D-renderade sfäroid bilder är också möjligt från alla fördefinierade vinklar (figur 3E) att visualisera övergripande 3D formen och utvärdera rundheten för sfäroid. Observera att den totala OCT imaging och processen tid för hela 96 brunnar plattan skulle vara ~ 21 min och ~ 25 min när linjeavsökning kameran körs med en hastighet av 92 kHz och 47 kHz, respektive. Se Video 1 för ett exempel.
Längsgående morfologiska och fysiologiska övervakning den tumör sfäroid
Efter vi erhållit OCT strukturella bilder av tumör spheroids från plattan för flera tidpunkter, kunde vi ytterligare analysera dessa data genom att kvantifiera det morfologiska och fysiologiska informationen om de tumör spheroids. Figur 4 visar de olika tillvägagångssätten att karakterisera tumör spheroids och få längsgående morfologiska och fysiologiska information från dem.
Figur 4B visar olika sätt att visualisera den tumör sfäroid. Med hjälp av antingen kommersiella eller fri programvara, vi kunde ladda 3D data i programvaran och skapa en ”volym” av den tumör sfäroid (3D-rendering), som visar den övergripande strukturen av tumör sfäroid i 3D-rymden. Med ordentlig tröskelvärde, kunde vi skapa en yta tomt tumör sfäroid (figur 4B), som kan användas för att segmentera sfäroid och mäta volymen. Vi kan också generera ortogonala bilder (ortho diabilder) från olika tvärsnitt plan i olika inriktningar (figur 4B, XZ, YZ och XY) och mäta diametern och höjden den tumör sfäroid från dessa ortho diabilder.
Datainsamling i OCT den samma sfäroid från flera tidpunkt, kunde vi kvantifiera den morfologiska informationen och generera tillväxtkurvan den sfäroid att visa dess longitudinella ändringar. Figur 4 c visar representativa uppgifter en HCT 116 tumör sfäroid övervakas för 21 dagar. Vi mätte från segmenterad data och ortho diabilder, diameter, höjd och voxel-baserad volym sfäroid för alla tidpunkten, som var upptagna i tabellen. Vi har också räknat diameter-baserade volymen för en jämförelse. Tillväxtkurvorna i storlek och volym var inritade, respektive. Från tillväxtkurvorna, kunde vi se att detta HCT 116 tumör sfäroid följde en linjär tillväxtmönster i volym innan dag 11. Före denna tidpunkt, sfäroid höll växer och underhålls en relativt enhetlig form. Men efter dag 11, blev sfäroid stört, tillplattad och helt kollapsade på dag 21. Tillväxtkurvan voxel-baserad volymer visar tydligt trenden, med en gradvis minskade volymer efter dag 11.
Baserat på OCT data, kan vi också få den fysiologiska informationen om distribution av dead-celler inom de tumör spheroids genom att analysera pixel-till-pixel optisk dämpning från 2D tvärsnitts-bilder. Efter de metoder som illustreras i figur 2 och protokoll 5, kunde vi kvantitativt bestämma de döda-cell regionerna och övervaka tillväxten i dessa regioner som funktion av tiden. Figur 4 d visar representativa resultat av längsgående spårning av ökningen av dead-cell områden i den tumör sfäroid. De områden i rött, som hade hög optisk dämpning, visar de märkta nekrotiska områdena. Från den 3D-renderade optisk dämpning karta under 14 dagars utvecklingen, kunde vi se den röda sektorn expanderar, som visar att ökningen av Regionkommittén nekrotisk. Som en procentsats av nekrotiska områden ökade, kunde den tumör sfäroid inte behålla sin perfekta form. Därför, de tenderar att störa och kollaps, som sågs i längsgående övervakning av tumör morfologi i figur 4 c.
Den föreslagna icke-förstörande död vävnad region upptäckt tekniken kontrollerades genom att jämföra OCT optisk dämpning karta HCT 116 tumör sfäroid med motsvarande bilder tagna av histologi och IHC. Figur 4 d presenterar en sådan jämförelse med en dag 14 HCT 116 sfäroid. En bra match mellan OCT dämpning karta och motsvarande H & E och TUNEL skivor fanns, som indikerades genom att analysera funktionerna inom Regionkommittén i H & E och TUNEL skivor präglas av dash linjer härrör från konturen av OCT hög dämpning regioner. I H & E skivor indikerades Regionkommittén död vävnad av mindre tät och aggregerade struktur ligger inom regionen streckad linje. I TUNEL skivor observerades en bra match mellan hög dämpning och TUNEL-märkt apoptotiska cellulära region.
Figur 1: byggandet av en hög genomströmning optisk koherens tomografi (HT-OCT) system för tumör sfäroid imaging. (A) schema HT-okt systemet. Ett diagram över plattan med 96 brunnar ritas bredvid OCT systemet. Fem brunnar (D2, D11, B6, D6, G6) märkt med gul används för finjustering av faserna i (D). (B) den faktiska konfigurationen av HT-okt systemet. Se Tabell för material för optiska komponenter som används för varje del av systemet. (C) spektrometer design för HT-okt systemet. (D) scenen setup för HT-okt systemet. Korrekt anpassning av 6-axliga scenen och synkronisering mellan OCT förvärvet och scenen rörlighet krävs för hög genomströmning imaging. (E) och (F) Visa effekterna av rotation och lutning på slutliga bilden av olika brunnar. Rotationen orsakar OCT bilder av olika brunnar att flytta horisontellt medan luta kommer att leda till vertikal förskjutning av olika brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: databehandling för OCT bilder av tumör spheroids. (A) flödesschema över allmänna efterbehandling steg för OCT data. (B) flödesschema över morfologiska kvantifiering av den tumör sfäroid. (C) flödesschema över döda cellen regionen upptäckt den tumör sfäroid. Skalstapeln: 100 µm för alla subfigures. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: High-throughput OCT skanning av en 96 väl plåt innehållande U-87 MG tumör spheroids. (A) den faktiska setup med 96-väl plåt under målet. (B) flödesschema programvara genomförandet av HT-okt system. Collage av 96 sv ansikte (C), tvärsnittsstudier (D) och 3D utsmält maximalstyrkan projektion (MIP) (E) OCT bilder av dag 3 HCT 116 spheroids genererades från bearbetade data. Skalstapeln: 200 µm för alla subfigures. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: längsgående morfologiska och fysiologiska kvantifiering av tumör Spheroids med 3D OCT data. (A), fås 3D OCT strukturella bilder av en tumör sfäroid efter allmänna OCT efterbearbetning. Uppgifterna för OCT kan vi generera en 3D yta tomt och XY, XZ och YZ ortogonala skivor för att visualisera den tumör sfäroid i någon riktning (B) struktur. Vi kan utföra längsgående övervakning av en enda tumör sfäroid (C), kännetecknar dess diameter, höjd och voxel-baserad volym (som visas i Tabellen av material) och plottning tillväxtkurvorna i storlek och volym under 21-dagen utveckling. I exempel som den sfäroid utvecklat, blev det störd på dag 11 och helt kollapsade på dag 21. Vi kan vidare övervaka fysiologiska status för en tumör sfäroid längdriktningen baserat på optisk inneboende dämpning kontrasten (D). 3D-renderade bilder av en tumör sfäroid visade uppkomsten och tillväxten av dead-cell regioner från dag 7 till dag 14. De hög-dämpning-märkt döda-cell områdena i rött matchades med histologiska och immunhistokemisk (IHC) resultat. OCT dämpning karta, H & E och TUNEL resultatet i figur 4 d ändras från Ref. 42. Skala barer: 100 µm för alla subfigures. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: High-throughput OCT avbildning av tumör spheroids. Ett arbetsflöde av 3D OCT imaging, grundläggande OCT bearbetning och scenen rörelse presenterades i videon med en 5 x hastighet. Förhandsvisningar av bearbetade OCT strukturella bilder av spheroids presenterades också. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumöraktivitet är mycket relevanta för dess morfologiska struktur. Liknar övervakning karakteristiska tillväxtkurvan för 2D cellkulturer, spåra tillväxtkurvan för 3D tumör spheroids är också en konventionell metod att karakterisera den långsiktiga sfäroid tillväxt beteenden för olika cellinjer. Bland annat kan vi karakterisera den narkotika Svaren genom att analysera tumör försämring eller tumör återväxt direkt återspeglas i tillväxtkurvan. Kvantitativ bedömning av 3D tumör spheroids, inklusive storlek och volym, att härleda tillväxtkurvan, är därför av stor betydelse för karakterisering av tumör spheroids och utvärdering av sammansatta effekt. För närvarande imaging plattformar baserat på ljusa fält, faskontrast eller fluorescerande imaging har fastställts för rutin bildbehandling och analys av morfologi eller funktioner av 3D tumör spheroids8,9,18, 22. Men är de oförmögna att lösa hela, stor tumör struktur pga begränsat djup penetration samt lågupplösta djup-potentiellt. I de representativa resultat, har vi visat OCT för att visualisera hela 3D-strukturen för den tumör sfäroid utveckling över tiden. 3D OCT imaging kan ge vyn sfäroid i någon riktning och ett tvärsnitt med hög-resolvability, som inte var tillgängliga i konventionella avbildningsmetoder som saknar djup upplösning. Dessutom gav voxel-baserad volym kvantifiering baserat på 3D OCT-data en exakt kvantifiering av sfäroid volymer utan förutsatt att deras ursprungliga former. Därför har vi visat att OCT är en robust bildgivande modalitet för 3D morfologi karaktärisering av tumör spheroids, vilket garanterar noggranna mätningar av karakteristiska tillväxtmönster för olika cellinjer och potentiellt kan fungera som en alternativ för svar utvärdering.
Genomförbarhet tester med fluorescerande färgning förblir en populär metod för funktionella analyser av tumör spheroids, särskilt för drug screening18. Den störande naturen av fluorescerande färger visar dock att dessa tester är endast lämplig för slutpunkten studier. I våra representativa resultat (figur 4 d) visade vi en alternativ metod som kan karaktärisera cellviabilitet inom den hela sfäroid. Våra resultat har visat att OCT kunde urskilja döda-cellen regionen från regionen livskraftig i den sfäroid baserat på inneboende optisk dämpning kontrast. Dessutom med 3D imaging kapacitet och OCT systemets icke-destruktiva karaktär, kvantitativ utvärdering av de döda-cell distributionerna och i situ övervakning av utvecklingen av dead-cell regioner inom sfäroid är genomförbara, som potentiellt ge mer värdefull information av sfäroid tillväxtmönster. Vi bör dock notera att vi i våra representativa resultat, inte är möjlighet att differentiera olika typer av cell dödsfall transportslag, såsom apoptos och nekros, i binärt OCT dämpning kartan.
Sedan en drog sammansatta bibliotek kan vara omfattande (> 10 000), en hög genomströmning och robust system att karakterisera tumör spheroids i plattor med flera under drogkontroll är absolut nödvändigt. Det nuvarande hög genomströmning imaging systemet kan uppnå en screening av hela 96 brunnar plattan i < 5 min i 2D Skanna läge22. OCT kan anpassas för high-throughput screening syfte, med hjälp av en motoriserad scenen. Också du kan skaffa ett kommersiellt tillgängliga OCT-system (se Tabell av material för en lista över kommersiella OCT system) med en liknande prestanda till vårt anpassade OCT-system och införliva en motoriserad scenen i systemet. Insatser måste dock tas kan ändra kommersiella OCT-systemet för att integrera motoriserad scenen. Dessutom krävs anpassad programvara genomförandet att inse synkroniseringen mellan OCT förvärv trigger och scenen rörelse trigger. För vår prototyp HT-okt system tog det 2-18 sekunder att förvärva en 3D OCT-data från en enda tumör sfäroid, beroende på valet av kamera hastighet. Således, den totala anskaffningskostnaden tid kan vara så kort som ~3.2 min för en plattan med 96 brunnar med HT-okt system. De mellanliggande stegen för det aktuella HT-okt-systemet, inklusive databehandling, läsa och skriva data på hårddiskar och scenen rörelser, förblev dock tidskrävande. Ytterligare ~ 18 min skulle behövas ovanpå ~3.2 min minsta data förvärv tiden. Den totala imaging tid kan minskas ytterligare i flera aspekter: använda state-of-the-art OCT system utrustade med en höghastighets avstämbara laser källa50,51; optimerad arbetsflödet genom att arrangera kritiska steg (datainsamling, databearbetning, skrivande, scenen rörelse) arbetar parallellt; anställa en parallell OCT imaging med en utrymme-uppdelning multiplexering setup52. Med systemoptimering, hög genomströmning OCT systemet kan utnyttjas i cancer läkemedelsutveckling samt karakterisering av andra 3D bio-fabricerade prover (t.ex., 3D vävnad organoids) för olika biomedicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna uppge ingen konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NSF beviljar IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH grants R21EY026380, R15EB019704 och R01EB025209 och Lehigh University startup fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
| Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
| 2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
| Reference Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Focusing Lens | Thorlabs | ||
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| 1D Translational Stage | Thorlabs | ||
| Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Sample Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Galvanometer | Thorlabs | ||
| Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
| Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| Objective | Mitutoyo | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Polarization Controller | Thorlabs | ||
| 30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
| Cage Rod | Thorlabs | ||
| Stage | |||
| 3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
| 2D Tilting Stage | |||
| Rotation Stage | |||
| Plate Holder | 3D printed | ||
| Spectrometer | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
| F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
| InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Component | |||
| HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
| Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
| Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
| Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
| Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
| Gloves | VWR | 89428-750 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
| Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
| Microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology & IHC | |||
| Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
| Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Commerical OCTs | |||
| SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
| SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software for Data Analyses | |||
| Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
| 3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
| 3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
| OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
| Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
| OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
| Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |
References
- WHO. Cancer. , Available from: http://www.who.int/cancer/en/ (2018).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Tung, Y. -C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
- Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348 (2015).
- Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
- Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846 (2016).
- Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
- Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412 (2014).
- Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), OCT1-OCT13 (2016).
- Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
- Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography: technology and applications. , Springer Science, Business Media. (2008).
- Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171 (2011).
- Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve - a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
- van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
- Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
- de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
- Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
- Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
- Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
- Spalteholz, W. Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , Verlag von S. Hirzel. (1911).
- Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331 (2007).
- Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
- Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , International Society for Optics and Photonics. 85710Z (2013).
- Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
- Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
- Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
- Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
- Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).
