Tomografia a coerenza ottica (OCT), una tecnologia di imaging tridimensionale, è stata utilizzata per monitorare e caratterizzare la cinetica di crescita di sferoidi multicellulari del tumore. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore usando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto morto privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica, sono stati dimostrati.
Sferoidi di tumore sono stati sviluppati come un modello di cultura tridimensionale (3D) delle cellule nella scoperta della droga del cancro ricerca e anti-cancro. Tuttavia, attualmente, modalità di formazione immagine ad alta velocità che utilizza il rilevamento di campo o fluorescenza brillante, si riesce a risolvere la struttura nel complesso 3D della sferoide di tumore a causa della limitata penetrazione della luce, diffusione di coloranti fluorescenti e profondità-possibilità di risoluzione. Recentemente, il nostro laboratorio ha dimostrato l’uso della tomografia a coerenza ottica (OCT), un’etichetta-free e non-distruttivo modalità, per eseguire la caratterizzazione longitudinale di sferoidi multicellulari del tumore in una piastra a 96 pozzetti di imaging 3D. OCT è stato in grado di ottenere informazioni morfologiche e fisiologiche 3D di sferoidi tumore cresce fino a circa 600 µm in altezza. In questo articolo, dimostriamo un sistema di imaging OCT (HT-OCT) ad alta velocità che analizza il piatto intero multi-pozzetto e ottiene automaticamente dati 3D OCT di sferoidi del tumore. Descriviamo i dettagli degli orientamenti HT-OCT sistema e costruzione nel protocollo. Dai dati OCT 3D, si può visualizzare la struttura complessiva della sferoide con 3D rendering e sezioni ortogonali, caratterizzano la curva di crescita longitudinale della sferoide di tumore sulla base delle informazioni morfologiche di dimensione e volume e monitorare la crescita delle le regioni di morti-cellula nella sferoide di tumore basato sul contrasto di attenuazione ottica intrinseca. Mostriamo che HT-OCT utilizzabile come una modalità di imaging ad alta produttività per la droga di screening come pure che caratterizzano i campioni biofabricated.
Il cancro è la seconda causa di morte nel mondo1. Lo sviluppo di farmaci targeting per cancro è di cruciale importanza per i pazienti. Tuttavia, si stima che oltre il 90% di nuovi farmaci anti-cancro non riuscire in fase di sviluppo a causa di una mancanza di efficacia e tossicità inattesa in studi clinici2. Parte della ragione può essere attribuita all’uso di modelli della coltura semplice cellulare bidimensionale (2D) per lo screening di composto, che forniscono risultati limitati valori predittivi di composto efficacia e tossicità per le seguenti fasi di drug discovery2 , 3 , 4. recentemente, tridimensionale (3D) tumore sferoide modelli sono stati sviluppati per fornire i dati fisiologici e farmacologici clinicamente rilevanti per farmaco anti-cancro discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Poiché questi sferoidi possono imitare il tessuto-specifica proprietà di tumori in vivo, quali nutrienti e l’ossigeno gradiente, hypoxic nucleo così come farmaco resistenza19, l’uso di questi modelli potenzialmente possibile abbreviare droga scoperta sequenze temporali, ridurre i costi di investimento e portare nuovi farmaci ai pazienti in modo più efficace. Un approccio critico alla valutazione dell’efficacia di composto in fase di sviluppo di tumore 3D sferoide è monitorare la crescita della sferoide e ricorrenza sotto trattamenti9,26. Per effettuare questa operazione, caratterizzazioni quantitative della morfologia del tumore, che coinvolge il suo diametro e volume, con modalità di imaging ad alta risoluzione, sono di importanza fondamentale.
Modalità di imaging convenzionale, come campo chiaro, contrasto fase7,9,22,24e fluorescenza microscopia8,9,16, 18,22 può fornire una misura del diametro di sferoide ma non riesce a risolvere la struttura complessiva della sferoide nello spazio 3D. Molti fattori contribuiscono a queste limitazioni, tra cui la penetrazione della luce sondaggio in sferoide; diffusione delle tinture fluorescenti in sferoide; che emettono segnali fluorescenti da tinture fluorescenti eccitati all’interno o sulla superficie opposta di sferoide a causa di forte assorbimento e scattering; e profondità-possibilità di risoluzione di queste modalità di formazione immagine. Questo spesso porta a una misura di volume imprecise. Sviluppo del nucleo necrotico in sferoidi imita necrosi in vivo i tumori6,10,15,19,25. Questa caratteristica patologica è improbabile riprodotto in 2D cell culture19,25,27,28. Con una dimensione di sferoide superiore a 500 µm di diametro, una struttura a tre strati concentrica, tra cui uno strato esterno delle cellule di proliferazione, uno strato intermedio di cellule quiescenti e un core necrotico, può essere osservato in sferoide6,10 ,15,19,25, per mancanza di ossigeno e sostanze nutritive. Formazione immagine di fluorescenza cellulare vivi e morti è l’approccio standard per etichettare il contorno del nucleo necrotico. Tuttavia, ancora una volta, penetrazioni di questi coloranti fluorescenti e la luce visibile e ostacolare il potenziale per sondare il nucleo necrotico per monitorare il suo sviluppo nella sua forma attuale.
Un’alternativa 3D modalità di imaging, tomografia a coerenza ottica (OCT) è stato introdotto per caratterizzare le sferoidi di tumore. L’OCT è una tecnica di imaging biomedicina che è in grado di acquisire dati 3D privo di etichetta, non distruttive da fino a 1-2 mm profondità nei tessuti biologici29,30,31,32,33 ,34. L’OCT impiega interferometria di basso-coerenza per rilevare i segnali sparsi indietro da diverse profondità del campione e fornisce immagini ricostruite risolta in profondità a livello di micron risoluzioni spaziali in direzione laterale e verticale. OCT è stato ampiamente adottato in Oftalmologia35,36,37 e angiografia38,39. Gli studi precedenti hanno usato OCT di osservare la morfologia in vitro di sferoidi di tumore nella matrice della membrana basale (ad es., Matrigel) e valutare le loro risposte alla terapia fotodinamica40,41. Recentemente, il nostro gruppo istituito una piattaforma di imaging OCT ad alta produttività per monitorare e quantificare la cinetica di crescita di sferoidi 3D del tumore in piastre multi-pozzetto42sistematicamente. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore 3D utilizzando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto necrotico privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica sono stati dimostrati. Questo articolo descrive i dettagli di come la piattaforma di imaging OCT è stata costruita e impiegata per ottenere immagini ad alta risoluzione 3D di sferoidi del tumore. Le dettagliate analisi quantitativa della cinetica di crescita di sferoidi 3D del tumore, tra cui misure accurate di diametro sferoide e volumi, è descritto. Inoltre, il metodo di rilevazione non distruttiva delle regioni di tessuto necrotico mediante OCT, basata sul contrasto intrinseco attenuazione ottica è presentato.
Attività del tumore è molto importante per la sua struttura morfologica. Simile alla curva di crescita caratteristici per colture cellulari 2D di monitoraggio, rilevamento la curva di crescita per sferoidi 3D del tumore è anche un approccio convenzionale per caratterizzare il comportamento di crescita a lungo termine della sferoide per differenti linee cellulari. In particolare, noi possiamo caratterizzare la risposta di droga analizzando la degradazione del tumore o ricrescita del tumore riflettuto direttamente la cu…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da NSF concede IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), fondo di avvio di NIH sovvenzioni, R21EY026380, R15EB019704 e R01EB025209 e Lehigh University.
Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
Reference Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Focusing Lens | Thorlabs | ||
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
1D Translational Stage | Thorlabs | ||
Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Sample Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Galvanometer | Thorlabs | ||
Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
Objective | Mitutoyo | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Polarization Controller | Thorlabs | ||
30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
Cage Rod | Thorlabs | ||
Stage | |||
3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
2D Tilting Stage | |||
Rotation Stage | |||
Plate Holder | 3D printed | ||
Spectrometer | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Component | |||
HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
Gloves | VWR | 89428-750 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
Microscope | Olympus | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Histology & IHC | |||
Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
List of Commerical OCTs | |||
SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software for Data Analyses | |||
Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |