광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.
종양 spheroids 암 연구 및 항 암 신약의 3 차원 (3D) 세포 문화 모델 개발 되었습니다. 그러나, 현재, 높은 처리량 modalities 이미징 밝은 필드 또는 형광 탐지를 활용 하 여 수 없습니다 제한 된 빛이 침투, 형광 염료의 확산으로 인해 종양 회전 타원 체의 전반적인 3D 구조를 해결 하 고 깊이-resolvability. 최근, 우리 실험실 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 레이블 및 비 파괴적인 3D 96 잘 접시에 다세포 종양 spheroids의 경도 특성 분석을 수행 하려면 양식 적임 이미징의 사용을 시연 했다. 10 월은 높이 약 600 µ m까지 성장 하는 종양 spheroids의 3D 형태학 상과 생리 적인 정보를 얻는 능력. 이 문서에서는, 높은 처리량 (HT-10 월) 10 월 이미징 시스템을 전체 다 잘 판 검사 및 종양 spheroids의 3D 10 월 데이터를 자동으로 가져옵니다 설명 합니다. 프로토콜에 HT-10 월 시스템 및 건설 지침의 세부 사항을 설명합니다. 3D 10 월 데이터에서 하나 3d 렌더링은 회전 타원 체의 전체 구조를 시각화할 수 및 직교 분할 영역 크기와 볼륨의 형태학 정보에 따라 종양 회전 타원 체의 경도 성장 곡선을 특성화 고의 성장 모니터링 광학 내장 감쇄 대비에 따라 종양 회전 타원 체에 죽은 셀 영역입니다. 우리는 약물 검사로 biofabricated 샘플을 특성화에 대 한 HT-10 월에는 높은 처리량 이미징 형식으로 사용할 수 있습니다 보여줍니다.
암은 세계1죽음의 두 번째 주요 원인. 암을 대상으로 하는 약물을 개발 하는 것은 환자에 대 한 중요 한 중요성 의입니다. 그러나, 그것은 새로운 항 암 약의 90% 이상 효능과 임상 실험2에서 예기치 않은 독성의 부족 때문에 개발 단계에서 실패 추정. 이유의 일부는 약 발견2 의 다음 단계에 대 한 복합 효능 및 독성의 예측 값이 제한 된 결과 제공 하는 복합 심사에 대 한 간단한 2 차원 (2D) 세포 문화 모델의 사용에 표시 될 수 있습니다. , 3 , 4. 최근 3 차원 (3D) 종양 회전 타원 체 모델 항 암 약물 발견3,,45 에 대 한 임상 관련 생리 및 약리 데이터를 제공 하도록 개발 되었습니다 6,7,,89,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,,2122,23, 24,25. 때문에 이러한 spheroids 종양에서 vivo에서의 조직-특정 속성을 흉내낼 수 있다, 영양소와 산소 등 약물 저항19를 이러한 모델의 사용 뿐만 아니라 그라데이션, hypoxic 코어 수 잠재적으로 단축 약물 발견 타임 라인, 투자 비용을 절감 하 고 보다 효과적으로 환자에 게 신약을가지고. 중요 한 방법 중 하나 3D 종양 회전 타원 체 개발에 복합 효능 평가 모니터링 회전 타원 체 성장과 재발 치료9,26에서 것입니다. 이렇게 종양 형태, 그것의 직경 및 고해상도 이미징 형식으로 볼륨의 양적 characterizations 필수적입니다.
밝은 분야, 위상 대비7,9,,2224, 형광 현미경 검사 법8,,916, 등 기존의 이미징 형식 18,22 회전 타원 체의 직경의 측정을 제공할 수 있지만 3 차원 공간에서 회전 타원 체의 전체 구조를 확인할 수 없습니다. 회전 타원 체; 프로브 빛의 침투를 포함 하 여 이러한 제한에 기여 하는 많은 요인 회전 타원 체;에 형광 염료의 확산 내부 또는 강한 흡수 및 산란; 회전 타원 체의 반대 표면에 흥분된 형광 염료에서 발광 형광 신호 그리고 이러한 깊이 resolvability 이미징 형식. 이 종종 부정확 한 볼륨 측정 리드. Spheroids에서 괴 사 성 코어의 개발 vivo에서 종양6,10,15,,1925괴 사를 모방합니다. 이 병 적인 특징은 2D 셀 문화19,25,,2728에서 가능성이. 500 µ m 직경, 3 층 동심 구조 보다는 더 큰 회전 타원 체 크기와 증식 세포의 외부 층, 무부하 셀, 중간 계층 및 회 저 성 코어를 포함 하 여 관찰 될 수 있다 회전 타원 체6,10 ,15,,1925, 산소와 영양분의 부족으로 인해. 라이브 및 죽은 세포 형광 이미징 괴 코어의 경계를 접근 하는 표준 방식입니다. 그러나, 다시,이 형광 염료와 가시광선의 침투의 실제 형태로 개발 모니터링 하 괴 코어로 검색을 방해.
대체 3D 적임 이미징, 종양 spheroids 하 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 도입 되었습니다. 10 월은 수 있는 레이블 무료, 비-파괴적인 3D 데이터에서 최대 바이오 메디컬 이미징 기술 1-2 mm 깊이 생물 조직29,30,31,,3233 34. 10 월 샘플의 다른 깊이에서 다시 흩어져 신호 낮은 일관성 간섭계를 사용 하 여 고 가로 세로 방향에서 마이크론 수준의 공간 해상도에서 재건된 깊이 해결 이미지를 제공 합니다. 10 월 안과35,,3637 그리고 제품은38,39에 널리 채택 되었습니다. 이전 연구는 관찰 하 생체 외에서 의 형태 (예를 들어, Matrigel) 지하실 멤브레인 매트릭스에 종양 spheroids 고 photodynamic 치료40,41에 대 한 그들의 응답을 평가 10 월을 사용 했습니다. 최근, 우리의 그룹 체계적으로 모니터링 하 고 다 잘 플레이트42에 3D 종양 spheroids의 성장 활동을 계량 높은 처리량 10 월 영상 플랫폼을 설립. 접근 및 레이블 없는 괴 사 성 조직 감지 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 복을 사용 하 여 3D 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다. 이 종이 어떻게 OCT 영상 플랫폼 건설 되었고 종양 spheroids의 고해상도 3D 이미지를 고용의 세부 사항을 설명 합니다. 회전 타원 체 직경 및 볼륨의 정확한 측정을 포함 하 여 3 차원 종양 spheroids의 성장 활동의 단계별 정량 분석은 기술 된다. 또한, 내장 광 감쇠 대비에 따라 OCT를 사용 하 여 괴 사 성 조직 영역의 비파괴 탐지의 방법은 제공 됩니다.
종양 활동은 매우 그것의 형태학 상 구조에 관련이 있다. 유사한 특성 성장 곡선 2D 셀 문화에 대 한 모니터링, 3D 종양 spheroids에 대 한 성장 곡선을 추적 이다 또한 다른 세포에 대 한 장기적인 회전 타원 체 성장 동작에 대 한 기존의 접근. 특히, 우리 종양 저하 또는 직접 성장 곡선에 반영 하는 종양 재 성장을 분석 하 여 약물 응답을 특징 수 있습니다. 따라서, 3 차원 종양 spheroids, 크기, 볼륨, 성장…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NSF에 의해 지원 되었다 IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR를 부여-TT (IIP-1640707), NIH 교부 금, R21EY026380, R01EB025209, R15EB019704 및 Lehigh 대학 시작 기금.
Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
Reference Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Focusing Lens | Thorlabs | ||
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
1D Translational Stage | Thorlabs | ||
Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Sample Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Galvanometer | Thorlabs | ||
Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
Objective | Mitutoyo | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Polarization Controller | Thorlabs | ||
30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
Cage Rod | Thorlabs | ||
Stage | |||
3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
2D Tilting Stage | |||
Rotation Stage | |||
Plate Holder | 3D printed | ||
Spectrometer | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Component | |||
HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
Gloves | VWR | 89428-750 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
Microscope | Olympus | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Histology & IHC | |||
Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
List of Commerical OCTs | |||
SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software for Data Analyses | |||
Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |