Optisk koherenstomografi (OCT), en tredimensionell bildteknik, användes till att övervaka och karaktärisera tillväxt kineticsen av flercelliga tumör spheroids. Exakt volymetriska kvantifiering av tumör spheroids använder en voxel räknar strategi och etikett-fri död vävnad upptäckt i de spheroids baserat på inneboende optisk dämpning däremot påvisades.
Tumör spheroids har utvecklats som en tredimensionell (3D) cell kultur modell av cancer forskning och anti-cancer läkemedelsutveckling. Dock hög genomströmning imaging modaliteter utnyttja ljusa fält eller fluorescens upptäckt, för närvarande inte kan lösa övergripande 3D-strukturen för den tumör sfäroid på grund av begränsad ljuspenetrering, diffusion av fluorescerande färgämnen och djup-potentiellt. Vårt labb visade nyligen, användning av optisk koherenstomografi (OCT), en etikett-fri och icke-förstörande 3D imaging modalitet, för att utföra längsgående karakterisering av flercelliga tumör spheroids i en plattan med 96 brunnar. OCT kunde få 3D morfologiska och fysiologiska information för tumör spheroids växer upp till ca 600 µm i höjd. I denna artikel visar vi en hög genomströmning okt (HT-okt) bildsystem som genomsöker hela flera väl plattan och erhåller 3D OCT-data av tumör spheroids automatiskt. Vi beskriva detaljerna i HT-okt system och konstruktion riktlinjerna i protokollet. Från den 3D OCT-data, en kan visualisera den övergripande strukturen på sfäroid med 3D-renderade och ortogonala skivor, karakterisera längsgående tillväxtkurvan den tumör sfäroid baserat på morfologiska information om storlek och volym och övervaka tillväxten av de döda-cell regionerna i den tumör sfäroid baserat på optisk inneboende dämpning kontrast. Vi visar att HT-ULT kan användas som en hög genomströmning bildgivande modalitet för drug screening samt karaktärisera biofabricated prover.
Cancer är den näst vanligaste orsaken till dödsfall i världen1. Utveckla läkemedel inriktning cancer är av avgörande betydelse för patienter. Dock är det beräknat att mer än 90% av nya anti-cancer läkemedel misslyckas i utvecklingsfasen brist på effekt och oväntad toxicitet i kliniska prövningar2. En del av orsaken kan hänföras till användningen av enkel tvådimensionell (2D) cell kultur modeller för sammansatta screening, som ger resultat med begränsade prediktiva värden av sammansatta effekt och toxicitet för de följande stadierna av drug discovery2 , 3 , 4. nyligen, tredimensionella (3D) tumör sfäroid modeller har utvecklats för att ge kliniskt relevanta fysiologiska och farmakologiska data för anti-cancer drug discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Eftersom dessa spheroids kan härma vävnad-specifika egenskaper för tumörer i vivo, såsom näringsämnen och syre kan gradient, hypoxisk kärna samt drog resistens19, användningen av dessa modeller potentiellt förkorta drug discovery tidslinjer, minska kostnaderna för investeringar och få nya läkemedel till patienter mer effektivt. Ett kritiskt förhållningssätt till utvärdera sammansatta effekt i 3D tumörutveckling sfäroid är att övervaka sfäroid tillväxt och återkommande under behandlingar9,26. Gör detta genom är kvantitativa karakteriseringar av tumör morfologi, som inbegriper dess diameter och volym, med högupplösta avbildningsmetoder, absolut nödvändigt.
Konventionella avbildningsmetoder, såsom ljusa fält, fas kontrast7,9,22,24och fluorescence mikroskopi8,9,16, 18,22 kan ge ett mått på den sfäroid diameter men inte kan lösa den övergripande strukturen på sfäroid i 3D-rymden. Många faktorer bidrar till dessa begränsningar, inklusive penetration av sondering ljuset i sfäroid; diffusion av fluorescerande färgerna i sfäroid; avger fluorescerande signaler från glada fluorescerande färgämnen inuti eller på den motsatta ytan sfäroid på grund av stark absorption och spridning; och djup-avveckling av dessa imaging modaliteter. Detta leder ofta till en felaktig volymmätning. Utvecklingen av nekrotisk kärnan i spheroids härmar nekros i i vivo tumörer6,10,15,19,25. Patologiska funktionen är osannolikt reproduceras i 2D cell kulturer19,25,27,28. Med en sfäroid storlek större än 500 µm i diameter, en trelagers koncentriska struktur, kan inklusive ett yttre lager av prolifererande celler, ett mellanlager av quiescent celler och en nekrotisk kärna, observeras i sfäroid6,10 ,15,19,25, på grund av brist på syre och näringsämnen. Levande och döda cellen fluorescens bildbehandling är standardmetoden att märka gränsen av nekrotisk kärnan. Dock igen, hindra genomföringar av både dessa fluorescerande färger och synligt ljus potential att sond i nekrotisk kärnan att övervaka dess utveckling i sin riktiga form.
En alternativ 3D imaging modalitet, införs optisk koherenstomografi (OCT) för att karakterisera de tumör spheroids. OCT är en biomedicinsk imaging teknik som kan förvärva etikett-fri, icke-förstörande 3D data från upp till 1-2 mm djup i biologiska vävnader29,30,31,32,33 ,34. OCT sysselsätter låg-coherence interferometri att upptäcka bakåtspritt signaler från olika djup av provet och ger rekonstruerade djup-löst bilder på micron-nivå rumsliga upplösningar i både laterala och vertikala riktningar. OCT har allmänt antagits i oftalmologi35,36,37 och angiografi38,39. Tidigare studier har använt OCT att iaktta morfologi av in vitro- tumör spheroids i basalmembranet matris (t.ex., Matrigel) och utvärdera sina svar till fotodynamisk terapi40,41. Nyligen har föreligga vår grupp en hög genomströmning OCT imaging plattform för att systematiskt övervaka och kvantifiera tillväxten kineticsen av 3D tumör spheroids i plattor med flera42. Exakt volymetriska kvantifiering av 3D tumör spheroids använder en voxel räknar strategi och etikett-fri nekrotisk vävnad upptäckt i de spheroids baserat på inneboende optisk dämpning kontrast visades. Detta dokument beskriver detaljerna i hur OCT imaging plattformen uppfördes och anställda att få högupplösta 3D-bilder av tumör spheroids. De stegvisa kvantitativa analyserna av tillväxt kineticsen av 3D tumör spheroids, inklusive noggranna mätningar av sfäroid diameter och volymer, beskrivs. Dessutom presenteras metoden för icke-destruktiv detektering av nekrotisk vävnad regioner använder ULT, baserat på inneboende optisk dämpning kontrasten.
Tumöraktivitet är mycket relevanta för dess morfologiska struktur. Liknar övervakning karakteristiska tillväxtkurvan för 2D cellkulturer, spåra tillväxtkurvan för 3D tumör spheroids är också en konventionell metod att karakterisera den långsiktiga sfäroid tillväxt beteenden för olika cellinjer. Bland annat kan vi karakterisera den narkotika Svaren genom att analysera tumör försämring eller tumör återväxt direkt återspeglas i tillväxtkurvan. Kvantitativ bedömning av 3D tumör spheroids, inklusive …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NSF beviljar IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH grants R21EY026380, R15EB019704 och R01EB025209 och Lehigh University startup fonden.
Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
Reference Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Focusing Lens | Thorlabs | ||
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
1D Translational Stage | Thorlabs | ||
Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Sample Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Galvanometer | Thorlabs | ||
Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
Objective | Mitutoyo | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Polarization Controller | Thorlabs | ||
30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
Cage Rod | Thorlabs | ||
Stage | |||
3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
2D Tilting Stage | |||
Rotation Stage | |||
Plate Holder | 3D printed | ||
Spectrometer | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Component | |||
HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
Gloves | VWR | 89428-750 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
Microscope | Olympus | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Histology & IHC | |||
Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
List of Commerical OCTs | |||
SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software for Data Analyses | |||
Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |