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Bioengineering

एक tripeptide-oleic एसिड के स्थिर नैनोपायस

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

यह प्रोटोकॉल एक ओलिक एसिड का एक नैनोपायस synthesize करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है-प्लैटिनम (द्वितीय) संयुग्मी एक lysine के साथ स्थिर-tyrosine-फेनीलानिन (kyf) tripeptide. काइफ और संयुग्मी के स्व-असेंबली के माध्यम से हल्के सिंथेटिक शर्तों के तहत नैनोइमल्शन रूपों ।

Abstract

हम एक विधि एक ओलिक एसिड से बना नैनोपायस का उत्पादन करने के लिए का वर्णन-पीटी (द्वितीय) कोर और एक lysine-tyrosine-फेनिल (kyf) कोटिंग (kyf-Pt-NE). kyf-पीटी-पूर्वोत्तर encapsulates पीटी (द्वितीय) पर 10 wt.%, १०७ ± 27 एनएम और एक नकारात्मक सतह के आरोप का एक व्यास है । kyf-Pt-NE पानी में और सीरम में स्थिर है, और जैविक रूप से सक्रिय है । kyf के लिए एक फ्लोरोफोर के विकार एक फ्लोरिसेंट नैनोपायस कि जैविक इमेजिंग के लिए उपयुक्त है के संश्लेषण की अनुमति देता है । नैनोपायस के संश्लेषण एक जलीय वातावरण में किया जाता है, और kyf-पीटी-पूर्वोत्तर रूपों के माध्यम से आत्म एक छोटी kyf पेप्टाइड और एक ओलिक एसिड की विधानसभा-प्लैटिनम (द्वितीय) संयुग्मी । स्व-असेंबली प्रक्रिया समाधान के तापमान पर निर्भर करती है, सबस्ट्रेट्स का मोलर अनुपात, और सब्सट्रेट के अतिरिक्त प्रवाह की दर । महत्वपूर्ण चरणों में संश्लेषण के दौरान इष्टतम सरगर्मी दर को बनाए रखना, आत्म-विधानसभा के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देना, और नैनोपायस को पहले से ध्यान में रखते हुए एक केन्द्रापसारक संकेंद्रक में शामिल हैं ।

Introduction

हाल के वर्षों में, वहां दवा वितरण और bioimaging1,2,3,4के रूप में ऐसे जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए नैनोकणों की इंजीनियरिंग में रुचि बढ़ गया है । nanoparticle के multifunctionality आधारित प्रणालियों अक्सर एक निर्माण के भीतर कई घटकों को शामिल करने की जरूरत है । इमारत ब्लॉकों कि लिपिड या पॉलिमर पर आधारित होते हैं अक्सर उनके भौतिक रासायनिक गुणों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके biocompatibility और biodegradability है, जो अंततः नैनोस्ट्रक्चर1के समारोह को प्रभावित हो सकता है के रूप में अलग, 5,6. biologically व्युत्पन्न सामग्री, जैसे प्रोटीन और पेप्टाइड, लंबे समय उनके अनुक्रम लचीलापन7,8के कारण multifunctional नैनोसंरचनाओं के होनहार घटकों के रूप में पहचाना गया है. पेप्टाइड्स स्व-उच्च का आदेश दिया अणुकणिका आर्किटेक्चर पेचदार रिबन9,10, रेशेदार मचानों11,12, और कई और अधिक, इस प्रकार के निर्माण के लिए रास्ता फ़ंग बनाने में इकट्ठा बायोमोलेकुले आधारित संकर नैनोसंरचनाएं एक नीचे-अप दृष्टिकोण13का उपयोग कर ।

पेप्टाइड्स चिकित्सा और जैव प्रौद्योगिकी में अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से एंटीकेन्सर थेरेपी14 और हृदय रोगों के लिए पता लगाया गया है15 के रूप में अच्छी तरह के रूप में एंटीबायोटिक विकास के लिए16,17, चयापचय 18विकारों, और संक्रमण19। नैदानिक परीक्षणों से गुजर रहे छोटे पेप्टाइड चिकित्सा विज्ञान के एक सौ से अधिक हैं20. पेप्टाइड्स को संशोधित करने के लिए आसान कर रहे हैं और कम लागत पर synthesize करने के लिए तेजी से. इसके अलावा, वे biodegradable हैं, जो बहुत अपने जैविक और दवा आवेदन21,22की सुविधा । संरचनात्मक घटकों के रूप में पेप्टाइड्स का उपयोग नियंत्रित रिहाई के लिए उत्तरदायी, पेप्टाइड आधारित नैनोकणों और हाइड्रोजेल डिपो के इंजीनियरिंग शामिल हैं23,24,25,26 , 27, पेप्टाइड आधारित बायोसेंसर28,29,30,31, या बायो-इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों३२,३३,३४. महत्वपूर्ण बात, यहां तक कि कम पेप्टाइड्स दो या तीन एमिनो-एसिड अवशेषों कि फेनिलएलनिन शामिल करने के लिए स्वयं-असेंबली प्रक्रियाओं३५,३६,३७ मार्गदर्शन करने के लिए पाए गए थे और स्थिर इमल्शन बनाने के लिए३८ .

प्लैटिनम आधारित दवाओं, उनकी उच्च प्रभावकारिता के कारण, कई कैंसर उपचार regimens में उपयोग किया जाता है, दोनों अकेले और संयोजन में अन्य एजेंटों के साथ३९,४०. प्लैटिनम यौगिकों monogating और intrastrand या interstrand पार लिंक बनाने के द्वारा डीएनए क्षति प्रेरित । पीटी-डीएनए घावों को सेलुलर मशीनरी द्वारा पहचाना जाता है और, यदि मरम्मत नहीं किया जाता है, तो सेलुलर एपोप्टोसिस का नेतृत्व करें । सबसे महत्वपूर्ण तंत्र, जिसके द्वारा पीटी (II) कैंसर कोशिका मृत्यु में योगदान देता है, डीएनए ट्रांसक्रिप्शन४१,४२का निषेध है । हालांकि, प्लैटिनम थेरेपी का लाभ पीटी (द्वितीय) की प्रणालीगत विषाक्तता से कम हो जाता है जो गंभीर साइड इफेक्ट को ट्रिगर करता है । यह पीटी (द्वितीय)४३, जो अक्सर डीएनए तक पहुंचने प्लेटिनम की उप चिकित्सीय सांद्रता में परिणाम के नैदानिक खुराक कम होता है । एक परिणाम के रूप में, डीएनए मरंमत कि इस प्रकार के कैंसर सेल के अस्तित्व के लिए योगदान देता है और पीटी (द्वितीय) प्रतिरोध प्राप्त करने । प्लेटिनम chemo-प्रतिरोध कैंसर विरोधी चिकित्सा में एक बड़ी समस्या है और उपचार विफलता४४,४५का मुख्य कारण है ।

हम एक स्थिर नैनोसिस्टम विकसित किया है कि पीटी (द्वितीय) एजेंट encapsulates क्रम में प्रणालीगत परिसंचरण में एक परिरक्षण प्रभाव प्रदान करने के लिए और पीटी (द्वितीय) को कम करने के लिए प्रेरित साइड इफेक्ट । प्रणाली एक ओलिक एसिड पर आधारित है-पीटी (द्वितीय) कोर एक kyf tripeptide के साथ स्थिर करने के लिए एक नैनोपायस (kyf-Pt-NE)४६फार्म का । kyf के बिल्डिंग ब्लॉक-पीटी-पूर्वोत्तर, tripeptide के एमिनो एसिड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ओलिक एसिड, आम तौर पर सुरक्षित (gras) खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) के साथ स्थिति के रूप में मांयता प्राप्त है । kyf-Pt-NE एक nanopरेसिसिटेशन विधि४७का उपयोग करके तैयार किया जाता है । संक्षेप में, ओलिक एसिड-पीटी (द्वितीय) संयुग्मी एक कार्बनिक विलायक में भंग कर दिया है और फिर एक जलीय kyf समाधान के लिए बिंदुश: जोड़ा (चित्र 1) पर ३७ ° c । समाधान के लिए कई घंटे के लिए उभारा-kyf-Pt-NE के विधानसभा आत्म अनुमति है । नैनोपायस 10 केडीए केन्द्रापसारक सांद्रता में केंद्रित है और पानी के साथ तीन बार धोया जाता है । एक fluorophore के साथ kyf के रासायनिक संशोधन फ्लोरोसेंट fitc-kyf-पीटी-NE बायोमेडिकल इमेजिंग के लिए उपयुक्त के संश्लेषण की अनुमति देता है ।

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Protocol

1. oleic एसिड का संश्लेषण – प्लैटिनम (द्वितीय) संयुग्मी

  1. सिस्प्लेटिन का सक्रियण
    1. सस्पेंड ५० एमजी (०.१६७ mmol) सिस्प्लेटिन के 4 मिलीलीटर पानी में (उदाहरण के लिए, नैनोप्योर) ६० डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. सिस्प्लेटिन के समाधान के लिए पानी की ०.५ मिलीलीटर में agno3 के बिंदुश: ५५.२ मिलीग्राम (०.३२५ mmol) जोड़ें और ६० डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 एच के लिए प्रतिक्रिया हलचल । agcl के सफेद वेग प्रतिक्रिया की प्रगति का संकेत फार्म होगा ।
    3. यह निर्धारित करने के लिए कि सक्रियण प्रतिक्रिया पूर्ण हो गई है, समाधान में निःशुल्क Ag+ आयन की उपस्थिति के लिए 10% HCl के साथ परीक्षण करें । परीक्षण नकारात्मक होना चाहिए (कोई अतिरिक्त agcl हाला फार्म चाहिए) ।
    4. 10 मिनट के लिए ३,२२० एक्स जी पर प्रतिक्रिया मिश्रण अपकेंद्रिका और agcl के सफेद हाला हटा दें ।
    5. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और यह एक ०.२ मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर । sncl2 क्रिस्टल के लिए pasteur पिपेट के माध्यम से समाधान के 2-3 बूंदें लागू करने से प्लेटिनम की उपस्थिति के लिए सतह पर तैरनेवाला परीक्षण । परीक्षण सकारात्मक है अगर प्लेटिनम के साथ टिन के समंवय जटिल का रंग गहरा पीला/
    6. दूसरे चरण के लिए सक्रिय पीटी (द्वितीय) के साथ सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें ।
  2. सक्रिय पीटी (द्वितीय) के साथ ओलिक एसिड की प्रतिक्रिया
    1. सस्पेंड ९४.२ ओलिक एसिड (०.३३३ mmol) के 3 मिलीलीटर पानी में ६० डिग्री सेल्सियस पर मिलीग्राम ।
    2. 1 मिलीलीटर पानी में १३.३ मिलीग्राम (०.३३३ mmol) जोड़ें, और चरण १.१ से सक्रिय पीटी (द्वितीय) के समाधान के साथ मिलाएं
    3. ६० डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए प्रतिक्रिया हलचल और कमरे के तापमान पर अगले रात भर । कच्चा उत्पाद एक तेल भूरा/पीला हाला है ।
    4. 10 मिनट के लिए ३,२२० एक्स जी पर प्रतिक्रिया मिश्रण अपकेंद्रिकी और supernatant को हटा दें । एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर 25 डिग्री सेल्सियस पर कच्चे उत्पाद सूखी । acetonitrile के साथ कई बहाकर द्वारा उत्पाद को शुद्ध । शुद्ध ओलिक एसिड के अंतिम रंग-पीटी (द्वितीय) संयुग्मी पीला पीला है ।

2. kyf-pt-ne का संश्लेषण, और fitc-लेबल नैनोइमल्शन fitc-kyf-pt-ne

  1. kyf tripeptide के संश्लेषण और प्रतिदीप्ति tripeptide फिक-kyf लेबल
    1. मानक ठोस राज्य पेप्टाइड रसायन विज्ञान का उपयोग कर kyf synthesize । प्रत्येक एमिनो एसिड संलग्न करने के लिए निम्न मानक युग्मन शर्तों का उपयोग करें: वैंग राल (२.१९ mmol), fmoc संरक्षित एमिनो एसिड (४.३८ mmol), 2-(1h-benzotriazole-1-yl)-1, 1, 3, 3-टेट्रामेथाइलनियम tetrafluoroborate (tbtu) (४.३८ mmol) और diisopropylethylamine (dipea) (८.७६ ममोल) । dimethylformamide (dmf) और dipea में tbtu के साथ एमिनो एसिड भंग.
    2. का उपयोग करने से पहले 1 h के लिए dmf के 25 मिलीलीटर में fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl शराब राल (०.३८२ meq/g) के ५.७ g भिगोएँ ।
    3. एल के amine समूह deprotect-फेनिल एमिनो एसिड के साथ 15 मिलीलीटर 20% के लिए piperidine/dmf समाधान 5 मिनट के लिए, विलायक त्यागें और 20 मिनट चक्र के साथ धोने को दोहराएं ।
    4. निम्नलिखित सॉल्वैंट्स के साथ 1 मिनट के लिए राल धो लें: dmf, isopropyl शराब (आइपीएस), dmf, आइपीएस, dmf, आइपीएस, dmf, dmf. प्रत्येक धोने के बाद विलायक छोड़ें ।
    5. राल पर मुक्त एनएच2 समूह की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए कैसर परीक्षण प्रदर्शन (substeps देखें) और यदि सकारात्मक (राल बीज बैंगनी है), fmoc-L-tyrosine एमिनो एसिड जोड़ें और युग्मन रात भर प्रदर्शन.
      1. अलग बोतलों में कैसर परीक्षण समाधान तैयार करते हैं ।
      2. इथेनॉल के १०० मिलीलीटर में ninhydrin के 5 जी भंग ।
      3. इथेनॉल के 20 मिलीलीटर में phenol के ८० जी भंग ।
      4. पोटेशियम साइनाइड के ०.००१ मीटर जलीय घोल की 2 मिलीलीटर मिलाएं
        ९८ एमएल का पिरिडीन ।
      5. नमूना और उबलते पानी में गर्मी के लिए प्रत्येक कैसर परीक्षण समाधान के 2-3 बूंदें जोड़ें 5 मिनट के लिए ।
    6. दूसरा एमिनो एसिड के सफल युग्मन पर, कैसर परीक्षण प्रदर्शन और यदि नकारात्मक deprotection प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना (कदम 2.1.3 को 2.1.5). fmoc-फेनिल ऐमीनो एसिड के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं ।
      1. सभी एमिनो एसिड के युग्मन पर, dmf के 5 मिलीलीटर के साथ 1 मिनट के लिए राल धोने, आईपीए, dmf, मेथनॉल, डाइक्लोरोमेथेन और डाईएथिल ईथर, प्रत्येक धोने के विलायक त्याग के बाद. आगे की प्रक्रिया के लिए राल सहेजें.
      2. अगले चरणों के लिए राल के आधे का उपयोग करें (2.1.7-2.1.9) fitc के साथ पेप्टाइड को संशोधित करने के लिए. असंशोधित kyf tripeptide प्राप्त करने के लिए, 2.1.10 पर शुरू करने की प्रक्रिया का पालन करें ।
    7. केआईएफ के एन-टर्मिनल एमिनो एसिड को 6-एजीडोहेक्सानोइक एसिड के साथ kyf-N3 में संशोधित करें । इस अंत करने के लिए, मिक्स 1 जी (०.३८२ mmol) kyf वांग राल और की १२०.१ मिलीग्राम (०.७६४ mmol) 6-azidohexanoic एसिड के साथ २४५.२ मिलीग्राम (०.७६४ mmol) के tbtu और १९७.१ एमजी (१.५२८ mmol) की डीपीएफ में 30 मिलीलीटर की dmf. कमरे के तापमान पर रात भर प्रतिक्रिया हलचल ।
    8. एक क्लिक प्रतिक्रिया के माध्यम से प्रोपार्जिल फ्लोरेसेइन के साथ kyf-N3 के संश्लेषण से kyf-fitc प्राप्त करें । इस अंत करने के लिए, मिक्स २५३ एमजी (०.०९७ mmol) की kyf-N3 वांग राल के साथ ३.७८ मिलीग्राम (०.०१९ mmol) के cui ठोस, ७१.९ मिलीग्राम (०.१९३ mmol) प्रोपार्जिल फ्लोरेसेइन, और २.२४ एमजी (०.०१७ mmol) की dipea. रिएक्शन हरे से भूरे रंग में बदल जाना चाहिए ।
    9. 24 एच के बाद, 1 मिनट के लिए राल को दो बार dmf और आइपीएस के 5 मिलीलीटर के साथ पांच गुना, मेथनॉल और पानी तीन बार, डीएमएफ और पानी तीन बार, और डाइक्लोरोमेथेन और डाईएथिल ईथर के साथ तीन बार धोएं । प्रत्येक धोने के बाद विलायक छोड़ें ।
    10. 3 घंटे से अधिक 95/2.5/2.5 के अनुपात में (युक्तियाँ)/एच2ओ trifluoroacetic एसिड (tfa) के एक समाधान के साथ राल से kyf-fitc या काइफ पेप्टाइड सट ।
    11. एक ठंडे डाइएथिल ईथर में कच्चे पेप्टाइड को हाला, तीन बार ठंडे ईथर से धोएं, और फिर वैक्यूम के नीचे सूखा ।
  2. के संश्लेषण fitc-kyf-स्थिर नैनोपायस के साथ पीटी (द्वितीय) (fitc-kyf-पीटी-ne) और kyf-pt-ne
    1. 10 मिलीग्राम (०.०१२६ mmol) ओलिक एसिड के भंग – पीटी (द्वितीय) में १.५ मिलीलीटर isopropanol के संयुग्मी और एक 5 मिलीलीटर सिरिंज में जगह.
    2. ओलिक एसिड के साथ सिरिंज प्लेस-पीटी (द्वितीय) एक सिरिंज पंप में संयुग्मी और ०.१ मिलीलीटर के लिए प्रवाह सेट/
    3. आदेश में fitc-kyf-पीटी-पूर्वोत्तर synthesize करने के लिए, 1 मिलीग्राम (०.००१०५ mmol) के fitc-kyf और 1 मिलीग्राम (०.००२१९ mmol) की kyf (1:2 मोलर अनुपात के fitc-kyf: kyf) 20 मिलीलीटर पानी में और समाधान के तापमान को समायोजित करने के लिए ३७ ° c. fitc फ्लोरोफोर की फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कंटेनर की दीवारों को कवर करें । kyf-Pt-NE का संश्लेषण करने के लिए, 20 मिलीलीटर पानी में kyf tripeptide के 2 मिलीग्राम (०.००४४ mmol) भंग और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान के तापमान को समायोजित ।
    4. ओलिक एसिड जोड़ें-पीटी (द्वितीय) के लिए fitc-kyf/kyf या kyf tripeptide के समाधान के लिए बिंदुश: संयुग्मी । हुड के नीचे यह कदम प्रदर्शन ।
    5. समाधान कमरे के तापमान पर रातोंरात हलचल कार्बनिक सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना और स्वयं fitc के विधानसभा-kyf-पीटी-ne या kyf-pt-ne अनुमति देते हैं ।
    6. एक केन्द्रापसारक सांद्रित्र (10k mwco) में fitc-kyf-pt-ne या kyf-pt-ne ध्यान केंद्रित करें, और नैनोप्योर पानी के 4 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर kyf-पीटी-पूर्वोत्तर और fitc-kyf-पीटी-ne के जलीय समाधान स्टोर ।
    8. निर्माता की मार्गदर्शिका४८के बाद, परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (आस) का उपयोग करके प्लेटिनम सामग्री के लिए विश्लेषण करें ।
      1. अंशांकन वक्र के लिए 10% एचसीएल सॉल्यूशन में प्लेटिनम मानक तैयार करें (आस के लिए प्रभावी रेंज १०० से १,२०० पीपीबी (प्रति बिलियन पार्ट्स) के बीच है) ।
      2. के ५० μl भंग kyf-Pt-NE समाधान से कदम २.२ में १०० μl एक्वा regia (एक मिश्रण 3:1 केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड और नाइट्रिक एसिड) और कमरे के तापमान पर रात भर छोड़. 1 मिलीलीटर के अंतिम नमूना मात्रा तक पहुंचने के लिए ८५० μl पानी जोड़ें । आस का उपयोग कर नमूने का विश्लेषण करें । अंतिम एसिड एकाग्रता सभी विश्लेषण नमूनों में 10% होना चाहिए ।
      3. ppb में पीटी एकाग्रता के पढ़ने रिकॉर्ड, और नमूना में अंतिम प्लेटिनम सामग्री की गणना (नमूना कमजोर पड़ने और नैनोपायस की प्रारंभिक मात्रा के लिए खाते).

3. fitc के सेलुलर ऊपर की संनाभि इमेजिंग-kyf-Pt-NE

  1. बीज 6 डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G, और ES2), में 4 अच्छी तरह से कक्ष संनाभि व्यंजन में ४.७ एक्स के घनत्व पर 104 कक्षों प्रति कक्ष, और पूर्व संस्कृति रात भर में ३७ ° c.
  2. 24 एच के बाद, कोशिकाओं को फास्फेट बफर सेलाइन (पीबीएस) के साथ तीन बार धोएं और सेल कल्चर मीडियम में fitc-kyf-पॉइंट-NE के साथ सेते रहें (सेल लाइन विशिष्ट विवरणों के लिए चरण ६.१ देखें) 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस ।
  3. ऊष्मायन के बाद, मीडिया को हटाने और pbs के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोने ।
  4. 5 मिनट में-20 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंड मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ तीन बार धोएं ।
  5. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ०.१% triton-X के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पारगम्यज करें और पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं ।
  6. कमरे के तापमान पर पीबीएस में 1:50 कमजोर पड़ने पर Alexa fluor ६४७ (1 मिलीलीटर) के साथ LAMP1 के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ ९० मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं । इसके बाद, पीबीएस के साथ 3 बार कोशिकाओं को धोएं ।
  7. पतला dapi स्टॉक समाधान (1 mg/ml) पीबीएस में 1 मिलीग्राम/ फिर, प्रत्येक कक्ष के लिए पतला समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं । pbs के साथ 3 बार कोशिकाओं को धो लें ।
  8. माउंट बढ़ते मध्यम का उपयोग कर एक स्लाइड पर coverslips ।
  9. छवि ४०५ एनएम, ४८८ एनएम और ६३३ एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्घ्य में लाइव सेल संनाभि माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं । का पालन करें के रूप में पता लगाने के मापदंडों सेट: ०.२% से लेजर शक्ति और कोई अधिक से अधिक 1%, pinole 1 हवादार इकाई, लाभ मास्टर 650-750, डिजिटल ऑफसेट 0.
  10. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में छवि खोलें । प्रदर्शित छवि के तहत, ग्राफ़िक्स का चयन करें और स्केल पट्टी संमिलितकरें का चयन करने के लिए, छवि के लिए स्केलर पट्टी डालें ।

4. औषधि जारी अध्ययन

  1. pbs में दवा जारी अध्ययन बाहर ले । क्रमश: ७.४, ६.८ और ५.० के लिए तीन pbs बफ़र्स के पीएच मान समायोजित करें ।
  2. उचित पीएच pbs बफर के १८० μl में kyf-पीटी-पूर्वोत्तर के 5 μl पतला, ३.५ केडीए mwco मिनी डायलिसिस कप के लिए स्थानांतरण और pbs में ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
  3. 2, 4, 6, 24, ४८, और १४० एच पर प्रत्येक तीन मिनी डायलिसिस ट्यूबों से बफर निकालें, और आस द्वारा प्लेटिनम सांद्रता उपाय । 2.2.8 कदम के अनुसार सभी नमूनों को तैयार है, लेकिन ५०० μl करने के लिए नमूना की अंतिम मात्रा को समायोजित ।

5. सेल संस्कृति के तरीके

  1. संस्कृति सेल लाइंस A2780, CP70, skov-3, OV-९०, tov-21g, ES-2 सेल संस्कृति माध्यम में (dmem) 10% के साथ पूरक (A2780, CP70, skov-3, ES-2) या के साथ 15% (tov-21g, OV-९०) भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs), एल के साथ glutamine और penicillin/स्ट्रेप्टोमाइसिन । एक 5% CO2में सभी कोशिकाओं को बढ़ाएं, ३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी संतृप्त वातावरण ।
  2. बीज 3 एक्स प्रत्येक ९६ में 105 कोशिकाओं-अच्छी तरह से थाली और पूर्व संस्कृति में विट्रो ऊष्मायन प्रयोगों के लिए रातोंरात । kyf-Pt-NE, cisplatin, और पानी में कारबोप्लैटिन समाधान तैयार करें । प्रत्येक कोशिका रेखा के लिए कार्बोप्लैटिन और सिस्प्लेटिन की एकाग्रता से मेल करने के लिए kyf-pt-NE में पीटी (द्वितीय) की एकाग्रता को समायोजित करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर ७२ घंटे के लिए सेते ।
  3. ऊष्मायन के बाद, सेलुलर व्यवहार्यता का मूल्यांकन एक वर्णमिति परख (mtt सेल प्रसार परख) का उपयोग कर । संक्षेप में, मध्यम निकालें और मध्यम में 10% mtt के ११० μl को एक अच्छी तरह से जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए सेते करें । फिर एक अच्छी तरह से १०० μl डिटर्जेंट जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 एच के लिए सेते हैं ।
  4. थाली रीडर का उपयोग करके ५७० एनएम पर absorbance की जांच करें । Z-परीक्षण और P-परीक्षण के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण करें ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार kyf-Pt-NE के प्रतिनिधि उनि छवि चित्रा 2aमें दिखाया गया है । kyf-Pt-NEs morphology में गोलाकार, अच्छी तरह से बिखरे हुए हैं, और आकार में वर्दी । kyf के कोर व्यास-Pt-NEs, २०० माप किया की एक ंयूनतम के साथ तीन उनि छवियों से सीधे मापा, १०७ ± 27 एनएम है । kyf-Pt-NE के द्रवगतिक व्यास, गतिशील प्रकाश स्पेक्ट्रोस्कोपी (dls) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया, ०.१५६ के एक polydispersity सूचकांक के साथ २४० एनएम होना पाया गया । kyf की जीटा क्षमता-पीटी-पूर्वोत्तर पानी में-६०.१ एमवी के औसत मूल्य के साथ तीन स्वतंत्र syntheses के लिए निर्धारित किया गया था । संभावित के उच्च परिमाण के निर्माण के अच्छे कोलाइडयन स्थिरता इंगित करता है, और नकारात्मक सतह प्रभारी आयनित सीओओ- ओलिक एसिड की सतह समूहों के लिए जिंमेदार ठहराया है । kyf के समविभव बिंदु ८.५९ है, और इसलिए यह सकारात्मक तटस्थ पीएच पर आरोप लगाया है ।

सेलुलर झिल्ली को पार करने के लिए नैनोइमल् स की क्षमता को प्रतिदीप्ति के रूप में लेबल किए गए fitc-kyf-पॉइंट-NE और डिम्बग्रंथि कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके जांचा गया था । परिणाम चित्रा 2bमें प्रस्तुत कर रहे हैं । यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है कि fitc-kyf-Pt-NEs (हरी) साइटोसोल के भीतर वितरित कर रहे हैं लेकिन अभी तक lysosomes (लाल) के साथ जुड़े नहीं थे. यह परिणाम दर्शाता है कि kyf-Pt-NEs कोशिकाओं में प्रवेश और intracellular दवा वितरण वाहन के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

kyf की स्थिरता-पीटी-nes और fitc-kyf-पीटी-एनईएस dls के साथ मूल्यांकन किया गया था । पानी में nanoemulsions के व्यास कई महीनों में मापा गया था और परिणाम चित्रा 3में प्रस्तुत कर रहे हैं । दोनों योगों के द्रवगतिक व्यास धीरे भंडारण में 4 महीने के दौरान वृद्धि हुई, ३२० एनएम (kyf-pt-ne) और २४० एनएम (fitc-kyf-पीटी-ne), लेकिन नेनो आयामों संरक्षित थे । इस परिणाम से पता चलता है कि kyf tripeptide प्रभावी रूप से समय की लंबी अवधि में nanoemulsions स्थिर ।

पीटी (द्वितीय) encapsulation दक्षता और नैनोपायस से रिहाई आस के साथ मापा गया । पीटी (II) kyf-pt-NE में एकाग्रता 10 wt.% होने के लिए स्थापित किया गया था । पीटी (द्वितीय) kyf से रिलीज-पीएच ७.४ (शारीरिक), ६.८ (ट्यूमर के interstitium)४९, और ५.० (endosomal)५० में NE चित्रा 4aमें प्रस्तुत किया है । पीटी (द्वितीय) रिलीज पीटी के केवल २०.८% के साथ ७.४ पीएच में सबसे धीमी है (द्वितीय) 4 एच के बाद जारी की, जबकि पीएच ६.८ और ५.० पर जारी ३२.८% की और ४७.५%, क्रमशः था । यही ट्रेंड 24 एच के बाद और 6 दिन बाद भी जारी रहा । यह परिणाम इंगित करता है कि पीटी (द्वितीय) kyf से रिलीज-पीटी-पूर्वोत्तर पीएच निर्भर है, और यह प्रणालीगत परिसंचरण में देरी हो सकती है, और एक बार त्वरित nanoemulsions ट्यूमर में translocate ।

kyf-Pt-NE की जैविक गतिविधि इमेजिंग अध्ययन के रूप में एक ही डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों का उपयोग कर विट्रो में स्थापित किया गया था । कोशिकाओं kyf के साथ-पीटी-ne ७२ एच के लिए, kyf-पीटी-पूर्वोत्तर सांद्रता में प्रत्येक सेल लाइन के लिए आईसी५० के लिए इसी के साथ incubated थे । व्यवहार्यता mtt परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था और परिणाम केवल कोशिकाओं की तुलना में थे, kyf-NE, ओलिक एसिड-पीटी (द्वितीय) संयुग्मी, carboplatin, और cisplatin । kyf-Pt-NE की जैविक गतिविधि के परिणाम चित्रा 4bमें दिखाए गए हैं । kyf-पीटी-NE ४४.३% और ४६.२% द्वारा क्रमशः समजीनी सेल लाइनों A2780 (पीटी संवेदनशील) और CP70 (पीटी प्रतिरोधी) की व्यवहार्यता कम । कारबोप्लैटिन, नैदानिक रूप से प्रासंगिक एनालॉग, १८.५% (A2780) और ९.६% (CP70) द्वारा व्यवहार्यता की कमी हुई । सेल मृत्यु पर अधिक से अधिक kyf-Pt-NE प्रभाव की एक ही प्रवृत्ति के रूप में अच्छी तरह से अंय सेल लाइनों में मनाया गया । पीटी की व्यवहार्यता (द्वितीय) संवेदनशील tov-21g कोशिकाओं kyf-Pt-NE के साथ ऊष्मायन के बाद ५५.९% से कम हो गया था, जबकि कारबोलैटिन सिर्फ १६.५% द्वारा व्यवहार्यता कम करने के परिणामस्वरूप । OV-९० में मध्यवर्ती पीटी (द्वितीय) प्रतिरोध के साथ कोशिकाओं, व्यवहार्यता ५५.३% (kyf-Pt-NE) और २३.९% (carboplatin) द्वारा कम किया गया था । दो प्रतिरोधी कैंसर सेल लाइनों, ES-2 और skov-3, ४५.९% और ५४.३% द्वारा व्यवहार्यता में कमी दिखाई, क्रमशः, kyf के लिए-Pt-NE, और १०.३% (ES-2) और १६.८% (skov-3) carboplatin के लिए ।

kyf-Pt-NE बनाम सिस्प्लेटिन की जैविक गतिविधि भी तुलना की गई थी । cisplatin पीटी (द्वितीय) आधारित पहली पीढ़ी के एजेंट है कि अब अपनी विषाक्तता प्रोफ़ाइल५१के कारण क्लिनिक में इष्ट है । दो सेल लाइनों में, skov-3 और tov-21g, व्यवहार्यता में कमी 15% और ४०% से अधिक था, क्रमशः, kyf के लिए-पीटी-NE cisplatin के लिए की तुलना में । शेष सेल लाइनों में, kyf-Pt-NE की गतिविधि सिस्प्लेटिन (A2780, CP70, OV-९०), या थोड़ा कम (ES-2) के लिए तुलनीय था । ओलिक एसिड-पीटी (द्वितीय) संयुग्मी भी जैविक रूप से सक्रिय पाया गया । हालांकि, kyf-pt-NE परीक्षण सेल लाइनों के बहुमत में संयुग्मी से व्यवहार्यता में उच्च कमी से पता चला, पीटी में nanoformulation के महत्व का संकेत (द्वितीय) गतिविधि ।

नैनोप्पोलेट सिस्टम के जैविक अनुप्रयोगों जैविक रूप से प्रासंगिक मीडिया में स्थिरता की आवश्यकता होती है, इस प्रकार kyf की स्थिरता-पीटी-पूर्वोत्तर 20% भ्रूण गोजातीय सीरम में मूल्यांकन किया गया था (fbs) और परिणाम चित्रा 4cमें प्रस्तुत कर रहे हैं । हम की कोई सबूत नहीं का पता चला kyf-पीटी-NE ऑप्सोनाइजेशन सीरम में ऊष्मायन के एक दिन के बाद ।

Figure 1
चित्रा 1. nanoemulsions (ऊपर) और नैनोपायस तैयारी के योजनाबद्ध घटकों (नीचे) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2. के. एम. की छवि kyf-pt-ne (क) और संनाभि की छवियों को fitc-kyf-पीटी-पूर्वोत्तर (हरी) के ऊपर डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं (नाकाइ नीले हैं और lysosomes लाल कर रहे हैं) (ख) । स्केल पट्टियां 10 μm हैं । यह आंकड़ा बायोकांजुगेट केमिस्ट्री २०१८, 29, 2514-2519 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है । ४६ कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3. kyf की स्थिरता-पीटी-ne और fitc-kyf-पीटी-ne पानी में । प्रत्येक बिंदु N = 3 और p < ०.००५ के माध्य और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करताहै । यह आंकड़ा बायोकांजुगेट केमिस्ट्री २०१८, 29, 2514-2519 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है । ४६ कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4. kyf-पीटी-पूर्वोत्तर स्थिरता और जैविक गतिविधि । (एक) पीटी (द्वितीय) kyf से रिलीज-pbs बफर में पीटी-NE अलग phs (pbs, ३७ ° c) पर । kyf-Pt-NE (B) के साथ ७२ h ऊष्मायन के बाद विभिन्न डिम्बग्रंथि कैंसर सेल लाइनों की सेलुलर व्यवहार्यता. प्रत्येक स्तंभ माध्य और N = 3 और p <०.००५ के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है । सांद्रता प्रत्येक सेल लाइन में स्थिर रहे हैं और इस प्रकार हैं: ४.९२ मिमी (A2780), ८.८० मिमी (CP70), २.४६ मिमी (tov-21g), ९.८४ मिमी (SKOV3), ७.३८ मिमी (ES-2), १९.७ मिमी (OV-९०). kyf की एकाग्रता-पीटी-NE और ओलिक एसिड-पीटी (द्वितीय) संयुग्मी पीटी के संबंध में समायोजित किया गया था (द्वितीय) सामग्री आस द्वारा मापा । संक्षिप्त रूप: "carbpt"-कारबोप्लैटिन; "kyf-पूर्वोत्तर"-kyf tripeptide-लेपित नैनोपायस; "kyf-पीटी-पूर्वोत्तर"-kyf tripeptide-लेपित नैनोपायस युक्त पीटी (द्वितीय); cispt – cisplatin; पीटी-ओलिक-ओलिक एसिड-पीटी (द्वितीय) संयुग्मी । (C) kyf-Pt-NE स्थिरता सीरम में । यह आंकड़ा बायोकांजुगेट केमिस्ट्री २०१८, 29, 2514-2519 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है । ४६ कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

nanoemulsion संश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम substrates के मोलर अनुपात को समायोजित करने, ओलिक एसिड के दौरान तापमान और प्रवाह दर नियंत्रण को बनाए रखने-पीटी (द्वितीय) इसके अलावा, आत्म विधानसभा के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने, और एक का उपयोग कर उत्पाद शुद्ध केन्द्रापसारक सांद्रक कॉलम । ये पैरामीटर kyf-Pt-NE के आकार और आकृति विज्ञान को प्रभावित करते हैं; इस प्रकार, यह उचित मोलर अनुपात को बनाए रखने और सिंथेटिक शर्तों को सही ढंग से समायोजित करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है ।

नैनोइमल्शन संश्लेषण (चरण 3) के दौरान सबस्ट्रेट्स का अनुपात स्वयं-असेंबली प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है और उत्पाद के अंतिम आकार को निर्धारित करता है । kyf ओलिक एसिड के लिए-पीटी (द्वितीय) दाढ़ अनुपात 1:3 है, और पानी में kyf tripede की इष्टतम एकाग्रता है ०.२ मिमी । इसके अलावा, कार्बनिक विलायक ओलिक एसिड को भंग करने के लिए इस्तेमाल किया-पीटी (द्वितीय) चरण ३.१ में संयुग्मी पानी, निस्पंदन प्रणाली के साथ संगत है, और कमरे के तापमान पर आसानी से वाष्पनिक के साथ मिश्रणीय हो गया है ।

महत्वपूर्ण चरणों में से एक है बिंदुश: ओलिक एसिड के अलावा-पीटी (द्वितीय) kyf समाधान के लिए संयुग्मी (चरण ३.४) । प्रवाह की तुलना में धीमी नहीं होना चाहिए ०.१ मिलीलीटर/न्यूनतम और ०.२ मिलीलीटर से अधिक तेजी से नहीं, क्योंकि एक उप इष्टतम गति नैनोपायस की वर्षा को प्रेरित कर सकते हैं । इसके अलावा, ओलिक एसिड-पीटी (द्वितीय) संयुग्मी ३७ डिग्री सेल्सियस पर kyf समाधान में जोड़ा जाना चाहिए, जबकि ६०० rpm पर एक हलचल थाली पर मिश्रण सरगर्मी । एक बार ओलिक एसिड-पीटी (द्वितीय) के सभी जोड़ा गया है, समाधान कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए और सरगर्मी गति १५० rpm को कम । चरण ३.५ कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए । kyf-Pt-NE (चरण ३.५) की स्वयं-असेंबली के लिए इष्टतम समय 24 घंटे है ।

वहाँ एक जोखिम है कि उत्पाद वेग हो सकता है, जबकि nanoemulsion पूर्व केंद्रित किया जा रहा है. इसलिए, यह सिफारिश की है कि नैनोपायस अतिरिक्त पानी के साथ एक केन्द्रापसारक संकेंद्रक में centrifuged किया जा रहा से पहले पतला और २,४६५ एक्स जीसे कोई तेजी से घूमती है । पतला nanoemulsions स्पिन के बीच aliquots पर केन्द्रापसारक सांद्रित्र में जोड़ा जाना चाहिए, और nanoemulsion फिल्टर में मिलाया जाना चाहिए इससे पहले कि अगले भाग जोड़ा जाता है ।

फैटी एसिड के अलावा अंय डेरिवेटिव के साथ nanoemulsions फार्म करने की क्षमता ओलिक एसिड का परीक्षण नहीं किया गया है और अभी तक निर्धारित किया जाना है । भविष्य के अनुप्रयोगों के विभिंन पेप्टाइड्स का उपयोग करने के लिए ओलिक एसिड के साथ सह विधानसभा की सुविधा शामिल हो सकते हैं । इसके अलावा, गैर-प्लैटिनम आधारित दवाओं के साथ ओलिक एसिड संयुग्मों को नैनोमल्शन के संभावित कोर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों के टकराव का खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

हम आभार राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, अनुदान SC2CA206194 से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

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एक tripeptide-oleic एसिड के स्थिर नैनोपायस
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Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

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