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Bioengineering

Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Ce protocole décrit une méthode efficace pour synthétiser une nanoémulsion d’un conjugué de la teneur en acide oléique acids-platinum(II) stabilisé avec un tripeptide lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF). Les formes nanoémulsion dans des conditions douces synthétiques par auto-assemblage de la KYF et le conjugué.

Abstract

Les auteurs décrivent une méthode pour produire une nanoémulsion composée d’un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique et d’un revêtement (KYF) de lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF-Pt-NE). La KYF-Pt-NE encapsule pt (ii) à 10 % m/m, a un diamètre de 107 ± 27 nm et une charge négative de la surface. La KYF-Pt-NE est stable dans l’eau et dans le sérum et est biologiquement active. La conjugaison d’un fluorophore à KYF permet la synthèse d’une nanoémulsion fluorescente qui convient pour l’imagerie biologique. La synthèse de la nanoémulsion s’effectue dans un environnement aqueux et les formes de KYF-Pt-NE par auto-assemblage d’un peptide KYF court et un conjugué de acids-platinum(II) en acide oléique. Le processus d’auto-assemblage dépend de la température de la solution, le rapport molaire des substrats et la vitesse d’écoulement de l’addition du substrat. Étapes cruciales incluent maintenant le taux d’agitation optimal pendant la synthèse, permettant un délai suffisant pour l’auto-assemblage et pré concentre la nanoémulsion progressivement dans un concentrateur centrifuge.

Introduction

Ces dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour l’ingénierie des nanoparticules pour des applications biomédicales comme medicaments et bioimaging1,2,3,4. La multifonctionnalité des systèmes à base de nanoparticules nécessite souvent incorporant plusieurs composants dans une formulation. Les blocs de construction qui reposent souvent sur des lipides ou des polymères se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques ainsi que leur biocompatibilité et biodégradabilité, qui finalement pourrait affecter la fonction de la nanostructure1, 5,6. Des matériaux biologiques, tels que des protéines et des peptides, ont longtemps été reconnus comme éléments prometteurs de nanostructures multifonctionnel en raison de leur séquence flexibilité7,8. Peptides s’auto-assembler en ordonnées architectures supramoléculaires formant hélicoïdale rubans9,10, échafaudages fibreuse11,12et bien d’autres encore, ouvrant ainsi la voie au renforcement des nanostructures hybrides axée sur la biomolécule utilisant un ascendant approche13.

Peptides ont été explorées pour des applications en médecine et en biotechnologie, en particulier pour la thérapie anticancéreuse14 et maladies cardiovasculaires15 aussi bien en ce qui concerne les antibiotiques développement16,17, métabolique troubles18et les infections19. Il y a plus d’une centaine de petit-peptide thérapeutique, l’objet d’essais cliniques20. Les peptides sont faciles à modifier et rapide à synthétiser à petit prix. En outre, ils sont biodégradables, ce qui facilite grandement leur applications biologiques et pharmaceutiques21,22. L’utilisation de peptides comme éléments structuraux comprend l’ingénierie des nanoparticules peptidique, rompus et des dépôts d’hydrogel pour Liberation controlee23,24,25,26 , 27, biocapteurs à base de peptides28,29,30,31ou des dispositifs bio-électroniques32,33,34. Ce qui est important, même petits peptides avec deux ou trois résidus d’acide aminé qui incluent la phénylalanine trouvées pour guider l’auto-assemblage traite35,36,37 et créer des émulsions stabilisées38 .

Médicaments à base de platine, en raison de leur grande efficacité, sont utilisés dans de nombreux régimes de traitement du cancer, aussi bien seul ou en combinaison avec d’autres agents39,40. Composés de platine induisent des lésions de l’ADN en formant des liaisons transversales des monotypes et système ou interstrand. Les lésions de l’ADN-Pt sont reconnues par la machinerie cellulaire et, si ne pas réparés, conduisent à l’apoptose cellulaire. Le plus important mécanisme, par lequel pt (ii) contribue à la mort des cellules cancéreuses, est l’inhibition de l’ADN transcription41,,42. Toutefois, les avantages de la thérapie de platine sont diminués par une toxicité systémique du PT (ii) qui déclenche des effets secondaires graves. Ceci mène à plus faible dosage clinique de PT (ii)43, qui aboutit souvent à des concentrations sous thérapeutiques du platine pour atteindre l’ADN. En conséquence, la réparation de l’ADN qui suit contribue à la survie des cellules du cancer et l’acquisition de résistance pt (ii). La chimio-résistance de platine est un problème majeur dans la thérapie anticancéreuse et la principale cause d’échec de traitement44,45.

Nous avons développé une conception stable qui encapsule l’agent pt (ii) afin de fournir un effet protecteur dans la circulation systémique et pour diminuer les effets secondaires induits par Pt II. Le système est basé sur un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique stabilisé avec un tripeptide KYF pour former une nanoémulsion (KYF-Pt-NE)46. Les éléments constitutifs de la KYF-Pt-NE, les acides aminés de tripeptide ainsi que l’acide oléique, ont le statut de Generally Recognized As Safe (GRAS) avec la Food and Drug Administration (FDA). La KYF-Pt-N’est préparé à l’aide d’une méthode de nanoprécipitation47. En bref, le conjugué de acids-Pt(II) en acide oléique est dissous dans un solvant organique et ensuite ajouté goutte à goutte d’une solution aqueuse de KYF (Figure 1) à 37 ° C. La solution est agitée pendant plusieurs heures pour permettre à l’auto-assemblage de la la KYF-Pt-NE. La nanoémulsion est concentrée dans 10 kDa centrifuge concentrateurs et laver trois fois avec de l’eau. La modification chimique de la KYF avec un fluorophore permet la synthèse de fluorescent FITC-KYF-Pt-NE convient d’imagerie biomédicale.

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Protocol

1. synthèse de la teneur en acide oléique Acids–Platinum(II) conjugué

  1. Activation du cisplatine
    1. Suspendre 50 mg (0,167 mmol) de cisplatine dans 4 mL d’eau (p. ex., nanopure) à 60 ° C.
    2. Ajouter goutte à goutte 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 dans 0,5 mL d’eau à la solution de cisplatine et de remuer la réaction pendant au moins 2 h à 60 ° C. Le précipité blanc de AgCl formera indiquant l’état d’avancement de la réaction.
    3. Pour déterminer si la réaction d’activation est terminée, effectuez le test avec 10 % HCl pour la présence d’ions Ag+ libres en solution. Le critère devrait être négatif (aucun précipité d’AgCl supplémentaire ne devrait former).
    4. Centrifuger le mélange réactionnel à 3 220 x g pendant 10 min et enlever le précipité blanc de AgCl.
    5. Récupérer le surnageant et filtrez-le via un filtre de seringue 0,2 mm. Tester le surnageant pour la présence de platine en appliquant 2 à 3 gouttes de la solution par l’intermédiaire de pipette Pasteur à SnCl2 cristaux. Le test est positif si la couleur du complexe coordonnée d’étain avec platinum jaune/orange foncé.
    6. Utiliser le liquide surnageant avec PT (ii) activés pour la deuxième étape.
  2. Réaction de l’acide oléique avec activés pt (ii)
    1. Suspendre 94,2 mg d’acide oléique (0.333 mmol) dans 3 mL d’eau à 60 ° C.
    2. Ajouter 13,3 mg (0.333 mmol) de NaOH dans 1 mL d’eau et mélanger avec la solution d’activés pt (ii) de l’étape 1.1
    3. Remuer la réaction pendant 2 h à 60 ° C et ensuite à température ambiante pendant la nuit. Le produit brut est un précipité brun/jaune huileux.
    4. Centrifuger le mélange réactionnel à 3 220 x g pendant 10 min et enlever le surnageant. Sécher le produit brut à 25 ° C à l’aide d’un évaporateur rotatif. Purifier le produit par plusieurs lavages avec de l’acétonitrile. La couleur finale de acids–Pt(II) en acide oléique pure conjugué est jaune pâle.

2. synthèse de la KYF-Pt-NE et le FITC marqués Nanoémulsion FITC-KYF-Pt-NE

  1. Synthèse du tripeptide KYF et le tripeptide fluorescent étiqueté FITC-KYF
    1. Synthétiser la KYF en utilisant la chimie des peptides à semi-conducteurs standard. Utiliser la norme suivante conditions de couplage pour fixer chaque acide aminé : Wang résine (2,19 mmol), d’acides aminés Fmoc protégé (4.38 mmol), tétrafluoroborate de 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (TBTU) (4.38 mmol) et diisopropyléthylamine (DIPEA) (8,76 mmol). Dissoudre les acides aminés avec TBTU dans le diméthylformamide (DMF) et DIPEA.
    2. Faire tremper de 5,7 g de résine d’alcool Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl (0,382 meq/g) dans 25 mL de DMF pour 1 h avant son utilisation.
    3. Déprotéger le groupe amine de l’acide aminé L-phénylalanine avec 15 mL de solution de pipéridine/DMF de 20 % pendant 5 min, jeter le solvant et répéter le lavage avec cycle de 20 min.
    4. Laver la résine pendant 1 min avec les solvants suivants : DMF, alcool isopropylique (IPA), IPA, DMF, IPA, DMF, DMF, DMF. Éliminer le solvant après chaque lavage.
    5. Effectuer le test de Kaiser pour déterminer la présence du groupe de2 NH gratuit sur la résine (voir sous-étapes) et si positif (la graine de résine est violette), ajouter de l’acide aminé Fmoc-L-tyrosine et effectuer l’accouplement pendant la nuit.
      1. Préparer les solutions de test dans des flacons séparés Kaiser.
      2. Dissoudre 5 g de ninhydrine dans 100 mL d’éthanol.
      3. Dissoudre les 80 g de phénol dans 20 mL d’éthanol.
      4. Mélanger 2 mL de solution aqueuse de 0,001 M de cyanure de potassium avec
        98 mL de pyridine.
      5. Ajouter 2-3 gouttes de chaque Kaiser tester des solutions d’échantillon et de la chaleur dans l’eau bouillante pendant 5 min.
    6. Sur le couplage réussi du second acide aminé, effectuer le test de Kaiser et si négatif procéder avec protocole de déprotection (étapes 2.1.3 à 2.1.5). Répétez le processus avec l’acide aminé phénylalanine-Fmoc.
      1. Sur le couplage de tous les acides aminés, laver la résine pendant 1 min avec 5 mL de DMF, IPA, DMF, méthanol, dichlorométhane et l’éther diéthylique, après chaque lavage jeter le solvant. Économiser la résine pour un traitement ultérieur.
      2. Utiliser la moitié de la résine pour les prochaines étapes (2.1.7-2.1.9) pour modifier le peptide avec FITC. Pour obtenir la non modifiés KYF tripeptide, suivez la procédure à partir de 2.1.10.
    7. Modifier l’acide aminé N-terminal de la KYF KYF-N3 avec de l’acide 6-azidohexanoic. À cette fin, mélanger 1 g (0,382 mmol) de résine KYF Wang et 120,1 mg (0.764 mmol) de l’acide 6-azidohexanoic avec 245,2 mg (0.764 mmol) de TBTU et 197,1 mg (1.528 mmol) de DIPEA dans 30 mL de DMF. Remuer la réaction du jour au lendemain à la température ambiante.
    8. Obtenir la KYF-FITC de la synthèse de la KYF-N3 à la fluorescéine propargylique via une réaction de clic. À cette fin, se mêlent 253 mg (0,097 mmol) de la KYF-N3 Wang résine 3,78 mg (0,019 mmol) de CuI solide, 71,9 mg (0,193 mmol) de fluorescéine propargylique et 2,24 mg (0.017 mmol) de DIPEA. La réaction doit changer de couleur du vert au brun.
    9. Après 24h, laver trois fois la résine pendant 1 min en alternant avec 5 mL de DMF et IPA cinq fois, le méthanol et l’eau trois fois, DMF et l’eau trois fois et avec le dichlorométhane et éther diéthylique. Éliminer le solvant après chaque lavage.
    10. Fendre la KYF-FITC ou peptide KYF de la résine avec une solution d’acide trifluoroacétique (TFA) / triisopropylsilane (conseils) / h2O le rapport de 95/2.5/2.5 plus de 3 heures.
    11. Précipiter le peptide brut dans un froid l’éther diéthylique, laver trois fois avec de l’éther froid et sec puis sous le vide.
  2. Synthèse de nanoémulsion FITC-KYF-stabilisé avec PT (ii) (FITC-KYF-Pt-NE) et KYF-Pt-NE
    1. Dissoudre 10 mg (0.0126 mmol) de acids–Pt(II) en acide oléique conjugué dans 1,5 mL d’isopropanol et place dans une seringue de 5 mL.
    2. Placer la seringue avec la teneur en acide oléique acids–Pt(II) conjugué dans un pousse-seringue et régler le débit à 0,1 mL/min.
    3. Pour synthétiser le FITC-KYF-Pt-NE, dissoudre 1 mg (0.00105 mmol) de FITC-KYF et 1 mg (0.00219 mmol) de KYF (rapport molaire de 1:2 de FITC-KYF:KYF) dans 20 mL d’eau et régler la température de la solution à 37 ° C. Couvrir les parois du récipient avec du papier aluminium pour éviter le Photoblanchiment du fluorophore FITC. Pour synthétiser la KYF-Pt-NE, dissoudre 2 mg (0,0044 mmol) de tripeptide KYF dans 20 mL d’eau et régler la température de la solution à 37 ° C.
    4. Ajouter le conjugué de la teneur en acide oléique acids–Pt(II) goutte à la solution du tripeptide FITC-KYF/KYF ou KYF. Effectuez cette étape sous le capot.
    5. Agiter la solution du jour au lendemain à la température ambiante pour évaporer les solvants organiques et permettre l’auto-assemblage de FITC-KYF-Pt-NE ou KYF-Pt-né
    6. Concentrer le FITC-KYF-Pt-NE ou KYF-Pt-NE dans un concentrateur centrifuge (10k MWCO) et se laver trois fois avec 4 mL de l’eau nanopure.
    7. Stocker les solutions aqueuses de KYF-Pt-NE et FITC-KYF-Pt-NE à 4 ° C.
    8. Analyser pour platine contenu à l’aide de la spectroscopie d’absorption atomique (AAS), suivant guide48 les directives du fabricant.
      1. Élaborer des normes platine dans HCl 10 % pour la courbe d’étalonnage (efficace pour AAS se situe entre 100 à 1 200 ppb (parties par milliard)).
      2. Dissoudre 50 µL de solution de KYF-Pt-NE d’étape 2.2 dans 100 µL d’eau régale (mélange 3:1 d’acide chlorhydrique concentré et acide nitrique) et laisser à température ambiante une nuit. Ajouter 850 µL d’eau pour atteindre un volume d’échantillon final de 1 mL. Analyser l’échantillon à l’aide d’AAS. La concentration en acide finale devrait être de 10 % dans tous les échantillons analysés.
      3. Enregistrer la lecture de la concentration de Pt en ppb et calculer le contenu final de platine dans l’échantillon (compte de la dilution de l’échantillon et le volume initial de nanoémulsion).

3. confocal imagerie de l’assimilation de la FITC-KYF-Pt-NE

  1. 6 lignées cellulaires de cancer de l’ovaire (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G et ES2), des graines en 4 plats confocal de puits-chambre à la densité de 4. 7 x 104 cellules par chambre et la culture avance une nuit à 37 ° C.
  2. Après 24h, laver les cellules trois fois avec une solution saline du tampon phosphate (PBS) et incuber avec FITC-KYF-Pt-NE dans un milieu de culture cellulaire (voir étape 6.1 pour cellule ligne détails spécifiques) pendant 15 min à 37 ° C.
  3. Après incubation, retirez le support et laver les cellules trois fois avec du PBS.
  4. Fixer les cellules avec du méthanol froid pendant 5 min à-20 ° C et laver trois fois avec 1 mL de PBS.
  5. Permeabilize les cellules avec 1 mL de 0.1 % Triton-X pendant 10 min à température ambiante et de la laver trois fois avec 1 mL de PBS.
  6. Incuber les cellules pendant 90 min avec LAMP1 anticorps conjugué avec Alexa Fluor 647 (1 mL) à 01:50 dilution dans du PBS à température ambiante. Ensuite, laver les cellules 3 fois avec du PBS.
  7. Diluer la solution mère de DAPI (1 mg/mL) à 1 mg/mL dans du PBS. Ensuite, ajouter 1 mL de la solution diluée dans chaque chambre et incuber pendant 15 min à température ambiante. Laver les cellules 3 fois avec du PBS.
  8. Monter les lamelles couvre-objet sur une diapositive à l’aide du milieu de montage.
  9. Image des cellules à l’aide de microscope confocal de cellules vivantes à excitation longueur d’onde de 405 nm, 488 nm et 633 nm. Définissez les paramètres de détection comme suit : Gain de puissance de laser de 0,2 % et pas plus de 1 %, unité 1 de Pinole aérée, maître offset numérique de 650-750, 0.
  10. Ouvrir une image dans le logiciel d’imagerie. Sous image affichée, sélectionnez le graphique et sélectionnez Insert barre d’échelle, d’insérer de la barre d’échelle à l’image.

4. études de libération de médicaments

  1. Effectuer les études de libération de médicaments dans du PBS. Ajustez les valeurs de pH de trois tampons de PBS à 7,4, 6.8 et 5.0 respectivement.
  2. Diluer 5 μL de KYF-Pt-NE dans le 180 μL de tampon PBS pH approprié, transfert à 3,5 Coupe du mini dialyse MWCO kDa et incuber à 37 ° C dans du PBS.
  3. Retirer le tampon de chaque trois tubes dialyse mini à 2, 4, 6, 24, 48 et 140 h et de mesurer les concentrations de platine par AAS. Préparer tous les échantillons selon étape 2.2.8 mais ajuster le volume final de l’échantillon à 500 µL.

5. méthodes de Culture cellulaire

  1. Les lignées de culture cellulaires A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 dans le milieu de culture cellulaire (DMEM) complété avec 10 % (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) ou 15 % (TOV - 21G, OV-90) sérum fœtal (SVF), avec la L-Glutamine et la pénicilline/streptomycine. Faites pousser toutes les cellules dans un 5 % de CO2, atmosphère saturée d’eau à 37 ° C.
  2. Graines de 3 x 105 cellules dans chaque plaque à 96 puits et de la culture avant toute la nuit pour des expériences d’incubation in vitro. Préparer les solutions de carboplatine, cisplatine et KYF-Pt-NE dans l’eau. Ajuster la concentration de PT (ii) en KYF-Pt-NE pour correspondre à la concentration de carboplatine et cisplatine pour chaque lignée cellulaire. Incuber pendant 72 heures à 37 ° C.
  3. Après incubation, évaluer la viabilité cellulaire par dosage colorimétrique (le test de prolifération cellulaire MTT). En bref, éliminer le milieu et ajouter 110 μL de 10 % MTT en moyenne à chaque puits et incuber pendant 2 h à 37 ° C. Puis ajouter un détergent 100 μl à chaque puits et incuber pendant 5 h à 37 ° C.
  4. Vérifier l’absorbance à 570 nm en utilisant le lecteur de plaques. Analyser les résultats en utilisant une analyse statistique avec le test Z et P-test.

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Representative Results

Image représentant TEM KYF-Pt-ne préparé à l’aide de ce protocole est montré dans la Figure 2 a. La KYF-Pt-NEs sont sphériques en morphologie, bien dispersée et de taille uniforme. Le diamètre du noyau de la KYF-Pt-NEs, mesurés directement à partir de trois images TEM avec un minimum de 200 mesures fait, est de 107 ± 27 nm. Le diamètre hydrodynamique des KYF-Pt-NE, analysée par spectroscopie lumineuse dynamique (DLS), s’est avéré pour être de 240 nm avec un indice de polydispersité de 0,156. Le potentiel zêta KYF-Pt-ne dans l’eau a été déterminé chez trois synthèses indépendants avec la valeur moyenne des-60.1 mV. La grande intensité du potentiel indique bonne stabilité colloïdale de la formulation et la charge négative de surface est attribuée à ionisée COO– surfaces groupes d’acides oléique. Le point isoélectrique de KYF est 8,59, et par conséquent, il est chargé positivement à un pH neutre.

La capacité des NANOÉMULSIONS de traverser la membrane cellulaire a été étudiée à l’aide de lignées cellulaires fluorescent étiquetés cancer FITC-KYF-Pt-NE et de l’ovaire. Les résultats sont présentés dans la Figure 2 b. Il peut être clairement vu que la FITC-KYF-Pt-NEs (vert) sont distribuée dans le cytosol mais n’ont pas encore été associée lysosomes (rouge). Ce résultat montre que KYF-Pt-NEs entrer dans les cellules et peuvent servir de véhicule de livraison de drogue intracellulaire.

La stabilité de KYF-Pt-NEs et FITC-KYF-Pt-NEs a été évaluée avec DLS. Le diamètre des nanoemulsions dans l’eau a été mesuré pendant plusieurs mois et les résultats sont présentés à la Figure 3. Le diamètre hydrodynamique des deux formulations a augmenté lentement pendant 4 mois au stockage, à 320 nm (KYF-Pt-NE) et 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), mais les dimensions nanométriques ont été préservés. Ce résultat suggère que le tripeptide KYF stabilise efficacement nanoemulsions sur de longues périodes de temps.

L’efficacité d’encapsulation pt (ii) et la libération par la nanoémulsion ont été mesurés avec l’AAS. La concentration de PT (ii) dans KYF-Pt-NE a été créée pour être 10 wt.%. Le PT (ii) la libération de KYF-Pt-NE à un pH de 7,4 (physiologique), 6.8 (interstitium de la tumeur)49et 5.0 (endosomale)50 est présenté dans la Figure 4 a. La sortie de PT (ii) est la plus lente à pH 7,4 avec seulement 20,8 % de PT (ii), sorti après 4 h, alors qu’à un pH de 6.8 et 5.0 la libération était de 32,8 % et 47,5 %, respectivement. La même tendance s’est poursuivie après 24h et après 6 jours. Ce résultat indique que le PT (ii) un dégagement de KYF-Pt-NE est dépendante du pH, et il peut être retardée dans la circulation systémique et accélérée une fois que les nanoemulsions translocation dans la tumeur.

L’activité biologique de la KYF-Pt-NE a été établie in vitro en utilisant les mêmes lignées cellulaires de cancer de l’ovaire comme dans les études d’imagerie. Les cellules sont incubées avec KYF-Pt-NE pendant 72 h, à des concentrations de KYF-Pt-NE correspondant à IC50 pour chaque lignée cellulaire. La viabilité a été évaluée à l’aide de l’analyse de MTT et les résultats ont été comparés aux cellules seulement, KYF-NE, acids-Pt(II) en acide oléique conjugué, carboplatine et cisplatine. Les résultats de l’activité biologique de la KYF-Pt-NE sont indiquées dans la Figure 4 b. La KYF-Pt-NE réduit la viabilité des lignées isogéniques A2780 (Pt sensible) et CP70 (Pt résistant) de 44,3 % et 46,2 % respectivement. Carboplatine, l’analogue cliniquement pertinent, diminue la viabilité de 18,5 % (A2780) et 9,6 % (CP70) seulement. La même tendance de plus grande efficacité de KYF-Pt-NE sur la mort cellulaire a été observée à travers d’autres lignées de cellules aussi bien. La viabilité des cellules sensibles de TOV - 21G pt (ii) a été réduite de 55,9 % après incubation avec KYF-Pt-NE, carboplatine a donné lieu à la réduction de la viabilité de seulement 16,5 %. OV-90 cellules présentant une résistance intermédiaire pt (ii), la viabilité a été abaissée de 55,3 % (KYF-Pt-NE) et de 23,9 % (carboplatine). Les deux lignées cellulaires de cancer résistant, ES-2 et SKOV-3, a montré la réduction en viabilité de 45,9 % et à 54,3 %, respectivement, pour KYF-Pt-NE et de 10,3 % (ES-2) et de 16,8 % (SKOV-3) pour le carboplatine.

L’activité biologique de la KYF-Pt-NE versus cisplatine a été également comparée. Cisplatine est l’agent basé sur Pt II de première génération qui est n’est plus favorisée à la clinique en raison de son profil de toxicité51. Dans deux lignées cellulaires, SKOV-3 et TOV - 21G, la réduction de la viabilité a été supérieure de 15 % et 40 %, respectivement, pour KYF-Pt-NE que de cisplatine. Dans les autres lignées de cellules, l’activité de KYF-Pt-NE a été comparable au cisplatine (A2780, CP70, OV-90), ou légèrement plus bas (ES-2). Le conjugué de la teneur en acide oléique acids-Pt(II) s’est avéré aussi biologiquement actives. Cependant, KYF-Pt-NE montre plus grande réduction de viabilité que le conjugué dans la majorité des lignées cellulaires testées, ce qui indique l’importance de nanoformulation pt (ii) activité.

Les applications biologiques des systèmes nanoparticulaires ont besoin de stabilité dans les milieux pertinents sur le plan biologique, donc la stabilité de la KYF-Pt-NE a été évaluée chez 20 % sérum fœtal (SVF) et les résultats sont présentés dans la Figure 4. Nous avons ne décelé aucun signe d’opsonisation KYF-Pt-NE dans le sérum après un jour d’incubation.

Figure 1
Figure 1. Les composants de la nanoemulsions (en haut) et le schéma de la préparation de nanoémulsion (en bas). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Image TEM de KYF-Pt-NE (A) et d’images de microscope confocal de captation FITC-KYF-Pt-NE (vert) par les cellules de cancer de l’ovaire (noyaux sont bleus et les lysosomes sont rouges) (B). Barreaux de l’échelle est de 10 μm. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Chimie Bioconjugate 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Stabilité de la KYF-Pt-NE et FITC-KYF-Pt-NE dans l’eau. Chaque point représente la moyenne et l’écart type de N = 3 et p <0,005. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Chimie Bioconjugate 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Stabilité de KYF-Pt-NE et l’activité biologique. (A) PT (ii) la libération de KYF-Pt-NE dans le tampon PBS à différents pH (PBS, 37 ° C). Viabilité cellulaire de lignées cellulaires de cancer de l’ovaire différent après 72 h d’incubation avec KYF-Pt-NE (B). Chaque colonne représente la moyenne et l’écart type de N = 3 et p <0,005. Les concentrations sont constantes dans chaque lignée cellulaire et sont comme suit : 4,92 mM (A2780), 8,80 mM (CP70), 2,46 mM (TOV - 21G), 9,84 mM (SKOV3), 7,38 mM (ES-2), 19,7 mM (OV-90). La concentration de acids–Pt(II) KYF-Pt-NE et en acide oléique conjugué a été ajustée en ce qui concerne la teneur de PT (ii) mesurée par AAS. Abréviations : « Carbpt » – carboplatine ; « KYF-NE »-KYF nanoémulsion tripeptide-enduit ; « KYF-Pt-NE » – KYF tripeptide-enduit nanoémulsion contenant pt (ii) ; Sophiecapobianco – cisplatine ; PT-oléique – oléique acids–Pt(II) conjugué. (C) stabilité KYF-Pt-NE dans le sérum. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Chimie Bioconjugate 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Des étapes cruciales dans la synthèse de nanoémulsion incluent le rapport molaire des substrats de réglage, maintenir contrôle température et le débit de la fréquence pendant l’ajout de acids–Pt(II) en acide oléique, fournissant suffisamment de temps pour l’auto-assemblage et purifier le produit à l’aide une colonne de concentrateur centrifuge. Ces paramètres influent sur la taille et la morphologie de la KYF-Pt-NE ; ainsi, il est particulièrement important maintenir le bon rapport molaire et ajuster les conditions synthétiques correctement.

Le ratio des substrats durant la synthèse nanoémulsion (étape 3) est crucial pour le processus d’auto-assemblage et détermine la taille finale du produit. La KYF oléique acid-Pt(II) ratio molaire est de 1:3, et la concentration optimale de la tripepide KYF dans l’eau est de 0,2 mM. En outre, le solvant organique utilisé pour dissoudre le conjugué de la teneur en acide oléique acid-Pt(II) à l’étape 3.1 doit être miscible avec l’eau, compatible avec le système de filtration et par évaporation facilement à la température ambiante.

Une des étapes essentielles est l’ajout de goutte à goutte du acid-Pt(II) en acide oléique conjugué à la solution KYF (point 3.4). Le flux ne doit pas être plus lent que 0,1 mL/min et pas plus rapide que 0,2 mL/min, car une vitesse optimale peut provoquer la précipitation de la nanoémulsion. En outre, le conjugué de la teneur en acide oléique acids–Pt(II) devrait être ajouté à la solution KYF à 37 ° C en remuant le mélange sur une plaque de remuer à 600 tr/min. Une fois que tous les acid-Pt(II) en acide oléique a été ajouté, la solution doit être maintenue à la température ambiante et la vitesse d’agitation réduite à 150 tr/min. Étape 3.5 doit être réalisée à température ambiante. Le moment optimal pour l’auto-assemblage de la KYF-Pt-NE (étape 3.5) est de 24 heures.

Il y a un risque que le produit peut précipiter tandis que la nanoémulsion est concentrée avant. Par conséquent, il est recommandé que la nanoémulsion être diluée avec de l’eau supplémentaire devant être centrifugé dans un concentrateur centrifuge et filée pas plus vite que 2 465 x g. Les nanoemulsions diluées devrait figurer dans le concentrateur centrifuge à aliquotes entre les spins et la nanoémulsion doit être mélangée dans le filtre avant la partie suivante est ajoutée.

La capacité de NANOÉMULSIONS de forme avec les acides gras dérivés autres que l’acide oléique n’a pas été testée et est encore à déterminer. Futures applications peuvent inclure l’utilisation de peptides différents pour faciliter le montage co avec de l’acide oléique. En outre, acide oléique conjugués avec des médicaments non-à base de platine peuvent servir de noyaux potentiels de NANOÉMULSIONS.

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Disclosures

Auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons l’appui financier de l’Institut National du Cancer, grant SC2CA206194. Aucun intérêts financiers concurrents ne sont déclarés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

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Bio-ingénierie numéro 144 Nanoémulsion acide oléique tripeptide thérapie anticancéreuse imagerie biologique administration de médicaments
Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique
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Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., … More

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

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